KR101381767B1 - 생체 조직 내 일산화질소 활성 감지를 위한 이광자 형광 프로브 및 이의 제조 방법과 이를 이용한 생체 조직 내 일산화질소 활성의 영상화 방법 - Google Patents
생체 조직 내 일산화질소 활성 감지를 위한 이광자 형광 프로브 및 이의 제조 방법과 이를 이용한 생체 조직 내 일산화질소 활성의 영상화 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 생체 내에 존재하는 일산화질소 이미징용 이광자 형광 프로브 및 이의 제조 방법 및 이의 생체 조직 세포 내 일산화 질소의 이미징 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 이광자 형광 프로브는 생체 조직 내부에 선택적으로 염색됨과 동시에 일산화질소와 반응하여 강한 이광자 형광을 나타내며, 60분 이상의 시간에 걸쳐 생체 세포 및 100~200 μm 깊이의 생체 조직에서 선택적으로 일산화질소를 탐지할 수 있으므로 생체 세포 또는 온건한 생체 조직에서 일산화질소의 분포 및 활성을 고해상도로 이미징할 수 있다.
본 발명에 따른 이광자 형광 프로브는 생체 조직 내부에 선택적으로 염색됨과 동시에 일산화질소와 반응하여 강한 이광자 형광을 나타내며, 60분 이상의 시간에 걸쳐 생체 세포 및 100~200 μm 깊이의 생체 조직에서 선택적으로 일산화질소를 탐지할 수 있으므로 생체 세포 또는 온건한 생체 조직에서 일산화질소의 분포 및 활성을 고해상도로 이미징할 수 있다.
Description
본 발명은 생체 조직 내부에 존재하는 일산화질소와 선택적으로 감응하여 형광이 나타나는 저분자량의 형광 프로브에 관한 것으로서 보다 구체적으로는 높은 감도와 선택성으로 생체 조직 내 깊은 곳에 존재하는 일산화질소의 활동성을 낮은 에너지 여기원의 이광자 현미경을 통해 실시간으로 영상화 할 수 있는 방법에 관한 것이다.
인체 내에서 세포를 파괴하는 유독물질로 인식되었던 일산화질소(Nitric oxide(NO))는 심혈관이나 신경계는 물론 전신에 분포하는 강력한 생체신호전달 물질로서 면역계에 작용하여 세균이나 바이러스를 퇴치한다. 중추신경계에서 일산화질소는 기억을 저장하고 검색하며 정보를 전달하는데 사용되기 때문에 알츠하이머병을 예방할 수 있고 또한 우리 체내에 감염을 억제하고 혈액을 조절하며, 세포의 막을 통과하여 세포활동을 조절하고 특정기능을 전달하는 메신저 역할을 하는 중요한 분자이다. 특히 인체에 95% 혈관의 모든 곳에 대단히 광범위하게 혈관 내피 활성화요소로 존재하는데, 혈압을 조절하고 면역체계를 강화할 뿐만 아니라 암세포와 미생물을 죽이며 근육활동이 서로 조화되도록 돕는 등의 많은 일을 한다.
이러한 기능을 이해하기 위하여, 단일광자 형광 프로브가 개발되어 왔으나 대부분의 단일광자 프로브의 공통적인 문제점은 그들의 짧은 여기 파장(<500 ㎚)이다. 이러한 요구는 얕은 투과 깊이(<100 ㎛), 광표백(photobleaching) 및 세포 자가 형광으로 인하여 조직 이미징에 대한 적용을 제한한다. 이러한 문제에 대한 이상적인 해결은 여기를 위하여 낮은 에너지의 2개의 근적외선 광자를 이용하는 이광자 현미경(TPM)이 된다. 이광자 현미경을 사용하면, 온전한 조직 내부 >100 ㎛ 이상의 깊이에서 장시간에 걸쳐 고해상도의 실시간 동영상으로 일산화질소의 활성을 감지할 수 있다. 또한 생체 조직 내부에 존재하는 일산화질소를 선택적으로 감지할 수 있는 형광 표지자는 전무한 상태이다.
이에 본 발명자는 기존의 단일광자 형광 프로브가 가지는 짧은 여기 파장에 따른 문제점을 해결하고, 생체 조직 내 일산화질소를 선택적으로 감지할 수 있는 형광 표지자를 개발하고자 연구, 노력한 결과, 생체 조직 내부에 존재하는 일산화질소를 선택적으로 감지할 수 있는 이광자 형광 프로브를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이에 본 발명의 목적은 생체 조직 내부에 효율적이고 선택적으로 염색되고 일산화질소에 대한 선택성과 활동성을 영상화시키기에 적합한 저분자량의 이광자 형광 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 이광자 형광 프로브를 이용하여 생체 세포 또는 조직에서 일산화질소의 분포 및 활동성을 선택적으로 이미징하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이광자 형광 프로브의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 화학식 4로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 일산화질소 이미징용 이광자 형광 프로브를 제공한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
상기 화학식 1 및 2에서 X는 각각 독립적으로 O 또는 S이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은,
(i) 하기 화학식 5 로 표시되는 화합물 및 2-니트로-p-페닐렌디아민의 반응 혼합물을 촉진제와 함께 처리하여 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계; 및
(ii) 상기 아마이드 화합물 내의 니트로기를 환원시키는 단계
를 포함하는 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식 5]
상기 화학식 5에서 X는 S 또는 O이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은,
(i) 하기 화학식 6 로 표시되는 화합물 및 2-니트로-p-페닐렌디아민의 반응 혼합물을 촉진제와 함께 처리하여 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계; 및
(ii) 상기 아마이드 화합물 내의 니트로기를 환원시키는 단계
를 포함하는 화학식 2로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식 6]
상기 화학식 6에서 X는 S 또는 O이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은,
(i) 하기 화학식 7 로 표시되는 화합물 및 2-니트로-p-페닐렌디아민의 반응 혼합물을 촉진제와 함께 처리하여 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계; 및
(ii) 상기 아마이드 화합물 내의 니트로기를 환원시키는 단계
를 포함하는 화학식 3로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식 7]
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은,
(i) 하기 화학식 8 로 표시되는 화합물 및 2-니트로-p-페닐렌디아민의 반응 혼합물을 촉진제와 함께 처리하여 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계; 및
(ii) 상기 아마이드 화합물 내의 니트로기를 환원시키는 단계
를 포함하는 화학식 4로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식 8]
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은
(a) 청구항 1의 화학식 1 내지 화학식 4중 어느 하나의 이광자 형광 프로브를 세포에 주입하는 단계;
(b) 상기 이광자 형광 프로브가 생체조직세포 내의 일산화질소 반응하여 형광을 나타내는 단계; 및
(c) 상기 형광을 이광자 현미경으로 통해 관측하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체조직세포 내 일산화질소의 이미징(imaging) 방법을 제공한다.
본원 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
(i) 본 발명에 따른 이광자 형광 프로브는 생체 조직 내부에 선택적으로 염색됨과 동시에 일산화질소와 반응하여 강한 이광자 형광을 나타낸다. 또한 물에 대한 용해도와 적은 분자량으로 인하여 세포에 쉽게 로딩될 수 있다.
(ii) 60분 이상의 시간에 걸쳐 생체 세포 및 100~200 μm 깊이의 생체 조직에서 선택적으로 일산화질소를 탐지할 수 있으므로 생체 세포 또는 온건한 생체 조직에서 일산화질소의 분포 및 활성을 고해상도로 이미징할 수 있다.
도 1은 (a) PBS 완충 용액에서 일산화질소 존재 하에 시간에 따른 이광자 형광 프로브(ANO1)의 형광 스펙트라이다. 약 70배의 형광 세기의 증가를 보인다. (b) PBS 완충 용액에서 생체 내 존재하는 활성 산소 종 및 활성 질소 종 존재 하에서 시간에 따른 4의 형광 세기를 나타낸 그래프이다. 여기 파장은 370 nm이다.
도 2는 (a) 이광자 형광 프로브(ANO1) 또는 (d) ANO1-T로 염색된 Raw 264.7 세포의 이광자 현미경 (TPM) 이미지이다. (b) 세포에 LPS와 IFN-를 선 처리한 후 ANO1을 염색한 후 촬영한 TPM 이미지이다. (c) 세포에 L-NNA, LPS, IFN-를 선 처리한 후 ANO1을 염색한 후 촬영한 TPM 이미지이다. (e) 위 실험을 반복 실시한 후 평균적인 이광자 형광세기의 그래프이다. 여기 파장은 750 nm. 스케일 바, 20 μm.
도 3은 20 μM의 ANO1으로 염색된 쥐의 해마절편 이미지이다. (a) 치아이랑(dantate gyrus, DG)영역과 CA1-CA3구역의 밝은 필드(bright field)이미지 이다 (10배율). (b) 100-180μm 정도의 깊이에서 z축 방향에 따른 25 TPM 이미지를 결합한 영상이다. (c) 약 100μm 정도의 깊이에서 이미징 용액에 NMDA 또는 L-NAME+NMDA를 가하기 전(0초)과 후(800초)의 DG 구역 TPM 이미지이다. (d) c) 실험의 시간에 따른 이광자 형광세기를 실시간으로 도식화한 그래프이다. 여기 파장은 750 nm. 스케일 바, (b) 300μm와 (c) 75μm.
도 4는 20 μM의 ANO1으로 염색된 쥐의 해마절편 중 CA3 영역과 DG 영역의 깊이 별(100-180μm) 단층이미지이다. 여기 파장은 750 nm. 스케일 바, 300μm.
도 2는 (a) 이광자 형광 프로브(ANO1) 또는 (d) ANO1-T로 염색된 Raw 264.7 세포의 이광자 현미경 (TPM) 이미지이다. (b) 세포에 LPS와 IFN-를 선 처리한 후 ANO1을 염색한 후 촬영한 TPM 이미지이다. (c) 세포에 L-NNA, LPS, IFN-를 선 처리한 후 ANO1을 염색한 후 촬영한 TPM 이미지이다. (e) 위 실험을 반복 실시한 후 평균적인 이광자 형광세기의 그래프이다. 여기 파장은 750 nm. 스케일 바, 20 μm.
도 3은 20 μM의 ANO1으로 염색된 쥐의 해마절편 이미지이다. (a) 치아이랑(dantate gyrus, DG)영역과 CA1-CA3구역의 밝은 필드(bright field)이미지 이다 (10배율). (b) 100-180μm 정도의 깊이에서 z축 방향에 따른 25 TPM 이미지를 결합한 영상이다. (c) 약 100μm 정도의 깊이에서 이미징 용액에 NMDA 또는 L-NAME+NMDA를 가하기 전(0초)과 후(800초)의 DG 구역 TPM 이미지이다. (d) c) 실험의 시간에 따른 이광자 형광세기를 실시간으로 도식화한 그래프이다. 여기 파장은 750 nm. 스케일 바, (b) 300μm와 (c) 75μm.
도 4는 20 μM의 ANO1으로 염색된 쥐의 해마절편 중 CA3 영역과 DG 영역의 깊이 별(100-180μm) 단층이미지이다. 여기 파장은 750 nm. 스케일 바, 300μm.
본 발명은 생체 조직 내부에 효율적이고 선택적으로 염색되고 일산화질소에 대한 선택성과 활동성을 영상화시키기에 적합한 저분자량의 이광자 형광 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 이광자 형광 프로브는 생체 새포 내부에서 선택적으로 염색되며, 일산화질소와 반응하여 약 70 배 이상의 형광세기의 증가를 나타낸다. 또한 가시광선 영역인 420 ~ 575 nm 범위에서 이광자 형광을 나타낸다. 따라서, 일산화질소에 대한 선택성과 활동성을 영상화시키기에 적합한 형광 프로브로써 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 이광자 형광 프로브를 제공한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
상기 화학식 1 및 2에서 X는 각각 독립적으로 O 또는 S이다.
본 발명의 이광자 형광 프로브는 생체 조직 세포에 선택적으로 염색되며, 일산화질소와 반응 하여 425 ~ 575 nm 범위의 가시광선 형광을 나타낸다. 따라서, 일산화질소에 대한 선택성과 활동성을 영상화하기에 적합한 형광 프로브로써 이용될 수 있다.
본 발명의 이광자 형광 프로브는 기존 사용되던 단일 광자 형광 프로브와는 달리 100 ~ 200 ㎛ 범위의 깊은 투과 깊이를 가져, 생체 세포 및 100 ~ 200 ㎛ 깊이의 생체 조직에서 일산화질소를 탐지할 수 있다. 또한 본 발명의 이광자 형광 프로브는 세 포 내부에서 광안정성의 특징으로 인해 60 분 이상 지속적인 일산화질소 탐지가 가능하며, 보다 바람직하게는 30 분 ~ 90 분 동안 탐지가 가능한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은,
(i) 하기 화학식 5 로 표시되는 화합물 및 2-니트로-p-페닐렌디아민의 반응 혼합물을 촉진제와 함께 처리하여 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계; 및
(ii) 상기 아마이드 화합물 내의 니트로기를 환원시키는 단계
를 포함하는 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제조하는방법을 제공한다.
[화학식 5]
상기 화학식 5에서 X는 S 또는 O이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은,
(i) 하기 화학식 6 로 표시되는 화합물 및 2-니트로-p-페닐렌디아민의 반응 혼합물을 촉진제와 함께 처리하여 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계; 및
(ii) 상기 아마이드 화합물 내의 니트로기를 환원시키는 단계
를 포함하는 화학식 2로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식 6]
상기 화학식 6에서 X는 S 또는 O이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은,
(i) 하기 화학식 7 로 표시되는 화합물 및 2-니트로-p-페닐렌디아민의 반응 혼합물을 촉진제와 함께 처리하여 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계; 및
(ii) 상기 아마이드 화합물 내의 니트로기를 환원시키는 단계
를 포함하는 화학식 3로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식 7]
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은,
(i) 하기 화학식 8 로 표시되는 화합물 및 2-니트로-p-페닐렌디아민의 반응 혼합물을 촉진제와 함께 처리하여 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계; 및
(ii) 상기 아마이드 화합물 내의 니트로기를 환원시키는 단계
를 포함하는 화학식 4로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식 8]
예를 들어, 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브의 제조는 질소 분위기 하에서 화학식 5로 표시되는 화합물을 2-니트로-p-페닐렌디아민과 반응시킨다. 카복시산의 작용기를 아민과의 반응으로 아마이드를 합성하는 과정이며, 실온 조건에서 반응시키는 것을 성공적으로 수행하기 위해 탈수 반응을 촉진시키는 촉진제로서 디카보이미드(dicarboimide)를 사용할 수 있다. 상기 디카보이미드 계열의 촉진제로서는 1,3-디사이클로헥실 카보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC), N,N'-디아이소프로필 카보디이미드(DIC) 등이 포함될 수 있으나 본 발명이 반드시 이에 한정하는 것은 아니다.
반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 3일 동안 실온에서 교반하였다. 용액을 증발시키고, 생성물을 CH3CN에 용해시킨 후 부산물인 요소는 필터링으로 제거하였고, 감압 조건에서 걸러진 생성물을 농축시킨다. 조 생성물을 CHCl3에서 5% 메탄올을 이동상으로 하여 컬럼 크로마토그래피에서 분리한다.
이 후 니트로기를 아미노기로 환원시키기 위한 시약을 처리한다.
본 발명에서는 금속 존재 하에서 묽은 염산을 처리하고 있으나, 반드시 이에 한정하는 것은 아니며, 니트로기 만을 선택적으로 환원시킬 수 있는 환원 반응은 모두 포함된다.
마지막으로 본 발명은 (a) 상기 이광자 형광 프로브를 세포에 주입하는 단계; (b) 상기 이광자형 광 프로브가 생체 조직 내 일산화질소와 반응하여 형광을 나타내는 단계; 및 (c) 상기 형광을 이광자 현미경으로 통해 관측하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 조직 내 일산화질소 이미징(imaging) 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 (a)단계에서 3 x 10-6 M의 매우 낮은 이광자 형광 프로브의 농도로 세포에 30 분 동안 주입시킴으로써 생체 조직 세포에 선택적으로 위치시킬 수 있다. 세포에 주입 후 이광자 현미경의 여기원은 750 nm에 해당하는 근적외선 빛을 사용하고, 형광의 범위는 425 ~ 575 nm 범위인 것을 특징으로 한다. 일산화질소와 반응하면 같은 형광 범위에서 이광자 여기 형광의 세기가 70 배 정도 증가되어 고해상도의 이광자 현미경 영상을 얻는 효과를 나타낸다.
낮은 여기 에너지를 갖는 2 개 의 근적외선 광자들을 여기원으로 사용하는 이광자 현미경(TPM)은 일광자 현미경에 비해서 증가된 투과 깊이 및 국소화된 여기를 가지며, 장시간 이미징이 가능하다는 장점이 있다. 본 발명은 상기와 같은 이미징 방법 을 통해 생체 세포 또는 조직에서 생체 조직 세포의 일산화질소의 분포 및 활동성을 효과적으로 이미징할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 화학식 4의 합성
(R)-1-(6-아세틸나프탈렌-2-일)피롤리딘-2-카복시산 (0.38 g, 1.34 mmol), 2-니트로-p-페닐렌디아민 (2-nitro-p-phenylenediamine) (0.17 g, 1.12 mmol), 1,3-디사이클로헥실 카보디이미드(1,3- dicyclohexyl carbodiimide) (DCC, 0.29 g, 1.40 mmol) 와 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole) (0.15 g, 1.12 mmol)을 용매 CH2Cl2 (30 mL)에 용해하였다. 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 3일 동안 실온에서 교반하였다. 용액을 증발시키고, 생성물을 CH3CN(15 mL)에 용해하였다. 부산물인 요소는 필터링으로 제거하였고, 감압 조건에서 걸러진 생성물을 농축시켰다. 조 생성물을 CHCl3에서 5% 메탄올을 이동상으로 하여 컬럼 크로마토그래피에서 분리하였고, 오랜지 색 고체를 수득하였다. 화학식 4의 합성은 하기 반응식 1로 나타내었다.
[반응식 1]
(R)-1-(6-acetylnaphthalen-2-yl)-N-(4-amino-3-nitrophenyl)pyrrolidine-2-carboxamide
수율 0.27 g (48 %); m.p. 270 ℃;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 8.55 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H, amide-NH), 8.08 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.83 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.57 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.12 (s, 2H, amine-NH2), 4.27 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 3.87 (m, 1H), 3.39 (m, 1H), 2.61 (s, 3H), 2.38 (m, 2H), 2.14 (m, 2H);
13C NMR (100 MHz, DMSO): δ 195.6, 169.9, 144.9, 140.1, 135.0, 129.2, 128.7, 128.2, 127.7, 124.7, 124.2, 123.8, 122.5, 117.0, 115.1, 114.3, 111.1, 104.8, 62.58, 47.87, 29.74, 24.53, 22.24.
실시예
2:
ANO1
의 합성
CH2Cl2 (10 mL)에 용해된 C(0.20 g, 0.48 mmol)에 0℃에서 염산 수용액(1 ml)를 한 방울 씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분간 교반하였다. 혼합물에 SnCl22 H2O (1.4 g, 6.21 mmol)을 첨가하였고, 실온에서 밤새 교반하였다. 최종 생성 혼합물을 2 N KOH에 세척하였고, CH2Cl을 이용하여 추출하였다. 유기층을 Na2SO4으로 건조시키고, 여과시킨 후 증발하였다. 조 생성물을 CHCl3에서 5% 메탄올을 이동상으로 하여 컬럼 크로마토그래피에서 분리하였고, 노란색 파우더를 수득하였다. 하기 반응식 2는 ANO1의 합성 과정을 나타낸 것이다.
[반응식 2]
(R)-1-(6-acetylnaphthalen-2-yl)-N-(3,4-diaminophenyl)pyrrolidine-2-carboxamide
수율 0.14 g (75 %); m.p. 180 ℃;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 8.32 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.96 (s, 1H, amide-NH), 7.93 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.06 (dd, J = 9.2, 2.4
Hz, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.93 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.55 (s, 2H), 4.25 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 3.86 (m, 1H), 3.43 (m, 1H), 3.35 (br s, 4H, diamine-2NH2), 2.66 (s, 3H), 2.40 (m, 2H), 2.13 (m, 2H);
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 197.6, 171.1, 147.2, 137.3, 135.6, 131.7, 131.3, 130.4, 126.6, 126.2, 124.9, 117.2, 116.7, 112.1, 109.3, 107.2, 65.1, 50.2, 31.9, 30.0, 26.8;
HRMS (FAB+): m/z calcd for [C23H25N4O2]: 389.1978, found: 389.1978.
실시예
3:
ANO1
-T의 합성
HCl 수용액(pH 2)에 용해된 ANO1 (0.14 g, 0.36 mmol) 혼합물에 소듐 나이트라이트(NaNO2, 0.25 g, 3.6 mmol)를 0℃에서 30분 동안 한 방울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 조 생성물을 CH2Cl2으로 추출하였고, 물로 두 번 세척하고 증발시켰으며, EA/헥세인 (4:1)을 전개액을 사용하여 컬럼 크로마토그래피에서 분리하였다. 이에 증발시켜 고체 형태의 다크 옐로우색 폼(foam)을 수득하였다.
하기 반응식 3은 ANO1-T의 합성 과정을 나타낸 것이다.
(R)-1-(6-acetylnaphthalen-2-yl)-N-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-6-yl)pyrrolidine-2-carboxamide
수득율: 0.072 g (51 %); m.p. 155 ℃;
1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 8.49 (d, 1H, amide-NH), 8.34 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.95 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.83 (br d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.10 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 7.00 (br s, 1H), 6.98 (d, J = 2.4 Hz , 1H), 4.36 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.96 (m, 1H), 3.48 (m, 1H), 2.66 (s, 3H), 2.48 (m, 2H), 2.16 (m, 2H);
13C NMR (100 MHz, DMSO d6): δ 196.6, 172.0, 146.6, 136.9, 130.7, 130.4, 130.0, 125.6, 124.5, 124.0, 116.3, 104.7, 62.18, 48.69, 31.45, 26.42, 23.52;
RMS (FAB+): m/z calcd for [C23H22N5O2]: 400.1774, found: 400.1773.
실시예
4:
ANO1
및
ANO1
-T의 다양한 용매에서의
광물리학적
특성
하기 표 1에서 모든 측정은 PBS 완충 용액에서 실시하였다. [b] 몰흡광계수 수치 [c] 단광자 방출 스펙트라 [d] 형광 양자 수득률 [e] 이광자 여기 스펙트라 [f] 10-50 cm4/양자(GM)에서의 이양자 단면 피크 [g] TPEF 강도가 매우 약하여 단면을 정확하게 측정하기 어려웠다.
[표 1]
실시예
5: 이광자 형광 현미경 이미지
ANO1 및 ANO1-T으로 레이블된 세포 및 조직을 스펙트라 콘포컬 현미경과 멀티양자 현미경을 이용하여 확인하였다.(배율: X10, X40 드라이, X100 오일, 개구율(Numerical Aperture): 0.30, 0.75 및 1.30)
750 nm 파장 및 1345 mW의 파워로 세팅시키고, 티타늄-사파이어 레이저 광원(Coherent Chameleon, 90 MHz, 200 fs)으로 프로브를 여기시켜 이광자 형광 현미경 이미지를 얻었다.
실시예
6: 이광자 형광
프로브를
이용한 생체 조직 내 일산화질소
이미징
분석
조직 내 세포의 영상화를 위해, 본 발명의 이광자 형광 프로브가 갖는 유용성을 증명하기 위해, 마우스 해마상 돌기의 미세박편을 모니터링하였다.
생후 14일의 마우스 해마상 돌기의 박편이 너무 커 하나의 영상으로 나타내기 어려운바, 100-200 μm 두께의 동일 xy 평면에서 얻은 복수의 이광자 형광 프로브 영상을 결합하였다.
도 3에서 패널 (a)는 치아이랑(dentate gyrus, DG) 영역과 CA1 - CA3 구역의 밝은-필드(Bright-field) 이미지(10x 배율)이고, 패널 (b)는 약 100-200 μm 깊이에서 z축 방향에 따른 25 TPM 이미지를 결합한 영상이며, 패널 (c)은 ~100 μm의 깊이에서 이미징 용액에 NMDA 또는 L-NAME+NMDA를 가하기 전(0초)과 후(800초)의 DG 구역 TPM 이미지이고 (d)은 페널 (c) 의 TPEF 강도의 시간별 변화 테이블이다.
생체 내에 투여된 이광자 형광 프로브는 DG와 CA3 구역에서 강한 형광을 나타내었다.(도 3 패널 b 및 도 2) 특히 DG 구역에서 강한 형광 세기가 나타난 것은 해당 구역에 일산화질소가 분포하고 있음을 의미하는 것이다(도 3 패널 c).
이는 본 발명의 이광자 형광 프로브가 TPM을 이용하여 생체 조직 내부에 특히 DG에 존재하는 일산화질소를 100 내지 200 μm의 두께까지 매우 효과적으로 검출할 수 있음을 보여주는 것이다.
Claims (11)
- 하기 화학식 1 내지 화학식 4로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 일산화질소 이미징용 이광자 형광 프로브.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
상기 화학식 1 및 2에서 X는 각각 독립적으로 O 또는 S이다.
- 청구항 1에 있어서, 생체 조직 내부에 선택적으로 염색되는 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브.
- 청구항 1에 있어서, 일산화질소와 반응하여 420 ~ 575 nm 범위의 형광을 나타내는 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브.
- 제 1 항에 있어서, 생체 세포 및 100 ~ 200 ㎛ 깊이의 생체 조직에 서 생체 조직 내 일산화질소 탐지가 가능한 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브.
- (i) 하기 화학식 5로 표시되는 화합물 및 2-니트로-p-페닐렌디아민의 반응 혼합물을 촉진제와 함께 처리하여 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계; 및
(ii) 상기 아마이드 화합물 내의 니트로기를 환원시키는 단계
를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브의 제조방법.
[화학식 5]
[화학식 1]
(상기 화학식 1 또는 5에서, X는 S 또는 O이다)
- (i) 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물 및 2-니트로-p-페닐렌디아민의 반응 혼합물을 촉진제와 함께 처리하여 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계; 및
(ii) 상기 아마이드 화합물 내의 니트로기를 환원시키는 단계
를 포함하는 하기 화학식 2로 표시되는 이광자 형광 프로브의 제조방법.
[화학식 6]
[화학식 2]
(상기 화학식 2 또는 6에서, X는 S 또는 O이다)
- (i) 하기 화학식 7로 표시되는 화합물 및 2-니트로-p-페닐렌디아민의 반응 혼합물을 촉진제와 함께 처리하여 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계; 및
(ii) 상기 아마이드 화합물 내의 니트로기를 환원시키는 단계
를 포함하는 하기 화학식 3으로 표시되는 이광자 형광 프로브의 제조방법.
[화학식 7]
[화학식 3]
- (i) 하기 화학식 8로 표시되는 화합물 및 2-니트로-p-페닐렌디아민의 반응 혼합물을 촉진제와 함께 처리하여 질소 분위기 하에서 교반시켜 아마이드 화합물을 생성시키는 단계; 및
(ii) 상기 아마이드 화합물 내의 니트로기를 환원시키는 단계
를 포함하는 하기 화학식 4로 표시되는 이광자 형광 프로브의 제조방법.
[화학식 8]
[화학식 4]
- 제 5 항 내지 제 8 항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (i)의 촉진제는 1,3-디사이클로헥실 카보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC), 또는 N,N'-디아이소프로필 카보디이미드(DIC)인 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브의 제조방법.
- (a) 제 1 항에서 정의된 화학식 1 내지 화학식 4 중에서 선택된 어느 하나의 이광자 형광 프로브를, in vitro 상에서 세포 시료에 주입하는 단계;
(b) 상기 이광자 형광 프로브가 세포 내의 일산화질소와 반응하여 형광을 나타내는 단계; 및
(c) 상기 형광을 이광자 현미경으로 통해 관측하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 일산화질소의 이미징(imaging) 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 (b)단계에서 나타내는 형광은 420 ~ 570 nm 범위인 것을 특징으로 하는 일산화질소의 이미징(imaging) 방법.
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