KR101962044B1

KR101962044B1 - 효소 활성 검출용 가변색 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 암질환 진단방법

Info

Publication number: KR101962044B1
Application number: KR1020170179793A
Authority: KR
Inventors: 김환명
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2019-03-25

Abstract

본 발명은 효소 활성 검출용 가변색 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 암질환 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게 본 발명의 신규한 가변색 이광자 형광 프로브는 세포독성과 pH 영향 없이 살아있는 세포와 80-180 μm 깊이의 생체 조직 내부의 hNQO1 효소 활성에 선택적으로 감응하여 높은 감도로 형광색 변화를 나타낼 수 있으므로, 세포 또는 조직 내의 hNQO1 효소 활성 수준을 효과적으로 정량함으로써 암 질환을 진단할 수 있다.

Description

효소 활성 검출용 가변색 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 암질환 진단방법{Ratiometric two-photon fluorescent probes for enzyme activity and diagnosis method using the same}

본 발명은 암조직 내 효소 활성에 선택적으로 감응하는 가변색 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 암질환 진단방법에 관한 것이다.

산화환원 효소는 여러 생물학적 과정을 조절하는 기질의 환원 및 산화 반응을 촉매하는 물질로, 살아있는 시료 내 효소 활성은 질병 진단 및 이와 관련된 연구를 위해 촉망받는 타겟으로 보고되어졌다.

hNQO1 (human NAD(P)H:quinone oxidoreductase, EC 1.6.99.2)는 플라빈-아데닌 다이뉴클레오타이드(flavin adenine dinucleotide)가 포함하며, 다양한 퀴논 유도체를 하이드로퀴논으로 환원시키는 반응을 촉진시키는 효소로, 많은 연구 결과 hNQO1이 산화적 손상시 항산화 효과를 나타내어 대사 장애 및 암을 유발시키는 것으로 알려졌으며, 실제로 많은 연구결과에서 정상 조직과 비교하여 많은 암 조직에서 hNQO1가 높은 수준으로 관찰되었다. 그러나 이러한 연구결과들은 대부분 조직 균질화 후 조직 화학적 방법으로 수행된 것으로 암 조직 또는 암 세포에서 hNQO1 효소의 역할을 이해하기 위해서는 아직 많은 연구가 필요하다.

이러한 효소 활성을 연구하기 위한 방법으로 합성된 형광 프로브를 이용한 분자 이미징은 표적 종 또는 사건에 대한 정보를 그 위치(in situ)에서 제공할 수 있기 때문에, 살아있는 세포에서 hNQO1을 검출하기 위하여 작은 분자를 기반으로 하는 hNQO1-활성화 검출을 위한 형광 프로브에 대한 연구 및 개발이 진행되고 있다.

현재 개발된 형광 프로브는 플루오로세인(fluoroscein), 로다민(rhodamine) 또는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP) 등을 형광체로 사용하여 수많은 단일광자 형광 프로브가 개발되어 왔으나, 대부분의 단일광자 프로브의 공통적인 문제점은 그들의 짧은 여기 파장(<500 ㎚) 사용에 있다. 짧은 여기 파장은 얕은 투과 깊이(<100 ㎛), 광표백(photo bleaching) 및 세포 자가 형광 등의 문제를 야기함으로써 조직 이미징(imaging)에 대한 적용을 제한한다.

이러한 문제에 대한 해결책으로 제시된 것이 이광자 현미경(TPM)을 사용하는 방법으로, 이광자 현미경은 낮은 여기 에너지를 갖는 2개의 근적외선 광자들을 여기원으로 사용하기 때문에 단일광자 현미경에 비해서 여러 가지 장점들을 제공할 수 있는데, 구체적으로는 증가된 투과 깊이, 국소화된 여기 및 장시간 이미징 등의 장점을 가지고 있으나, 지금까지 개발된 이광자 프로브의 수는 10여개에 불과하며, 특히 살아있는 세포에서 hNQO1의 활성화를 이미징할 수 있는 이광자 프로브는 전무한 실정이다.

대한민국등록특허 제10-2015-0051009호(2015.05.11. 공개)

Chem Commun (Camb), Vol.53(3), pp. 525-528 (2017.01.03. 공개)

본 발명은 hNQO1 효소 활성에 선택적으로 감응하는 신규한 이광자 형광 프로브를 이용하여 살아있는 세포 또는 온전한 생체 조직에서 hNQO1 효소 활성을 정량적으로 검출하는 방법을 제공함으로써 암질환을 진단하고자 한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

상기 n은 8 내지 15의 정수.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 시료에 처리하는 단계; 상기 이광자 형광 프로브가 처리된 세포에 여기원을 조사하는 단계; 및 상기 여기원이 조사된 세포에서 이광자 형광 프로브로부터 발생하는 색 변화 비율의 증가 수준을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 진단방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 가변색 이광자 형광 프로브는 세포독성과 pH 영향 없이 살아있는 세포와 80-180 μm 깊이의 생체 조직 내부의 hNQO1 효소 활성에 선택적으로 감응하여 높은 감도로 형광색 변화를 나타낼 수 있으므로, 세포 또는 조직 내의 hNQO1 효소 활성 수준을 효과적으로 정량함으로써 암 질환을 진단할 수 있다.

도 1은 SHC의 효소 반응을 확인한 결과로, 도 1(a)는 디티온산 나트륨에 의한 환원 후 PBS 버퍼(10 mM, pH 7.4)에서 SHC (2.0 μM)의 시간 의존적 형광 스펙트럼를 나타낸 결과이며, 도 1(b)는 사람 NAD(P)H 퀴논 산화환원효소 타입 1(hNQO1, 20 μg/mL)에 의한 활성 후 PBS 버퍼 (10 mM, pH 7.4, 0.007% BSA, 100 μM NADH)에서 시간 의존적 형광 스펙트럼을 나타낸 결과이다. 도 1c는 PBS 버퍼 (10 mM, pH 7.4, 0.007% BSA, 100 μM NADH)에서 SHC vs [hNQO1]에 대한 F_yellow/F_blue 비율의 플롯을 나타낸 결과로, 각 데이터 포인트는 37℃에서 hNQO1 첨가 후 5분 간격으로 수집되었으며, 검출 한계는 3σ/k로 산출되었다; 상기 σ는 가 측정의 표준편차이며, 상기 k는 기울기이다. 도 1(d)는 37℃, PBS 버퍼 (10 mM, pH 7.4, 0.007% BSA, 100 μM NADH)에서 SHC (1-40 μM)와 hNQO1 (10 μg/mL)의 반응속도를 확인한 결과로, 값은 평균 ±1 샘플 표준 편차이며, 곡선은 최적의 평균 데이터 값을 나타낸 것으로, 여기 파장은 370 nm였다.
도 2는 다양한 활성산소종(ROS: H₂O₂, TBHP, OCl^-, O2^-, NO, ·O^tBu, ·OH, ONOO^-, 200 μM), 글루타티온(glutathione; GSH, 1 mM), 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT, 1 mM), 아스코르빅산(ascorbic acid; AA, 1 mM), 니트로리덕테이즈(nitroreductase; NTR, 10 units), 아미다아제(amidase; Ami, 10 units), 모노아민 산화효소 B (MAO B, 10 units), 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase; AChE, 10 units), 사람 카르복실에스테라아제 1(hCE1, 10 units), 사람 카르복실에스테라아제 2(hCE2, 10 units), β-갈락토시다아제(Gal, 10 units), 글루코시다아제(Glu, 10 units), hNQO1(40 μg/mL) 및 NADH ( 200 μM)에서 1 μM SHC의 형광 반응을 확인한 결과로, 각 반응성 종 첨가 후 0-2시간 내에 400-450 (F_blue) 및 550-600 nm (F_yellow)에서 통합된 방출 비율을 막대 그래프로 나타낸 결과이며, 여기 파장는 370 nm (n = 3)이였다.
도 3(a) 및 도 3(b)는 SHC (2.0 μM)로 표지된 HT-29 세포의 이광자 현미경(TPM) 이미지이며, 도 3(c)는 SHC (2.0 μM)로 표지된 HT-29 세포의 의사 색체로 표시된 가변색 TPM 이미지이며, 도 3c는 HT-29 TPM 세포 이미지로부터 시간경과에 따른 상대적인 TPEF 강도를 확인한 결과로, xyt 모드를 이용하여 1시간 동안 2.00 간격으로 양자화된 세기를 기록하였으며, TPEF 강도는 femto-second pulses와 750 nm에서 여기시킨 후 400-450 nm (F_blue) 및 550-650 (F_yellow)에서 수집되었다. Scale bars는 48 μm이다.
도 4는 SHC (2.0 μM)과 30분간 인큐베이션한 HT-29(a), CCD-18Co(b), MDA-MB-231(c), 및 MDA-MB-468(d) 세포와 80 μM 디쿠마린 전처리된 HT-29(e)의 의사 색체로 표시된 가변색 TPM 이미지로, 흰색으로 표시된 박스부분은 각 세포 이미지를 100× 배율로 확장시킨 이미지이며, 도 4(f)는 무작위로 선정된 100개의 부위에서 형광강도를 측정하고 상기 이미지 a-e의 상대적인 비율값(F_yellow/F_blue)을 박스 플롯으로 나타내었다. 박스 한계는 상위 및 하위 분위 값을 나타내며 중앙값으로 구분하였다. 최고 및 최저값은 에러 바를 이용하여 나타냈었으며, 별표(*)는 통계적으로 유의한 값을 나타내었다. 이미지는 750nm 여기원을 이용하여 얻었으며, 400-450 nm (푸른색) 및 550-650 nm (노란색) 방출 창에서 검출되었다(Scale bars, 200 및 40 μm).
도 5(a) 내지 5(c)는 각각 정상, 선종 및 선암 조직의 대장내시경 이미지이며, 도 5(d) 내지 5(i)는 37℃에서 5 μM SHC로 30분간 표지시킨 사람 정상, 선종 및 선암 대장 조직의 3D TPM 가변색 이미지로, 상기 대장 조직의 3D 이미지는 40× 배율로 80-180 μm 깊이에서 타일(tile) 스캔된 1500 TPM 이미지로 구성되었다. 도 5(g) 내지 도 5(i)는 도 5(d) 내지 5(f)의 흰색 점선 박스 부분을 확대한 3D TPM 가변색 이미지이며, 도 5(j)는 80-180 μm 깊이에서 얻은 TPM 가변색 이미지 단면도이며, 도 5(k)는 9000개의 무작위로 선정된 부위에서 측정된 형광 강도와 상대적인 비율 값(F_yellow/F_blue)을 박스 플롯으로 나타낸 결과이다. 박스 한계는 상위 및 하위 분위 값을 나타내며 중앙값으로 구분하였다. 최고 및 최저값은 에러 바를 이용하여 나타냈었으며, 별표(*)는 통계적으로 유의한 값을 나타내었다. 이미지는 750nm 여기원을 이용하여 얻었으며, 400-450 nm (푸른색) 및 550-650 nm (노란색) 방출 창에서 검출되었다. (Scale bars, (d-f) 770 및 (g-i) 80 μm).
도 6은 HT-29 세포를 2시간 동안 프로브와 인큐베이션한 후 CCK-8 키트를 이용하여 SHC 존재하에서 HT-29의 생존도를 확인한 결과이다.
도 7은 일반적인 버퍼 조성(0.1 M citric acid, 0.1 M KH2PO4, 0.1 M Na2B4O7, 0.1 M Tris, 0.1 M KCl)에서 SHC의 형광 강도 비율에 미치는 pH 영향을 확인한 결과도, 방출 파장은 355nm였다.
도 8은 대장 내 정상 점막(A, B), 관상 선종(C, D) 및 선암(E, F)의 병리학적 결과로, A, C 및 E는 ×100배율로 촬영한 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색 결과이며, B, D 및 F는 ×400배율로 촬영한 헤마톡실린&에오신 염색 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 정상 조직보다 암 조직에서 활성화 수준이 증가되어 있는 hNQO1 효소를 살아있는 세포와 생체 조직 내부에서 선택적으로 검출하기 위한 신규한 이광자 프로브를 확인하였으며, 실제로 이를 이용하여 암 조직 내 hNQO1 효소 활성을 정량적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공할 수 있다.

[화학식 1]

상기 n은 8 내지 15의 정수일 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제공할 수 있다.

[화학식 1]

상기 n은 8 내지 15의 정수일 수 있다.

상기 이광자 형광 프로브는 종양 세포 내 hNQO1 효소의 환원반응을 선택적으로 검출할 수 있다.

상기 이광자 형광 프로브는 종양 세포 내 hNQO1 효소의 환원반응에 의해 방출색이 푸른색에서 노란색으로 변하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 시료에 처리하는 단계;

상기 이광자 형광 프로브가 처리된 시료에 여기원을 조사하는 단계; 및

상기 여기원이 조사된 시료에서 이광자 형광 프로브로부터 발생하는 색 변화 비율의 증가 수준을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 진단방법을 제공할 수 있다.

상기 여기원은 700 내지 800 nm 범위의 파장을 갖는 것일 수 있다.

상기 시료는 조직, 세포 및 혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 이광자 형광 프로브로부터 발생하는 색 변화 비율은 조직 또는 세포 내 hNQO1 효소의 환원반응에 의해 이광자 형광 프로브의 방출색이 푸른색에서 노란색으로 변하는 비율을 확인하는 것일 수 있다.

상기 hNQO1 효소의 환원반응은 80 내지 180 μm 깊이의 생체 조직에서 탐지될 수 있다.

상기 암질환은 대장암, 유방암, 간암, 폐암 및 뇌암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 1> 효소반응속도 분석

Varioskan Flash micro plate reader (6-1536 well)를 이용하여 SHC 효소반응속도를 확인하였다.

0.007 % BSA 및 100μM NADH가 포함된 PBS 버퍼(10 mM, pH = 7.4)를 이용하여 다양한 농도의 SHC (0-40 μM)를 준비하였다. 그 후, 최종 농도가 10 μg/mL이 되도록 hNQO1 효소를 첨가하고 37℃에서 1분 간격으로 0에서 30분간 550nm (λ_ex = 370 nm)의 형광 강도를 수집하였다.

비선형 피팅 알고리즘(OriginPro 8.0)을 이용하여 미하엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 식의 동역학 파라미터가 도 1(d)와 같은 쌍곡선함수로 확인되었다.

< 실험예 2> 선택성 분석

실험에 사용된 활성산소(H₂O₂, TBHP, OCl^-, O2^-, NO, ·OtBu, ·OH, ONOO^-, 200 μM)를 보고된 방법(Park et al, 2016)으로 준비하였다.

글루타티온 (glutathione; GSH), 디티오트레이톨 (dithiothreitol; DTT), 및 아스코르브산 (ascorbic acid; AA)를 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 니트로리덕테이즈 (nitroreductase; NTR), 아미다아즈 (amidase; Ami), 모노아민 옥시다아제 B (monoamine oxidase B; MAO B), 아세틸콜린에스테라제 (acetylcholinesterase; AChE), 사람 카르복실에스테라아제 2 (human carboxylesterase 2; hCE2), β-갈락토시다아제 (β-galactosidase; Gal), β-글루코시다아제 (β-glucosidase; Glu) 및 hNQO1가 포함된 효소를 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.

< 실험예 3> 세포 배양

세포를 유리 바닥 디쉬(NEST, Rahway, NJ, USA)에 플레이팅하고 SHC 2 μM을 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 30분간 인큐베이트한 후, PBS (Gibco, Gaithersburg, MD, USA)로 세번 세척하고 TPM 이미지화하였다.

각 세포의 배양 배지는 하기와 같다.

HeLa 사람 자궁경부 악성 종양 세포(KCLB, Seoul, Korea)는 10% 태아소혈청(FBS, WelGene), 페니실린 100 units/mL 및 스트렙토마이신 100 μg/mL이 포함된 MEM(minimum essential medium eagle; WelGene Inc, Seoul, Korea)배지를 사용하였으며, HT-29 세포 (KCLB), MDA-MB 231 세포(KCLB), MDA-MB 468 세포(ATCC, Manassas, VA, USA) 및 CCD18Co 세포 (ATCC)는 10% FBS, 페니실린 100 units/mL 및 스트렙토마이신 100 μg/mL이 포함된 RPMI1640 (WelGene)를 사용하여 배양하였다.

< 실험예 4> 세포 생존도 분석

앞선 실험의 인큐베이션 조건에서 프루브가 HT-29 세포의 생존도에 미치는 영향을 확인하기 위해, 제조사의 설명서에 따라 MTS (Cell Titer 96H; Promega, Madison, WI, USA) 및 CCK-8 키트 (Cell Counting kit-8; Dojindo, Japan)분석을 수행하였다.

< 실험예 5> 이광자 형광 현미경 (Two Photon Fluorescence Microscopy)

다중광자 현미경(multiphoton microscope; Leica TCS SP8 MP, Wetzlar, Germany)을 이용하여 SHC가 표지된 세포의 이광자(TP) 여기 형광 현미경 이미지를 얻었다.

프로브의 TP 여기 광원으로서, 초점면에 750 nm 파장과 1.68 × 10⁸ mW/cm² 평균 전원으로 세팅된 고정 모드의 티타늄-사파이어 레이저(titanium-sapphire laser; Mai Tai HP; Spectra Physics, Santa Clara, CA, USA; 80 MHz, 100 fs)를 이용하였으며, 가변색 방식의 이미지를 얻기 위해 MetaMorph 소프트웨어를 사용하였다.

< 실험예 6> 광안정성 ( Photostability )

SHC의 광안정성을 확인하기 위해, SHC (2.0 μM)가 표지된 HT-29 세포를 무작위로 선정하고 세포의 지정된 위치에서 시간 경과에 따른 TPEF 강도 변화를 모니터링하였다.

도 3과 같이 TPEF 강도는 F_blue (400-450 nm) 및 F_yellow (550-650 nm)에서 동시에 수집되었으며, 상수 값이 1시간 동안 유지됨에 따라, 높은 광 안정성이 확인되었다.

< 실험예 7> 대장 조직 준비

IRB(institutional review board)로부터 승인받은 프로토콜에 따라 동의를 얻은 7명의 외래환자로부터 아주대학교 메티컬 센터에서 대장 내시경 검사를 진행하는 동안 대장 조직을 얻었다.

측정값을 얻기 위해, 도 5(a) 내지 도 5(c)와 같이 정상, 선종 및 대장선암종 조직을 사용하였으며, 동일병변 당 세 개의 조직 절편으로 병리학적 분석을 수행하였다.

먼저, 조직을 30분간 충분히 염색하여 SHC (5 μM)로 표지하였다.

SHC로 표지된 ex vivo 절편당 1500 TPM 이미지를 얻었으며, 상기 이미지는 z-방향으로 80-180 μm 깊이에서 섹션 당 50 TPM의 이미지로 30개의 섹션이 구성되었다.

가변색 TPM 이미지는 F_blue (400-450 nm) 및 F_yellow (550-650 nm)에서 40배 배율로 수집되었으며, 도 5(j)와 같이 80-180 μm의 깊이에서 확인된 단면적 비율의 TPM 이미지는 형광 영역의 분포를 나타내었다.

< 실시예 1> 이광자 프로브 ( SHC ) 합성

[반응식 1]

hNQO1에 대한 가변색 이광자(TP) 프로브를 디자인하기 위해, TP 활성화 수용체, 6-(벤조[d]티아졸-2'-일)-2-(N,N-디메틸아미노)나프탈렌 [6-(benzo[d]thiazol-2’-yl)-2-(N,N-dimethylamino)naphthalene; BTDAN] 및 효소 반응 부위, TLQ(trimethyl-locked quinone)를 사용하였다.

상기 반응식 1과 같이 자가 절단 스페이서 N-메틸-p-아미노벤질 알콜을 통하여 BTDAN 및 TLQ를 함께 결합시켰다.

hNQO1에 의해 유도되는 환원은 카르바산염 고정 아민으로부터 강력한 전자 공여 그룹을 유리시키기 때문에 적색 영역으로 스펙트럼 이동을 초래할 수 있다.

또한, 수용성 매질의 용해도를 향상시키기 위해, TLQ의 반대쪽에 에틸렌 글리콜 올리고머를 도입하였다.

그 결과, SHC는 반응식 1과 같이 리포터 (1)과 수용체 (A)의 커플링 반응을 통하여 22% 수율로 제조되었다.

보다 상세하게 이미 보고된 방법(Hettiarachchi et al, 2014; Sarkar et al, 2015)에 따라, 화합물 A 및 화합물 1을 준비하였다.

먼저, Na₂CO₃ (0.48 g, 4.48 mmol) 및 트리포스겐(triphosgene; 0.33 g, 1.12 mmol)를 둥근 바닥 플라스크에 넣어 진공 건조시키고 THF를 첨가하여 질소 하에서 - 5℃ 및 암 조건으로 1시간 동안 교반하였다.

건조된 THF (20 mL)에 화합물 A 용액(0.41 g, 1.12 mmol)을 적가하고 실온에서 6시간 동안 교반한 후 감압하여 용매를 제거하였다.

용매 제거 후 남은 잔사물에 화합물 1 (0.438 g, 0.50 mmol)이 포함된 건조 CH₂Cl₂ 25 mL과 건조 피리딘(0.20 mL, 2.48 mmol)을 천천히 첨가하여, 반응 혼합물을 질소 대기하에서 실온으로 12시간 동안 교반하였다.

반응이 완료된 후, 용매를 증발시키고 남은 잔사를 5% CH₃OH가 포함된 CHCl₃을 용리액으로 이용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 SHC를 얻었다. 수율(Yield) : 0.14 g (22 %); ¹HNMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.52 (m, 2H), 8.18 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 8.07 (d, 1H J = 8.4 Hz), 8.20 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.94 (d, 2H J = 8.8 Hz), 7.88 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.71 (s, 1H), 7.52 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.38-7.35 (m, 3H), 7.14 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 5.21 (s, 2H), 3.68-3.56 (m, 48H), 3.51-3.46 (m, 3H), 3.33 (s, 3H), 3.10 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.96 (d, 6H, J = 16.8 Hz), 1.25 (s, 6H); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 191.26, 187.62, 172.02, 170.28, 186.87, 156.03, 155.32, 154.77, 143.69, 142.37, 137.86, 136.31, 135.30, 135.04, 131.73, 131.28, 130.87, 129.71, 129.14, 128.9, 127.66, 125.93, 125.52, 125.14, 122.94, 121.78, 72.16, 70.77, 70.48, 70.16, 67.62, 59.32, 47.96, 40.40, 38.90, 38.22, 37.43, 28.80, 14.48, 13.17, and 12.55 ppm. HRMS (FAB⁺): m/z calcd for [C67H91O18N4S1]⁺: 1271.6044, found: 1271.6047.

< 실시예 2> 프로브의 광물리학적 특징 확인

형광 적정 방법으로 인산완충생리식염수(PBS) 버퍼 내에서 확인된 SHC의 용해도는 대략 2.0 μM이 었으며(Kim et al, 2007), 상기 조건에서 SHC 및 화합물 1의 최대 흡수(λ_max)는 336nm (ε = 2.38 × 104 M^-1·cm^-1) 및 376nm (ε = 2.66 × 104 M^-1·cm^- ¹)였으며, 최대 방출(λ_max ^fl)은 458nm (Φ = 0.03) 및 540nm (Φ = 0.34)인 것으로 확인되었다.

SHC (122 nm)보다 화합물 1 (164 nm)에서 더 크게 나타난 스토크스 이동은 강한 전자 공여군으로 인하여 전하 이동 여기 상태가 더 안정화되었기 때문이다.

환원제인 디티온산나트륨(sodium dithionite)을 이용하여 SHC의 스펙트럼 반응을 확인하였다.

그 결과, 도 1(a)와 같이 디티온산나트륨 첨가가 의해 SHC의 형광 강도가 460nm에서 점차 감소하였고, 강한 등방사점인 482nm와 동시에 540nm에서 점차 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과는 하기 반응식 2와 같이 하이드로퀴논을 형성하는 퀴논의 환원에 의해 촉진되었을 가능성이 있으며, 이는 분자 내 고리화 이후 카르바메이트 결합의 제거에 의해 유발될 수 있다.

[반응식 2]

또한, 유사한 스펙트럼 변화가 효소 반응에 의해 확인되었다.

고속액체크로마토그래피(high-performance liquid chromatography; HPLC) 분석 결과, 화합물 1은 SHC의 효소 반응에서 유일한 주요 생성물임을 확인할 수 있었다. 도 1b를 참고하면 조효소(cofactor; NADH, 100 μM)를 갖는 hNQO1 (20 μgmL^- ¹)의 존재하에서, 400-450 (F_blue)와 550-600 nm (F_yellow)의 SHC 형광 강도 비율(F_yellow/F_blue)은 10배 이상 증가하였다.

또한, 도 1(c)를 참고하면 0에서 0.80 μM 범위에서 F_yellow/F_blue 비율과 hNQO1 농도범위의 플롯이 선형 관계를 나타냄에 따라, SHC는 15 nM보다 낮은 농도에서도 hNQO1을 검출할 수 있음이 확인되었다.

한편, 미하엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 동역학 연구 결과, 도 1(d)와 같이 hNQO1-촉매 반응 (Kcat / Km) = 4.61 × 10³ M^-1 sec^-1에 대한 SHC의 특이도 상수 (Km = 2.84 ± 0.1 μM)를 확인할 수 있었으며, 상기 값은 표 2와 같이 나프탈이미드 유도체를 포함하는 TLQ 값과 유사한 것으로 확인되었다.

또한, 이광자 여기 형광(TPEF) 밝기를 확인하기 위해, 메탄올에 용해된 로다민 6G (rhodamine 6G)를 이용하여 PBS 버퍼에서 SHC와 화합물 1의 TP 작용 교차 부위(δΦ_max, δ = TP 흡수단면적; Φ = 형광 양자수율)를 확인하였다.

그 결과, 750 nm에서 SHC와 화합물 1의 δΦ_max 값은 각각 12 및 82 GM (광자 당 1 GM = 10^-50 cm⁴)인 것으로 확인되었다. 상기 결과와 같이 화합물 1이 높은 값을 나타내는 것은 SHC와 비교하여 향상된 분자 내 전하 전달 특성 때문일 수 있으며, 이를 통하여 SHC가 hNQO1 활성에 대한 방출 가변색 및 TP 프로브임이 확인되었다.

< 실시예 3> 선택성 확인

다양한 생체 대사물질을 이용하여 SHC의 선택성을 확인한 결과, 도 2와 같이 hNQO1를 제외하고, 활성산소종(ROS: H₂O₂, tert-butyl hydroperoxide (TBHP), OCl^-, O2^-, NO, O^tBu, OH 및 ONOO^-), 생리학적 환원제(GSH, DTT, and ascorbic acid (AA)) 및 다른 효소(nitroreductase, amidase, monoamine oxidase, various esterases, galactosidase, and glucosidase)의 존재하에서도 SHC의 F_yellow/F_blue는 변하지 않았다.

또한, SHC는 도 7과 같이 생물학적으로 적절한 pH 범위에서는 pH에 민감하지 않았다.

상기 결과로부터 SHC는 다른 생물학적으로 관련있는 분석 또는 pH 변화에 따른 간섭 없이 hNQO1 활성에 대하여 높은 선택성을 갖는 프로브인 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4> 대장 세포에서 프로브의 이광자 현미경 이미지 확인

살아있는 세포에서 hNQO1 활성에 대한 가변색 이광자(TP) 프로브로서의 SHC 활용성을 확인하기 위해, HT-29 세포와 프로브를 인큐베이션한 후, 도 3(a) 내지 도 3(c)와 같이 400-450 (F_blue) 및 550-650 nm (F_yellow)에서 TPM 이미지를 동시에 수집하고, F_yellow/ F_blue 비율을 확인하였다.

그 결과, 도 3(d)와 같이 각 채널에 대한 선명한 이미지를 얻을 수 있었다.

상기 결과로부터 SHC는 1시간 동안 시간 경과에 따른 TPEF의 높은 광안정성을 나타내었으며, 유의한 δΦmax 값과 우수한 세포 적재능을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 6과 같이 SHC는 MTS 및 CCK-8 분석 결과, 영상 진단 조건하에서 거의 세포독성이 나타나지 않았다.

한편, in situ 검출 능력을 확인하기 위해, SHC를 hNQO1 양성 세포(대장 암 세포, HT-29) 및 음성 세포 (대장암 정상 세포, CCD-18Co 및 유방암 세포, MDA-MB-231 및 MDA-MB-468)와 인큐베이션하고, 750 nm에서 여기시켰다.

그 결과, 도 4와 같이 400-450 nm (F_blue) 및 550-650 nm (F_yellow) TPM 이미지에서 SHC로 표지된 세포가 동시에 확인되었다. 또한, F_yellow/F_blue 비율을 분석한 결과, HT-29 및 CCD-18Co 세포의 평균비율은 각각 2.02 ± 0.08 및 1.18 ± 0.05으로 확인됨에 따라, HT-29 세포에서 보다 높은 hNQO1 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 다른 hNQO1 음성 세포주인 MDA-MB-231 및 MDA-MB-468은 각각 1.19 ± 0.06 및 1.20 ± 0.05의 평균 비율을 나타내었으며, 상기 결과는 CCD-18Co 세포의 값과 유사하게 나타났다.

앞선 실험에서 확인된 바와 같이 hNQO1 활성이 실제로 HT-29 세포에서 높은 비율로 나타나는지를 확인하기 위해, 환원억제제로 알려진 디쿠마롤(dicoumarol)를 이용하여 대조 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 4(f)와 같이 디쿠마롤이 처리된 HT-29 세포군의 비율은 1.10 ± 0.08로 감소하였으며, hNQO1-음성 세포 주와 유사한 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터 SHC는 살아있는 세포 내 hNQO1 활성을 선택적으로 정량할 수 있음이 확인되었다.

< 실시예 5> 사람 대장 조직에서 이광자 현미경 이미지 확인

SHC를 이용하여 사람 대장 조직에서 hNQO1을 확인하기 위해, 도 5(a) 내지 도 5(c)와 같이 아주대학교 병원에서 대장 내시경 검사를 수행하는 동안 환자의 대장에서 정상, 선종 및 선암 조직 샘플을 채취하고 즉시, 프로브를 표지하고 TPM을 이용하여 모니터링하였다.

각각 80-180 μm 깊이에서 정상, 선종 및 선암 조직 샘플의 이미지를 수집하였으며, hNQO1 활성의 분포를 시각화하기 위해, 약 1500개의 부분으로부터 3D 가변색 이미지를 구성하였다.

그 결과, 도 5(d) 내지 도 5(f)의 3D 이미지를 통하여 정상, 선종 및 선암 샘플에서 hNQO1 활동 차이가 명확하게 확인되었다.

또한, 정상 점막의 고배율 이미지인 도 5(g)를 참고하면, 대장 점막의 장샘(crypts)은 대부분 비분지형이였으며, 점막고유층의 얇은 막은 분리되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

반면, 도 5(h) 및 도 5(i)를 참고하면 선종 샘플에서는 각각의 장샘이 관 모양과 증가된 부위를 나타내었으며, 선암에서는 대부분의 세관들이 복합하고 불규칙적인 모양을 나타내었으며, 상기 결과는 도 8의 헤마톡실린&에오신으로 염색된 절편의 결과와 일치하였다.

또한, 각각의 정상, 선종 및 선암 대장 샘플에서 9000개의 비율(F_yellow/F_blue) 이미지를 분석한 결과, 도 5(k)와 같이 정상 샘플의 평균 비율은 1.15 ± 0.02으로 확인된 반면, 대장의 선종 샘플에서는 2.40 ± 0.02로 급격히 증가하였으며, 선암에서는 3.20 ± 0.02로 정상 조직과 비교하여 3 배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.

특히, 비율 값이 정상에서 선종 및 선암으로 점차 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 결과로부터 SHC 표지가 여러 단계의 대장 종양에서 hNQO1의 특이적인 활동을 민감하게 검출할 수 있음이 확인되었다.

이러한 이미지는 최초로 사람 대장 조직 내에 hNQO1 활성을 in situ 시각화할 수 있으며, 이는 대장 종양의 정량적 분석을 위한 대체 방법 개발에 매우 중요하다.

또한, 제안된 SHC 표지를 이용한 모든 측정은 TPM 이미징 비율을 사용하여 생검 후 1 시간 이내에 이루어지므로, H&E 염색과 같은 종래의 진단 방법보다 빠르고 신뢰성이 높다.

상기 결과들로부터 SHC는 사람 대장 조직 내 hNQO1 활성을 in situ에서 시각화하는 데에 매우 적합한 것으로 확인되었으며, 이를 통하여 결장 종양의 정확한 진단을 위한 효과적인 도구로 사용될 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 1]

상기 n은 8 내지 15의 정수.
하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브:
[화학식 1]

상기 n은 8 내지 15의 정수.
청구항 2에 있어서, 상기 이광자 형광 프로브는 종양 세포 내 hNQO1 효소의 환원반응을 선택적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브.
청구항 2에 있어서, 상기 이광자 형광 프로브는 종양 세포 내 hNQO1 효소의 환원반응에 의해 방출색이 푸른색에서 노란색으로 변하는 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브.
하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 인간으로부터 분리된 시료에 처리하는 단계;
상기 이광자 형광 프로브가 처리된 시료에 여기원을 조사하는 단계; 및
상기 여기원이 조사된 시료에서 이광자 형광 프로브로부터 발생하는 색 변화 비율의 증가 수준을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 진단을 위한 정보 제공방법.
[화학식 1]

상기 n은 8 내지 15의 정수.
청구항 5에 있어서, 상기 여기원은 700 내지 800 nm 범위의 파장을 갖는 것을 특징으로 하는 암질환 진단을 위한 정보 제공방법.
청구항 5에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포 및 혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암질환 진단을 위한 정보 제공방법.
청구항 5에 있어서, 상기 이광자 형광 프로브로부터 발생하는 색 변화 비율은 조직 또는 세포 내 hNQO1 효소의 환원반응에 의해 이광자 형광 프로브의 방출색이 푸른색에서 노란색으로 변하는 비율을 확인하는 것을 특징으로 하는 암질환 진단을 위한 정보 제공방법.
청구항 5에 있어서, 상기 암질환은 대장암, 유방암, 간암, 폐암 및 뇌암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암질환 진단을 위한 정보 제공방법.