KR100924999B1

KR100924999B1 - 생체 내 산성 소포체 영상용 이광자 염료 및 이를 이용한생체 내 산성 소포체의 영상화 방법

Info

Publication number: KR100924999B1
Application number: KR1020070133747A
Authority: KR
Inventors: 조봉래
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2007-12-18
Filing date: 2007-12-18
Publication date: 2009-11-04
Also published as: KR20090066123A

Abstract

생체 내 산성 소포체 영상용 이광자 염료 및 이를 이용한 이를 이용한 생체 내 산성 소포체의 영상화 방법이 제공된다. 본 발명에 따른 산성 소포체 영상용 이광자 염료는 하기의 구조를 가지며,

시토졸에 존재하는 산성 소포체와 선택적으로 결합하여 높은 강도의 이광자 여기 형광을 발광할 수 있으므로, 산성 소포체의 효과적인 영상화가 가능하다.

Description

생체 내 산성 소포체 영상용 이광자 염료 및 이를 이용한 생체 내 산성 소포체의 영상화 방법{Two-Photon Fluorescent Probes for the Acidic Vesicles in Live Cell and Tissue and Method of Imaging the Acidic Vesicles in Live Cell Using the Same}

본 발명은 생체 내 산성 소포체 영상용 이광자 염료 및 이를 이용한 생체 내 산성 소포체의 영상화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 깊은 투과깊이를 가지며, 산성 조건의 소포체를 선택적으로 명확하게 영상화할 수 있는 산성 소포체 영상용 이광자 염료 및 이를 이용한 생체 내 산성 소포체의 영상화 방법에 관한 것이다.

리소좀과 리소좀-연관 세포기관은 산성의 분획 시스템(pH 4.0-5.0)을 이루고 있으며, 이 시스템은 다양한 기능을 보여주는 많은 수의 효소와 분비 단백질을 함유한다. 이러한 기능을 분석하기 위하여, 다양한 멤브레인-투광성의 형광 pH 및 리소좀 표지자가 개발되었으며, 이중 몇몇은 상업적으로 이용가능하다.

하지만, 일광자 현미경(one-photon microscopy, OPM)을 위한 이들 표지자의 사용은 짧은 파장의 빛(∼350-550nm)에 의한 여기가 필요하며, 또한 얇은 투과깊 이(<80㎛), 광표백(photobleaching) 및 세포의 자가-형광 등과 같은 문제가 있다.

따라서, 일광자 현미경 사용에 따라 발생하는 이러한 문제를 해결하기 위하여, 이광자 현미경(two-photon microscopy, TPM)이 그 대안으로 대두되었다.

상기 이광자 현미경은 여기를 위해서 2개의 NIR 광자들을 채용하고 있으며, 현재 생체조직의 영상화에 있어서 많은 관심을 끌고 있다 (Denk, W.; Strickler, J. H.; Webb, W. W. Science, 1990, 248, 73.; Zipfel, W. R.; Williams, R. M.; Webb, W. W. Nat . Biotechnol . 2003, 21, 1369).

이러한 이광자 현미경은 1932년 Maria Gopper-Mayer(Ann , Phys . 9(1931) 273)에 의한 두 개의 광자의 자발적 흡수현상을 기초하며, 이러한 이광자 여기(two photon excitation) 현상은 강한 레이저 광원이 개발되기 전까지는 장시간 실용화되어 있지 않았다. 여기에서, 이광자 여기란 센 광원을 조사하는 것에 의해, 단위 부피 및 단위 시간당의 광자 밀도가 충분히 높은 동일한 발광 부위에 2개의 광자가 동시에 흡수되는 현상을 말한다. 이때 흡수되는 에너지는 2개의 광자의 에너지의 합이며, 이광자 여기의 가능성은 광자밀도의 제곱에 의존한다.

따라서, 2개의 광자 흡수는 2차의 비선형(non-linear) 광학성질을 가진다. 한편, 이러한 여기상태에서 기저상태(ground state)로 전이하며 밴드 갭 에너지에 해당하는 에너지를 형광으로 방출하게 되는데, 이를 이광자 형광(two photon fluorescence)이라 하며 상기 방출되는 광자의 에너지는 상기 조사 광원의 광자 에너지보다 당연히 크다. 이러한 이광자 여기에 의해 형광 발광을 수반하는 물질을 통상 이광자 염료라고 하는데, 이광자 염료는 물론 상기 밴드 갭 에너지에 해당하 는 광자 에너지를 제공할 수 있는 광원에 의해서도 여기될 수 있는데, 이를 일광자 여기라 하며, 일광자 여기에 의한 형광 발광 스펙트럼은 이광자 여기에 의한 형광발광의 스펙트럼과 동일한 스펙트럼 특성을 가진다.

이러한 이광자 여기의 첫 번째 특징은 여기가 광조사점의 제한된 3차원 영역 근방에서만 일어나며, 따라서 상기 여기에 의한 형광 발광이 3차원 공간 편재화(localization)되기 때문에 백그라운드 형광(background fluorescence)이 최소화될 수 있다는 것이고, 조사되는 빛의 파장과 발광 형광의 파장이 서로 다르다는 것이 두 번째 특징이 된다. 특히, 상기 이광자 여기는 여기 체적(excitation volume)이 상당히 작기 때문에 작은 체적의 시료를 관찰하는데 적합하다.

한편, 상기에서 언급한 바와 같은 특징으로 인하여, 근적외선 영역의 빛을 조사함으로써 이광자 여기를 일으킬 수 있는 이광자 현미경(Two Photon Microscopy)은 상술한 바와 같이 생체 영상(bio imaging) 분야에 있어 많은 주목을 받고 있는데, 그 이유는 근적외선을 조사하기 때문에 생체 분자에 대한 손상이 적어서 살아 있는 세포에 적용할 수 있으며, 근적외선의 투과 깊이(penetration depth)가 깊고, 세포 자발 형광(tissue auto-fluorescence)을 최소화할 수 있기 때문이다. 이러한 이광자 현미경에 사용되는 이광자 염료는 i) 근적외선 영역에서의 이광자 단면적(two photon cross section:δ_TPA)이 커야하고, ii) 물에 대한 적당한 용해도를 가질 것, ii) 광안정성(photostability)이 클 것 및 iv) 생체에 대한 선택적 결합력이 우수할 것 등의 요건을 만족해야 한다.

하지만, 현재 이광자 현미경에 사용되는 대부분의 형광 표지자(이광자 염료)들은 작은 이광자 동작 단면적(two photon action cross-section, Φδ)을 가지는데, 이는 이광자 현미경의 사용을 제한하는 요소로 작용하며, 특히 살아있는 세포 및 조직에서 발견되는 산성 조건은 종래의 이광자 염료의 효율을 극도로 제한하게 하며, 상술한 바와 같이 산성 조건의 소포체를 영상화할 수 있는 효과적인 표지자로서 이광자 염료는 아직까지 보고되거나 개발되지 못하고 있다.

더 나아가, 산성 소포체를 염색하기 위한 이광자 염료는 세포질을 분획하는 멤브레인을 염색하지 않고, 선택적으로 세포질(시토졸)내로 침투하여 소포체만을 선택적으로 염색하여 이를 형광 발광시켜야 한다. 하지만, 기존의 시토졸을 영상화하기 위한 이광자 염료는 시토졸 뿐만 아니라 멤브레인까지 염색시킴으로써 오-표적화(mis-targeting)라는 문제를 발생시킨다. 따라서, 산성 조건에 놓여진 시토졸 내의 소포체만을 선택적으로 염색하고, 이를 영상화할 수 있는 이광자 염료의 개발은 절실한 상황이다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 과제는 산성 조건의 소포체를 영상화할 수 있는 이광자 염료를 제공하는 데 있다.

본 발명의 두 번째 과제는 상기 이광자 염료를 이용한 산성 조건의 소포체를 영상화하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 상기 첫 번째 과제를 해결하기 위하여 하기 화학식 1의 구조를 가지는 생체 내 산성 소포체의 영상용 이광자 염료를 제공한다.

(상기 식에서, R₁은 수소 또는 메톡시임)

상기 이광자 염료는 780nm의 파장대의 빛에 의하여 여기될 수 있는데, 이때 86 내지 88GM의 이광자 동작 단면적(Φδ)을 갖는다.

본 발명에 따른 상기 이광자 염료는 형상화하고자 하는 세포의 pH가 낮을수록 높은 형광 강도의 이광자 방출 스펙트럼을 나타내며, 또한 상기 이광자 염료의 물에 대한 용해도는 5.0μM 이상이고, 본 발명에 따른 상기 이광자 염료의 pK_a는 4 내지 5이다.

또한 본 발명에 따른 생체 내 산성 소포체의 실시간 영상용 이광자 염료는 용매의 극성이 커질수록 흡수 스펙트럼이 장파장, 즉 적색파장 쪽으로 이동한다.

본 발명은 상기 두 번째 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에 따른 생체 내 산성 소포체의 실시간 영상용 이광자 염료를 영상화하고자 하는 세포질 내로 주입하는 단계; 및 상기 이광자 염료로부터 방출되는 이광자 여기 형광 영상을 관찰하는 단계를 포함하는 생체 내 산성 소포체의 영상화 방법을 제공한다.

본 발명의 이광자 염료는 산성 조건에서 효과적으로 살아있는 세포 및 조직과 결합하여 높은 강도의 이광자 여기 형광 영상을 발생시킬 수 있으므로, 산성 소포체의 영상화가 가능하고, 이를 이용한 효과적인 실시간 모니터링 또한 가능하다.

본 발명은 산성 조건의 세포 또는 조직의 실시간 영상화를 위하여, 상기 화학식 1의 화합물을 생체 내 산성 소포체의 실시간 영상용 이광자 염료로 제공한다.

여기에서, 상기 구조중 아닐린 구조 또는 아닐린 유도체는 형광물질과의 아미드 결합을 통하여 이광자 염료의 양자 결합 부위를 제공하고, 상기 이광자염료의

는 형광 부위(발광단)를 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 이광자염료는 양자(H⁺)가 존재하는 산성 조건에서 양자가 결합되는 부위(아닐린 및 그 유도체)를 포함하고 있으므로, 다양한 pH조건에도 불구하고 동일한 파장 대의 발광 스펙트럼을 갖게 한다. 더 나아가, 본 발명에서 양자 결합부위를 제공하는 상기 아닐린 구조 또는 o-메톡시-치환 아닐린 구조는 광유도 전자-수송효과에 의하여 상기 화합물의 이광자 형광 강도를 증가시키게 되는데, 그 결과 산성 소포체의 실시간 영상을 보다 선명하게 얻을 수 있다.

더 나아가, 상기 구조의 이광자 염료는 상대적으로 적은 분자량을 가지므로 종래의 이광자염료와 같이 멤브레인을 염색시키지 않고, 시토졸에 존재하는 소포체만을 선택적으로 염색하므로, 오-표적화(mis-targeting) 등의 문제없이 소포체만을 선명하게 형광시켜, 이를 영상화할 수 있게 한다.

또한, 본 발명에 다른 이광자염료는 pK_a가 4 내지 5인데, 이는 본 발명에 따른 이광자 염료의 형광 적정 곡선의 평형점이 pH 4.0 부근에서 형성되는 것을 의미한다. 따라서 본 발명에 따른 이광자 염료는 pH 4.0미만의 산성 조건에서 뚜렷하고, 강한 형광을 나타낼 수 있으며, 이는 하기 실험예에서 보다 상세히 설명된다.

본 발명에 따른 상기 이광자 염료는 780nm의 파장대의 빛에 의하여 여기될 수 있는데, 이는 종래의 350 내지 550nm의 빛에 의하여 여기되는 형광물질에 비하 여 상당한 수준의 장파장이라 할 수 있다. 따라서, 이러한 장파장에 의한 여기는 본 발명에 따른 이광자 염료가 보다 깊은 투과깊이에서 세포를 영상화하여 사용자가 실시간으로 모니터링할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 이러한 투과깊이(250㎛)의 상승은 본 발명에 따른 산성 소포체의 실시간 영상용 이광자 염료가 갖는 중요한 효과 중 하나이다.

또한, 본 발명에 따른 이광자 염료는 780nm에서 여기될 때 86 내지 88GM의 이광자 동작 단면적(Φδ)을 가지는데, 이는 종래의 10GM 수준의 이광자 동작 단면적에 비하여 상당히 높은 수준이며, 이는 하기 비교예를 통하여 상세히 설명된다.

산성 소포체의 실시간 영상용 이광자 염료로서 본 발명에 따른 상기 이광자 염료는 영상화하고자 하는 세포의 pH가 낮을수록 높은 형광 강도의 이광자 방출 스펙트럼을 나타낸다. 따라서, pH가 낮은 소포체(pH 4-5)의 경우 매우 높은 형광 강도의 이광자 형광 이미지를 얻을 수 있으며, 따라서 본 발명에 따른 이광자 염료는 산성 소포체의 실시간 영상용 이광자 염료로서 최적의 조건을 제공한다.

더 나아가, 본 발명에 따른 상기 이광자 염료는 물에 대하여 용해도는 5.0μM 이상의 용해도를 가지며, 따라서 본 발명에 따른 이광자 염료는 세포를 충분한 수준으로 염색할 수 있다.

또한, 상기 이광자 염료는 용매의 극성이 커질수록 흡수 스펙트럼이 적색파장쪽으로 이동하는 특징이 있는데, 이것은 산성이 강한 조건에서 파장의 장파장으로 이동하는 것을 의미하며, 상술한 바와 같이 장파장으로의 이동은 보다 깊은 투과깊이를 가지는 것을 의미하며, 이는 극성이 강한 산성조건에서 본 발명에 따른 산성 소포체의 실시간 영상용 이광자 염료가 보다 깊은 투과깊이를 갖게 하는 특성 중 하나이다.

상기 두 번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 상기 이광자 염료를 영상화하고자 하는 세포질 내로 주입하는 단계; 및 상기 이광자 염료로부터 방출되는 이광자 여기 형광 영상을 관찰하는 단계를 포함하는 생체 내 산성 소포체의 영상화 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 영상 방법은 종래의 기술에 비하여 표면으로부터 깊이 존재하는 세포의 영상까지 얻을 수 있고, 산성 조건에서는 높은 형광강도로 이미지를 얻을 수 있으므로, 정확한 세포 모니터링이 가능하다는 장점을 갖는다.

이하, 실시예 및 도면 등을 이용하여 보다 상세히 설명한다. 하지만, 하기의 실시예 등은 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 정의하거나 한정하지 않는다.

실시예 1

이광자 염료의 제조

6-아세틸-2-[N-메틸-N-(카르복시메틸)아미노]나프탈렌(0.2g, 0.78), N, N'-디시클로헥실카르보디이미드(0.18g, 0.86mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸(0.13g, 0.94mmol)의 혼합물을 CH₂Cl₂(20mL)에서 30분간 교반하였다. 이 혼합물에 p-페닐렌디아민·2HCl(0.50g, 2.72mmol) 및 CH₂Cl₂(5ml)의 Et₃N(0.16g, 1.56mmol)을 첨가하 여 질소 조건하에서 3시간동안 교반하였다. 얻어진 혼합물을 여과한 후, 여과물을 포화 NaHCO₃ ₍aq)로 추출하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켜 여과한 후 진공 내에서 농축하였다. CHCl₃/MeOH(10:1)을 용리액(eluent)으로 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 이용, 얻어진 생성물을 정제하여 본 발명에 따른 이광자 염료를 제조하였다.

수득: 0.13 g (수율 47%)

mp: 218℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): d 8.37 (d, 1H, J=2Hz), 8.04 (s, 1H), 7.99 (dd, 1H, J=9, J=2Hz), 7.89 (d, 1H, J=9Hz), 7.72 (d, 1H, J=9Hz), 7.24 (d, 2H, J=9Hz), 7.17 (dd, 1H, J=9, J=2 Hz), 7.07 (d, 1H, J=2Hz), 6.64 (d, 2H, J=9Hz), 4.12 (s, 2H), 3.62 (br s, 2H), 3.25 (s, 3H), 2.69 (s, 3H);

¹³C NMR (100 MHz, DMSO d ₆): d 197.7, 167.8, 150.2, 145.6, 137.8, 131.3, 131.1, 130.8, 128.6, 126.6, 125.3, 124.7, 121.7, 116.9, 114.8, 114.4, 105.5, 56.0, 27.1 ppm;

C₂₁H₂₁N₃O₂에 대한 계산 분석값: C, 72.60; H, 6.09; N, 12.10. 확인값: C, 72.78; H, 6.21; N, 12.39.

실시예 2

이광자 염료의 제조

공지된 방법에 따라 제조된 2-히드록시-4-니트로페닐카르밤산 tert-부틸 에스테르(3.0g, 11.8mmol), K₂CO₃ ₍2.5g 17.7mmol), n-Bu₄NI(0.87g, 2.4mmol) 및 MeI(1.8g, 23.6mmol)의 혼합물을 드라이 아세톤(50mL)에서 20시간 동안 질소 조건하에서 환류시켰다. 냉각 후 반응 혼합물을 100mL의 혼입시킨 후, 여과하여 수집하고, 다시 물(100mL) 및 헥산(100mL)로 세척하여 중간 생성물 (1)을 얻었다.

수득: 2.5g(수율80%)

mp: 117℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): d 8.27 (d, 1H, J=9Hz), 7.91 (dd, 1H, J=9, J=2Hz), 7.73 (d, 1H, J=2Hz) 7.36 (s, 1H), 3.98 (s, 3H), 1.54 (s, 9H)

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): d 152.2, 147.0, 134.9, 118.3, 116.4, 105.5, 105.2, 81.9, 56.4, 28.6 ppm

C₁₂H₁₆N₂O₅에 대한 계산 분석값: C, 53.73; H, 6.01; N, 10.44. 확인값: C, 53.98; H, 5.89; N, 10.59)

이후, 상기 중간 생성물 (1)과 Pd/C (Pd 10%, 0.16g, 1.6mmol)를 혼합한 후 에탄올(50mL)에서 5시간 동안 수소 조건하에서 교반하여 혼합한 다음, 반응 혼합물 을 여과시키고 뜨거운 에탄올로 세척한 후, 용매를 진공 내에서 제거하여 중간 생성물 (2)를 얻었다.

수득: 1.7 g (95 %)

¹H NMR (300 MHz, DMSO d ₆): d 7.54 (s, 1H), 7.03 (d, J=9Hz, 1H), 6.23 (d, 1H, J=2Hz), 6.07 (dd, 1H, J=9, J=2Hz), 4.93 (br s, 2H), 3.67 (s, 3H), 1.41 (s, 9H)

¹³C NMR (100 MHz, DMSO d ₆): d 154.4, 147.3, 116.4, 106.0, 105.7, 98.6, 98.2, 78.7, 55.7, 28.7 ppm

C₁₂H₁₈N₂O₃에 대한 계산 분석값: C, 60.49; H, 7.61; N, 11.76. 확인값: C, 60.88; H, 7.46; N, 11.78)

다음, p-페닐렌디아민 대신 중간 생성물(2)를 사용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 중간 생성물 (3)을 얻었다. 이후, 얻어진 중간 생성물(3)을 트리플루오로아세트산에서 0℃로 용해시키고, 이 용액을 2시간 동안 교반하고, 톨루엔을 첨가한 다음, 용액을 증발시켜 본 발명에 따른 또 다른 이광자 염료를 제조하였다.

수율: 98%

mp: 157℃

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): d 8.39 (d, 1H, J=2Hz), 7.86 (dd, 1H, J=9, J=2Hz), 7.85 (d, 1H, J=9Hz), 7.65 (d, 1H, J=2Hz), 7.64 (d, 1H, J=9Hz), 7.28 (d, 1H, J=9 Hz), 7.24 (dd, 1H, J=9, J=2Hz), 7.22 (dd, 1H, J= 9, J=2Hz), 7.01 (d, 1H, J=2Hz), 4.34 (s, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.32 (br s, 2H), 3.26 (s, 3H), 2.64 (s, 3H)

¹³C NMR (100 MHz, DMSO d ₆): d 198.0, 168.8, 159.7, 159.5, 159.3, 159.0, 150.2, 137.8, 131.3, 131.1, 130.8, 126.6, 125.3, 124.6, 119.8, 116.8, 112.1, 105.5, 104.0, 56.7, 56.2, 27.0 ppm

C₂₂H₂₃N₃O₃에 대한 계산분석값: C, 70.01; H, 6.14; N, 11.13. 확인값: C, 70.18; H, 6.54; N, 11.03.

실험예 1

물 용해도 측정

상기 실시예 1 및 2의 이광자염료를 DMSO에 용해시켜 스톡 용액(1.0 x 10^-3M)을 준비하였다. 용액을 6.0 x 10^-3 ∼ 6.0 x 10^-5M까지 희석시키고, 마이크로 주사기를 이용하여 3.0ml의 물을 함유하는 큐벳에 첨가하였다. 모든 경우 물에서의 DMSO 농도를 0.2%로 유지하면서, 염료농도에 대한 형광강도를 측정하여, 실시예 1의 이광자 염료에 대한 측정결과는 도 1a 및 1c에 나타내었고, 실시예 2의 이광자 염료에 대한 측정결과는 도 1b 및 1d에 나타내었다.

도 1a 및 1b를 참조하면, 실시예 1 및 2의 이광자 염료의 농도가 증가할 수록, 모든 파장대에서 형광강도가 커지는 것을 알 수 있다.

도 1c 및 1d는 이광자 염료의 농도증가에 따른 형광강도 증가의 프로파일을 나타낸다.

도 1c 및 1d를 참조하면, 본 발명에 따른 이광자 염료는 염료 농도가 일정수준에 이를 때까지 형광 강도가 선형으로 증가하지만, 일정수준을 넘는 경우 아래쪽으로 기울어지는 완만한 곡선 프로파일을 나타낸다.

따라서, 본 발명에 따른 이광자 염료의 용해도는 선형의 프로파일을 나타내는 농도로 계산하였고, 계산 결과 상기 실시예 1, 2의 용해도는 각각 5.0, 9.0μM로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 이광자 염료가 세포를 염색하기에 충분한 수준의 용해도를 갖는다는 것을 의미한다.

실험예 2

용매 극성에 따른 특성(적색파장 이동) 분석

실시예 1 및 2의 이광자염료가 1,4-디옥산, DMF, EtOH 및 H₂O이라는 용매 조건에서 가지는 흡수 스펙트럼을 Hewlett-Packard 8453 다이오드 어레이 스펙트로포 토미터 상에서 기록하였고, 또한 동일 조건에서의 형광 스펙트럼을 Amico-Bowman series 2 루미네센스 스펙트로미터(luminescence spectrometer)를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 2a 내지 2d에 나타내었다.

도 2a 내지 2d를 참조하면, 본 발명에 따른 실시예 1 및 2의 이광자 염료는 용매의 극성이 증가하는 순서에 따라 흡수 및 형광 스펙트럼 모두 적색파장 이동(bathochromic shift)을 보여준다. 이를 상세히 설명하면, H₂O>EtOH>DMF>디옥산의 순서로 본 발명의 이광자 염료는 적색파장 이동을 나타내며, 이로부터 산성조건과 같은 극심한 극성조건에서도 본 발명에 따른 이광자 염료가 장파장의 빛을 흡수하여 여기될 수 있다는 것을 알 수 있다.

실험예 3

대식세포에 대한 이광자 현미경 이미지

실험예 3-(1)

본 발명에 따른 실시예 2의 이광자염료로 표지화된 대식세포에 대한 이광자 현미경 이미지를 얻은 후, 이를 도 3a 내지 3d에 나타내었다.

종래의 연구에서 시토졸 염색 이광자 염료는 500-620nm 및 360-460nm의 파장영역에서 이광자 여기 형광을 발광하는 것으로 보고되었으며, 이것은 각각 시토졸 및 멤브레인에 결합한 염료에 기인하는 것이었다. (H. M. Kim, C. Jung, B. R. Kim, S.Y. Jung, J. H. Hong,Y.G. Ko, K. J. Lee, B. R. Cho, Angew . Chem . Int . Ed . 2007, 46, 3460-3463; H. M. Kim, B. R. Kim, J. H. Hong, J.S. Park, K. J. Lee, Cho, B. R. Angew . Chem . Int . Ed . 2007, 46, 7445-7448). 이와 같이 멤브레인에 일부 결합하여 이를 형광 발광시키는 종래의 이광자염료는 시토졸의 소포체만을 영상화하고자 할 때 오표적화라는 문제를 야기시키며, 이는 결국 정확한 소포체의 영상화를 방해하게 된다.

반면, 도 3a 및 도 3b를 참조하여 본 발명의 실시예 2의 이광자염료로 표지화된 대식세포를 살펴보면, 본 발명에 따른 이광자 염료는 500-620nm에서 이광자 여기 형광을 발광시키고 있으나(도 3b), 멤브레인에 결합된 염료에 기인한 360-460nm 파장대의 이광자 여기 형광 이미지는 얻을 수 없었다(도 3a).

또한, 도 3b에 나타난 강한 적색 이미지가 실제 산성 소포체를 영상화하는 지를 확인하기 위하여, 대식세포를 종래의 알려진 일광자 현미경 표지자인 LysoTracker Red(LTR)로 염색한 후, 일광자 형광 이미지를 얻은 후(도 3c), 얻어진 두 이미지(도 3b, 3c)를 함께 중첩시켰다. 중첩된 이미지는 도 3d에 나타나는데, 도 3d를 참조하면, 두 염료로 염색한 후 얻어진 이미지(도 3b, 3c)는 서로 일치하는 것을 알 수 있으며, 이러한 결과는 본 발명에 따른 이광자 염료가 산성 소포체를 정확하게 영상화하는 것을 나타낸다.

실험예 3-(2)

실시예 2의 이광자 염료 대신 실시예 1의 이광자 염료를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실험예 3-(1)과 동일한 방법으로 산성 소포체를 영상화하였고, 이를 도 4a 내지 4d에 나타내었다

도 4a 내지 4d를 참조하면, 실시예 1의 이광자염료로 표지화된 대식세포는 500-620nm에서 이광자 여기 형광을 발광하는 것을 알 수 있으며(도 4b), 멤브레인에 결합된 염료에 기인한 360-460nm 파장대의 이광자 여기 형광 이미지는 얻을 수 없었다(도 4a).

또한, 도 4b에 나타난 강한 적색 이미지가 실제 산성 소포체를 영상화하는 지를 확인하기 위하여, 종래의 알려진 일광자 현미경 표지자인 LysoTracker Red(LTR)로 대식세포를 염색한 후, 일광자 형광 이미지를 얻은 후(도 4c), 얻어진 두 이미지(도 4b, 4c)를 함께 중첩시켰다. 중첩된 이미지는 도 4d에 나타나는데, 도 4d를 참조하면, 두 염료로 염색한 후 얻어진 이미지(도 4b, 4c)는 서로 일치하는 것을 알 수 있으며, 이러한 결과는 본 발명에 따른 실시예 1의 이광자 염료가 실시예 2의 이광자 염료와 동일하게 산성 소포체를 정확하게 영상화하는 것을 나타낸다.

또한, 360-460nm 파장대의 이광자 여기 형광 이미지를 얻을 수 없는 상기 결과는 본 발명에 다른 이광자 염료가 멤브레인이 아닌 시토졸 분획조직(compartment)에 대부분 존재하여 산성 소포체를 선택적으로 영상화하는 것을 의미하고, 아마도 이것은 멤브렌인을 통과하여 시토졸로 유입될 수 있는 이광자 염료의 낮은 분자량에 기인하는 것으로 판단된다. 따라서, 본 발명에 따른 이광자 염료는 상술한 바와 같이 멤브레인과의 결합 및 이를 염색함으로써 발생하는 오-표적화(mis-targeting)없이 정확하게 산성 소포체만을 염색하여, 이를 영상화하므로 사 용자가 산성 소포체를 명확하게 모니터링할 수 있게 한다.

실험예 4

2일된 쥐의 해마로부터 채취한 세포조직을 준비하고, 400㎛의 두께로 잘랐다. 이후 상기 조직을 실시예 2의 이광자염료(10-20μM)로 30분간 37℃에서 인큐베이션하였다.

다음 상기 조각을 세정하고, 하부에 유리를 가진 접시에 옮긴 후 상기 조각에 대한 이광자 여기 형광 영상을 얻었다.

도 5a 및 5b는 본 실험예에서 얻은 이광자 여기 형광 영상의 이미지이다.

도 5a를 참조하면, 10배율로 확대한 상기 이미지의 밝은 부분은 CA1 및 CA3 영역뿐만 아니라, 해마 치아이랑(dentate gyrus, DG)을 보여준다.

도 5b에서는 z축을 기준으로 ∼100 내지 250㎛의 깊이로 얻어진 상기 조직의 이광자 현미경 이미지(10배율) 40개를 중첩시켰다. 상기 결과로부터 동일 영역에서 산성 소포체의 평균적인 분포를 알 수 있다.

도 5c는 각기 100 내지 250㎛의 깊이로 측정한 이광자 여기 형광 영상의 이미지이다. 도 5c를 참조하면, 본 발명의 이광자 염료에 의하면 250㎛의 두께까지 이광자 여기 형상의 이미지를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다.

실험예 5

pH 조건에 따른 이광자염료의 특성분석

범용 완충액(0.1M 시트르산, 0.1M KH₂PO₄, 0.1M Na₂B₄O₇, 0.1M Tris, 0.1M KCl 10mM)에서 본 발명의 상기 실시예 1, 2에서 제조된 이광자 염료를 함유하는 용액의 pH를 서서히 감소시켰다. 이때 일광자 흡수 및 방출 스펙트럼을 측정하여 도 6a 내지 6d에 나타내었다.

도 6a 내지 6d를 참조하면, 산성이 강할수록 흡수 스펙트럼의 변화없이 단순히 방출되는 형광 강도만이 증가하는 것을 알 수 있는데, 이러한 결과는 pH<4인 산성 조건에서 H⁺에 의한 양자화가 진행되는 경우, 본 발명에 따른 이광자 염료는 광유도 전자-수송 반응(photoinduced electron-transfer process)에 의하여 강한 형광강도를 나타내기 때문으로 판단된다.

또한, 본 실험예에서 pH변화에 따른 이광자 염료의 형광 강도를 측정한 후, 이를 적정곡선 형태로 도 7에 나타내었는데, 도 7에서 Y-축은 형광 강도 증가 인자로 [(F-F_o)/F_o]이며, 여기에서 F는 형광강도, F_o는 최소 형광강도이다.

도 7을 참조하면, 본 발명의 실시예 1 및 2의 이광자 염료는 모두 pH 4 내지 5의 부근에서 모두 급격한 형광 강도의 증가를 나타낸다. 특히, 실시예 2의 형광강도의 변화가 가장 컸는데, 그 이유는 메톡시-치환 아닐린이 비치환된 아닐린보다 더 큰 광유도-전자 수송효과를 발생시키기 때문으로 판단되며, 이는 하기 설명되는 양자 결합부위와 발광부위가 갖는 HOMO에너지 차이에 기인한다.

도 8은 본 발명에 따른 발광단과 양자 결합단의 HOMO 준위를 나타내는 계산 에너지 준위이다.

도 8을 참조하면, 메톡시가 오르쏘 위치에 치환된 아닐린은 -4.827eV의 HOMO 에너지를 나타내지만, 치환되지 않은 아닐린은 -5.044eV의 에너지 준위를 나타낸다. 발광부위인

는 -5.146eV를 나타내며, 이 수치는 치환되지 않은 아닐린 구조가 갖는 에너지 준위에 가깝다. 따라서, 발광단보다 더 높은 HOMO 에너지 준위를 갖는 오르쏘-아닐린기가 양자화될 때에 더욱 큰 에너지를 발하면서 안정화될 수 있으며, 이는 결국 강한 형광 강도로 나타난다.

실험예 6

pK _a 값 분석

또한, 상기 pH의 변화에 따른 형광강도를 이용하여, pK_a를 하기 수학식 1에 의하여 계산하였다.

log[(I_max-I)/(I-I_min)]=pH-pK_a

상기 식에서, I는 형광강도, I_max는 최대, I_min은 최소 형광 강도를 나타낸다.

측정된 형광강도를 기초하여 pK_a를 계산한 결과, 실시예 1의 경우 4.42±0.03이었고, 실시예 2의 경우 4.18±0.01였다. 이것은 본 발명에 따른 이광자 염료 의 형광 적정 곡선(도 7)의 변곡점(평형점)이 pH 4.0 부근에서 형성되는 것을 의미하며, 따라서 본 발명에 따른 이광자 염료가 pH 4.0미만의 산성 조건에서 우수한 형광강도를 나타낸다는 것을 나타낸다.

실험예 7

이광자 염료의 흡수

도 9는 본 발명의 실시예 2의 이광자 염료( 5μM)가 갖는 형광 강도 대비 입사레이저 파워(I_o)의 그래프이다.

도 9를 참조하면, 입사된 레이저 파워에 대하여 형광강도는 제곱으로 비례하며, 이러한 결과로부터 본 발명에 따른 이광자 염료는 조사되는 입력광에 대한 비선형적인 흡수도를 갖는다는 것을 알 수 있다. 또한, 도 9에 삽입된 작은 크기의 그래프는 형광강도 대비 입사레이저 파워의 제곱(I_o ²)의 관계를 나타내며, 상기 삽입된 그래프로부터 본 발명에 다른 이광자 염료의 형광강도는 입사레이저 파워 제곱에 비례하는 것을 알 수 있다.

비교 실험예

이광자 동작 단면적 및 흡수강도 측정

이광자 단면적(δ)을 펨토초(fs) 형광 측정 기술을 이용하여 측정하였다.

측정 방법을 살펴보면, 실시예 1, 2 및 비교대상으로서 종래의 알려진 표지 자인 LysoTracker Red(DND-99)를 5.0x 10^-6M의 농도에서 범용 완충액(pH=3.2)에 용해시킨 후, 이광자-유도 형광 강도를 740-940nm의 영역대에서 측정하는데, 이때 이광자 특성이 잘 알려진 플루오레세인(8.0 x 10^-5M, pH=11)을 기준염료로 하였다.

즉, 본 비교실험예에서 이광자 단면적의 측정을 위하여 기준염료 및 본 발명에 따른 샘플 염료의 이광자-유도 형광 스펙트럼의 강도를 측정한 후, 이광자 단면적(Two-photon cross-section)은 하기 수학식 2에 의하여 계산하였고, 여기에 양자효율을 곱한 값이 이광자 동작 단면적(Two-photon action cross-section)으로 계산하였다.

상기 식에서 하첨자인 s와 r은 샘플과 기준염료를 의미하며, δ는 구하고자 하는 이광자 단면적이고, 디텍터에 의해 수집된 신호의 강도를 S로 표시하고, 형광 양자효율을 Φ로 표시하였으며 φ는 실험장비의 전체 형광 수집효율을 의미한다. 또한, 용액 내 분자의 수밀도(number density)는 c로 표시하였다. δ_r은 기준염료 의 이광자 단면적을 의미한다.

도 10은 740nm 내지 940nm의 파장 범위에서 측정한 측정치를 기초하여 계산한 이광자 동작 단면적을 나타내는 그래프이다.

도 10을 참조하면, 본 발명에 따른 이광자 염료는 780nm의 파장대에서 가장 높은 이광자 동작 단면적을 가지며, 이는 각각 86과 88GM 수준이었다. 반면, 종래의 기술에 따른 LysoTracker Red(LTR)은 약 10GM 수준에 불과하므로, 결국 본 발명에 따른 이광자 염료는 종래의 이광자 염료에 비하여 무려 9배 이상의 높은 이광자 동작 단면적을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 이광자 염료가 갖는 높은 이광자 동작 단면적은 상술한 바와 같이 깊은 투과깊이로 산성 소포체를 효과적으로 염색하여, 이를 여기 형광시킨다.

도 1a 내지 1d는 본 발명의 실험예 1에 따른 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2a 내지 2d는 본 발명의 실험예 2에 따른 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3a 내지 3d는 본 발명의 실험예 3-(1)에 따른 결과를 나타내는 이미지이다.

도 4a 내지 4d는 본 발명의 실험예 3-(2)에 따른 결과를 나타내는 이미지이다.

도 5a 내지 5c는 본 발명의 실험예 4에 따른 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6a 내지 6d는 본 발명의 실험예 5에 따른 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7은 본 발명의 실험예 5에 따른 형광-pH 적정 곡선을 나타내는 그래프이다.

도 8은 본 발명에 따른 이광자 염료에서 발광단 및 양자 결합단의 HOMO 준위를 나타내는 도면이다.

도 9는 본 발명의 실험예 7에 따른 결과를 나타내는 그래프이다.

도 10은 본 발명의 비교 실험예에 따른 결과를 나타내는 그래프이다.

Claims

하기 식 1의 구조를 가지는 생체 내 산성 소포체 영상용 이광자 염료:

(1)

(상기 식에서, R₁은 수소 또는 메톡시임)
제 1항에 있어서, 상기 이광자 염료는 780nm의 파장대의 빛에 의하여 여기될 수 있으며, 이때 86 내지 88GM의 이광자 동작 단면적(Φδ)을 갖는 것을 특징으로 하는 생체 내 산성 소포체 영상용 이광자 염료.
제 1항에 있어서, 상기 이광자 염료는 영상화하고자 하는 세포의 pH가 낮을수록 높은 형광 강도의 이광자 방출 스펙트럼을 나타내는 것을 특징으로 하는 생체 내 산성 소포체 영상용 이광자 염료.
제 1항에 있어서, 상기 이광자 염료는 pK_a가 4 내지 5인 것을 특징으로 하는 생체 내 산성 소포체 영상용 이광자 염료.
제 1항에 있어서, 상기 이광자 염료의 물에 대한 용해도는 5.0μM 내지 9.0μM 인 것을 특징으로 하는 생체 내 산성 소포체 영상용 이광자 염료.
제 1항에 있어서, 상기 이광자 염료는 용매의 극성이 클수록 흡수 스펙트럼이 적색파장으로 이동하는 것을 특징으로 하는 생체 내 산성 소포체 영상용 이광자 염료.
제 1항에 있어서, 상기 이광자 염료는 250㎛의 투과깊이까지 산성 소포체를 영상화할 수 있는 것을 특징으로 하는 생체 내 산성 소포체 영상용 이광자 염료.
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