CN106987246B - 一种双光子荧光染料及其制备方法和用途 - Google Patents

一种双光子荧光染料及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双光子荧光染料及其制备方法和用途，其中双光子荧光染料是以咔唑作为母体，结构如下：本发明双光子荧光染料在较宽的浓度范围内，单光子和双光子荧光信号皆与荧光染料的浓度呈现出良好的线性关系。此外，双光子共聚焦荧光显微成像实验表明该荧光染料Lyso‑MCO和Lyso‑NCO对MCF细胞渗透性好，可以有效定位细胞中的溶酶体(定位系数分别为0.9475和0.9398)，适用于细胞中溶酶体的双光子荧光成像。与商品化溶酶体染料(Lysosome@Tracker Red)相比，双光子荧光染料Lyso‑MCO和Lyso‑NCO光稳定性更好。

Description

一种双光子荧光染料及其制备方法和用途
一、技术领域
本发明涉及一种双光子荧光染料及其制备方法和用途，以实现示踪和定位细胞中的溶酶体，具有单光子荧光量子产率高，斯托克斯位移大，有效双光子吸收截面大，溶酶体定位系数高，光稳定性好的优点。
二、背景技术
溶酶体是真核细胞中的一种酸性细胞器，构成了哺乳动物细胞的终端降解“车间”，内含多种水解酶，专司分解各种外源和内源的大分子物质。它们通过吞噬、内吞和自噬的途径接受和降解大分子，并且在多种生理过程中发挥重要的作用。为了深入了解它们的生理作用，各种溶酶体染料被开发，其中一些可商业购得。然而，这些染料大多都是单光子荧光染料。单光子荧光染料由于普遍存在激发光波长短(350-550nm)、穿透深度浅、光漂白和细胞自荧光等缺陷，因而限制了其在组织和活体成像中的应用。
克服这些问题首先需要可以在细胞和组织深处示踪溶酶体的双光子(TP)荧光染料，并借助双光子显微镜(TPM)实现该过程的可视化。TPM，它使用两个低能量的光子激发，是一种可以在一段较长的时间内可视化深处完整组织的新技术。双光子荧光染料具有很多单光子荧光染料所不具有的优点，如：细胞光毒性小，不会引起荧光自淬灭，时间空间分辨率高，组织渗透深度大，因而双光子荧光染料已经作为科学家们研究的一个重要课题。
确认一个生物活动是否发生在溶酶体中的最常见方法是利用荧光染料共定位实验，在共定位实验中，细胞被荧光染料标记用来识别特定的目标—溶酶体。为了能在双光子显微镜下进行这样的实验，特定识别溶酶体的双光子荧光染料是不可或缺的。
咔唑作为一种经典的荧光团，不仅具有大的共轭体系和共平面性能，而且具有良好的光稳定性。此外，由于聚乙二醇(PEG)链既可以增加水溶性，又可以作为溶酶体靶向基团。所以本发明以咔唑为荧光团，PEG链为溶酶体靶向基团开发了一种双光子荧光溶酶体染料。以PEG链为溶酶体靶向基团的咔唑基双光子荧光染料未见报道。
三、发明内容
本发明旨在提供一种双光子荧光染料及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计遴选合适的双光子荧光溶酶体染料结构，以实现示踪细胞中的溶酶体，并具有良好的双光子吸收性能和溶酶体定位效果，光稳定性好和细胞毒性小的优点。
本发明双光子荧光染料，是以咔唑为母体，分别简记为Lyso-MCO或Lyso-NCO，其结构式如下：
本发明双光子荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
1、中间体1的合成
在圆底烧瓶中加入3,6-二碘咔唑2.095g(5mmoL)、KOH 0.560g(10mmoL)、对甲苯磺酸三缩乙二醇单甲醚酯2.40g(Me(CH2CH2O)3OTs,7.55mmol)和DMF(30mL)后，充分搅拌溶解，室温下反应24小时，反应过程中TLC跟踪；反应结束后向反应液中加入水，然后用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，硅胶柱分离(洗脱液：石油醚/乙酸乙酯＝6/1，v/v)，得到淡黄色固体1.695g，即为中间体1，产率60.0％。
2、Lyso-MCO的合成
称取1.412g(2.5mmoL)中间体1、0.33g(2.5mmoL)4-甲氧基苯乙炔、5.6mg Pd(OAc)2、19.1mg CuI、26.2mg P(C6H5)3、30mL DMF以及6mL Et3N于烧瓶中，在N2保护下110℃反应2天，反应液过滤除去催化剂和不溶物，减压蒸馏除去DMF和Et3N，CH2Cl2萃取，硅胶柱分离(洗脱液为V(PE)/V(CH2Cl2)＝14:1)，收集得到淡黄色固体Lyso-MCO，1.023g，产率为71.2％。
3、Lyso-NCO的合成
称取1.412g(2.5mmoL)中间体1、0.36g(2.5mmoL)4-乙炔基-N,N-二甲基苯胺、5.6mgPd(OAc)2、19.1mg CuI、26.2mg P(C6H5)3、30mL DMF以及6mL Et3N于烧瓶中，在N2保护下110℃反应2天，反应液过滤除去催化剂和不溶物，减压蒸馏除去DMF和Et3N，CH2Cl2萃取，硅胶柱分离(洗脱液为V(PE)/V(CH2Cl2)＝13:1)，收集得到墨绿固体Lyso-NCO，1.14g，产率为76.2％。
本发明Lyso-MCO和Lyso-NCO的合成过程如下：
本发明双光子荧光染料的用途，是在活细胞成像时作为溶酶体示踪剂使用，检测方法如下：
将本发明双光子荧光染料Lyso-MCO或Lyso-NCO溶于DMSO中制得2mM的母液，取50μL的该母液于10mL容量瓶中，再用不同溶剂定容，配制成10μM的检测试剂。所用样品池为1.0×1.0cm的石英比色皿，所用测试使用的溶剂均已除水，测试温度皆为20～25℃。
本发明首先对双光子荧光染料在二甲亚砜DMSO溶剂中的的光物理性质做了研究，见图1。从图1中可以看出，化合物Lyso-MCO和Lyso-NCO的紫外最大吸收峰分别为318和328nm。分别以最大吸收波长为激发波长，它们的单光子荧光发射峰分别位于403nm和445nm(荧光量子产率分别为38.7％和42.5％)。化合物Lyso-MCO发蓝光，化合物Lyso-NCO发蓝绿光，Lyso-NCO较Lyso-MCO约有42nm的红移。这和紫外吸收光谱的变化规律一致，随着末端基团给电子能力的增强，荧光发射峰的红移程度也随之增大。在Lyso-MCO和Lyso-NCO浓度为0.5～10μM，可以观察到Lyso-MCO和Lyso-NCO分别在403nm和445nm处的荧光发射峰强度随着浓度的变化线性增强(图3)。接着本发明对双光子荧光染料在不同极性溶剂(甲苯Toluene，乙酸乙酯EA，四氢呋喃THF，丙酮Acetone，甲醇CH3OH，乙醇C2H5OH，N,N-二甲基甲酰胺DMF，二甲亚砜DMSO)中的的光物理性质做了研究。溶剂的极性大小通常由溶剂的介电常数(ε)来确定，本实验选取的溶剂按极性大小顺序为：DMSO(48.9)＞DMF(36.7)＞CH3OH(33.6)＞C2H5OH(24.3)＞Acetone(20.7)＞THF(7.58)＞EA(6.02)＞Toluene(2.37)。从图2和表2中可以看出，两种荧光染料都有明显的溶致变色效应，并且溶剂的极性对Lyso-NCO的单光子荧光发射光谱的影响较Lyso-MCO更显著。Lyso-NCO在不同溶剂中荧光发射峰位置的明显变化，其主要原因是由于Lyso-NCO的分子结构中含有强的给电子基团—二甲氨基，化合物分子表现出较强的电荷转移特征，更容易和大极性的溶剂之间发生溶剂效应导致的。
利用双光子诱导荧光测量技术，测试了浓度为10-3mol/L时目标化合物的双光子吸收截面，从图5可以看出，Lyso-MCO和Lyso-NCO的最大有效吸收截面(δФ)分别是20GM、43GM，双光子最大激发波长分别在690nm和700nm。在Lyso-MCO和Lyso-NCO浓度分别在0.2～1mM、0.01～1mM范围内，可以观察到Lyso-MCO和Lyso-NCO分别在418nm和493nm处的双光子荧光发射峰强度随着浓度的变化线性增强(图4)。
使用MTT技术对Lyso-MCO和Lyso-NCO的细胞毒性进行了测试，从图6可以看出，两者的细胞毒性很低，适用于细胞内示踪溶酶体。为了进一步证明荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的性能，我们研究了二者在细胞成像中的最佳浓度、最佳细胞培养时间、光稳定性和溶酶体定位系数测试。首先MCF细胞由DEME(invitrogen)培养液培养，成像前一天，MCF细胞放于激光共聚焦皿中，成像时MCF细胞分别和0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μM的荧光染料Lyso-MCO/Lyso-NCO的DMSO溶液于37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育30min，用中性的PBS缓冲溶液洗涤3次。使用双光子荧光共聚焦显微镜成像，设置绿色通道tracker1，激发波长为690nm，发射波段为380～420nm，这个通道用来接受染料分子Lyso-MCO发射的荧光。重设绿色通道tracker1，激发波长为700nm，发射波段为425～465nm，这个通道用来接受染料分子Lyso-MCO发射的荧光。从图7可以观察到，荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的在细胞成像中的最佳浓度为2.0μM。利用单一变量法，在相同实验条件下，我们用2.0μM荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO进行细胞成像，研究二者的最佳细胞培养时间。如图8和9所示，荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的最佳细胞培养时间皆为12min。与此同时，荧光染料的光稳定性也是取决其性能的关键指标。因此，在相同的实验条件下，我们用荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的最佳浓度培养细胞到最佳时间进行细胞成像，研究二者在不同时间点(0-20min)的光稳定性，即最长观察时间。从图10和11可以看出，荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的观察时间皆为20min，在10min时，商品化溶酶体染色剂Lysosome@Tracker Red的荧光发射强度几乎降低为0，而荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的荧光强度还有70％左右，这表明荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的光稳定性远胜于Lysosome@Tracker Red。从图12可以看出，荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的绿色通道与商品化溶酶体染色剂Lysosome@Tracker Red的红色通道之间图像重叠效果很好，并得到了很高的位置重合系数(定位系数分别为0.9475和0.9398)。这一结果表明：荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO能够成功地选择性定位细胞中的溶酶体。
本发明荧光染料分子结构简单，易于合成，双光子吸收性能好，快速灵敏，光稳定性好，细胞毒性小，能够有效实现示踪和可视化细胞内的溶酶体。
四、附图说明
图1是10μM的Lyso-MCO和Lyso-NCO在DMSO中归一化的紫外吸收光谱和荧光光谱。
图2是10μM的Lyso-MCO和Lyso-NCO在不同溶剂中归一化的紫外吸收光谱(a:Lyso-MCO,c:Lyso-NCO)和荧光光谱(b:Lyso-MCO,d:Lyso-NCO)。
图3是10μM的Lyso-MCO(a)和Lyso-NCO(b)在不同浓度(0.5～10μM)下的单光子荧光光谱，插图为单光子荧光发射峰强度随染料浓度变化的线性关系。
图4是Lyso-MCO(a,0.2～1mM)和Lyso-NCO(b,0.01～1mM)在不同浓度下的双光子荧光光谱，插图为双光子荧光发射峰强度随染料浓度变化的线性关系。
图5是Lyso-MCO和Lyso-NCO在DMSO中的有效双光子吸收截面数值。
图6是不同含量(0μM、5μM、10μM、15μM)的Lyso-MCO/Lyso-NCO的作用下的细胞存活率。
图7是MCF细胞与不同浓度的Lyso-MCO/Lyso-NCO染色后的荧光共焦显微镜成像；比例尺：10μM。
图8是MCF细胞与2.0μM的Lyso-MCO染色在不同的培养时间下的荧光共焦显微镜成像；比例尺：10μM。
图9是MCF细胞与2.0μM的Lyso-NCO染色在不同的培养时间下的荧光共焦显微镜成像；比例尺：10μM。
图10是MCF细胞与Lyso-MCO/Lysosome@Tracker Red光稳定性测试，在培养12min后在不同时间点(0-20min)荧光共焦显微镜成像。比例尺：10μM。
图11是MCF细胞与2.0μM的Lyso-NCO/Lysosome@Tracker Red光稳定性测试，在培养12min后在不同时间点(0-20min)荧光共焦显微镜成像。比例尺：10μM。
图12是2.0μM的Lyso-MCO和Lyso-NCO在MCF细胞中的溶酶体定位成像(图a、e是MCF细胞的明场，图b、f分别是2μM的Lyso-MCO和Lyso-NCO的成像，图c、g是2μM Lysosome@Tracker Red的成像，图d是b、c的叠加，图h是f、g的叠加。图d、h的插图分别为Lyso-MCO和Lyso-NCO与Lysosome@Tracker Red的的荧光强度相关性，即二者对应的绿色通道与红色通道的荧光强度相关性)。
五、具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步分析说明。
实施例1：化合物Lyso-MCO和Lyso-NCO的合成
1、中间体1的合成
在圆底烧瓶中加入3,6-二碘咔唑2.095g(5mmoL)、KOH 0.560g(10mmoL)、对甲苯磺酸三缩乙二醇单甲醚酯2.40g(Me(CH2CH2O)3OTs,7.55mmol)和DMF(30mL)后，充分搅拌溶解，室温下反应24小时，反应过程中TLC跟踪；反应结束后向反应液中加入水，然后用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，硅胶柱分离(洗脱液：石油醚/乙酸乙酯＝6/1，v/v)，得到淡黄色固体1.695g，即为中间体1，产率60.0％。
m.p.72.4-74.6℃。FT-IR(KBr,cm-1):2884,1474,1422,1292,1123,798.1H NMR(CDCl3,400MHz):δ(ppm)8.29(d,J＝1.6Hz,2H),7.70(d,J＝1.6Hz,1H),7.68(d,J＝1.6Hz,1H),7.22(d,J＝8.6Hz,2H),4.40(t,J＝5.6Hz,2H,CH2),3.81(t,J＝5.6Hz,2H,CH2),3.52–3.37(m,8H),3.33(s,3H,CH3)；13C NMR(CDCl3,100MHz):δ(ppm)139.76,134.50,129.21,124.03,111.32,81.94,77.37,77.25,77.05,76.73,71.84,70.99,70.63,70.56,69.33,59.05,43.48；HRMS(ESI,m/z):Calcd for C19H21I2NO3([M+H]+)565.9709,found 565.9689；Anal.Calcd for C19H21I2NO3:C 40.37,H 3.74,I 44.90,N 2.47,O 8.49；found C 40.58,H3.64,N 2.26.
2、Lyso-MCO的合成
称取1.412g(2.5mmoL)中间体1、0.33g(2.5mmoL)4-甲氧基苯乙炔、5.6mg Pd(OAc)2、19.1mg CuI、26.2mg P(C6H5)3、30mL DMF以及6mL Et3N于烧瓶中，在N2保护下110℃反应2天，反应液过滤除去催化剂和不溶物，减压蒸馏除去DMF和Et3N，CH2Cl2萃取，用硅胶柱分离(洗脱液为V(PE)/V(CH2Cl2)＝14:1)，收集得到淡黄色固体Lyso-MCO，1.023g，产率为71.2％。
m.p.123.5-125.4℃.FT-IR(KBr,cm-1):2870,2520,1604,1360,1246,1021.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)8.23(d,J＝0.8Hz,2H),7.62(d,J＝8.5,1.4Hz,2H),7.51(d,J＝8.7Hz,4H),7.41(d,J＝8.5Hz,2H),6.90(d,J＝8.8Hz,4H),4.47(t,J＝5.6Hz,2H,CH2),3.87(t,J＝5.8Hz,2H),3.84(s,6H,CH3),3.46(m,J＝8.7Hz,8H,CH2),3.33(s,3H,CH3)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm)159.36,140.50,132.92,129.58,123.81,122.58,115.93,114.41,114.01,109.30,89.11,87.70,77.35,77.24,77.04,76.72,71.84,71.02,70.66,70.58,69.37,59.02,55.32,43.53.HRMS(ESI,m/z):Calcd for C37H35NO5[M+H]+574.2611,found 574.2593；Anal.Calcd for C37H35NO5:C 77.47,H 6.15,N 2.44；found C 77.00,H6.11,N 2.26.
3、Lyso-NCO的合成
称取1.412g(2.5mmoL)中间体1、0.36g(2.5mmoL)4-乙炔基-N,N-二甲基苯胺、5.6mg Pd(OAc)2、19.1mg CuI、26.2mg P(C6H5)3、30mL DMF以及6mL Et3N于烧瓶中，在N2保护下110℃反应2天，反应液过滤除去催化剂和不溶物，减压蒸馏除去DMF和Et3N，CH2Cl2萃取，硅胶柱分离(洗脱液为V(PE)/V(CH2Cl2)＝13:1)，收集得到墨绿固体Lyso-NCO，1.14g，产率为76.2％。
m.p.145.2-147.6℃.FT-IR(KBr,cm-1):2884,2807,2207,1610,1512,1360,1130.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)8.22(s,2H),7.60(d,J＝8.5Hz,2H),7.46(d,J＝8.7Hz,4H),7.39(d,J＝8.5Hz,2H),6.69(d,J＝8.4Hz,4H),4.47(t,J＝5.6Hz,2H,CH2),3.86(t,J＝5.7Hz,2H,CH2),3.55(m,6H,CH2),3.41(t,J＝3.1Hz,2H,CH2),3.34(s,3H,CH3),2.99(s,12H,CH3)；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm)149.86,140.23,132.56,129.43,123.56,122.59,114.88,111.97,110.74,109.16,88.71,88.32,71.81,70.99,70.61,70.53,69.34,58.98,43.45,40.28.HRMS(ESI,m/z):Calcd for C39H41N3O3[M+H]+600.3250,found 600.3226；Anal.Calcd for C39H41N3O3:C 78.10,H 6.89,N 7.00；found C 78.05,H6.89,N 6.80.
实施例2：双光子荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO在DMSO中的光谱测试
将本发明双光子荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO分别溶于DMSO中制得1mM的母液，取100μL的该母液于10mL容量瓶中，再用不同溶剂定容，配制成10μM的检测试剂。从图1中化合物Lyso-MCO和Lyso-NCO的紫外最大吸收峰分别为318和328nm。Lyso-MCO和Lyso-NCO分别在318nm、328nm激发下，Lyso-MCO和Lyso-NCO的单光子荧光发射峰分别位于403nm和445nm(图1和表1)。化合物Lyso-MCO发蓝光，化合物Lyso-NCO发蓝绿光，Lyso-NCO较Lyso-MCO约有42nm的红移。这和紫外吸收光谱的变化规律一致，随着末端基团给电子能力的增强，荧光发射峰的红移程度也随之增大。在Lyso-MCO和Lyso-NCO浓度为0.5～10μM，可以观察到Lyso-MCO和Lyso-NCO分别在403nm和445nm处的荧光发射峰强度随着浓度的变化线性增强(图3)。
表1化合物Lyso-MCO和Lyso-NCO在不同溶剂中的紫外吸收和单光子荧光光谱数据
注：a为紫外最大吸收波长；b为单光子荧光发射光谱的最大发射波长；c为斯托克斯位移；d为最大摩尔吸光系数。
实施例3：Lyso-MCO和Lyso-NCO的的双光子吸收性能测试
利用双光子诱导荧光测量技术，测试了浓度为10-3mol/L时目标化合物的双光子吸收截面，从图5可以看出，Lyso-MCO和Lyso-NCO的最大有效吸收截面(δФ)分别是20GM、43GM，双光子最大激发波长分别在690nm和700nm。从图5中可以看出Lyso-NCO的双光子吸收性能比Lyso-MCO更好。在Lyso-MCO和Lyso-NCO浓度分别在0.2～1mM、0.01～1mM范围内，可以观察到Lyso-MCO和Lyso-NCO分别在418nm和493nm处的双光子荧光发射峰强度随着浓度的变化线性增强(图4)。
实施例4：细胞毒性测试
MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)实验是根据已报道的文献，做细胞毒性测试。分别在同一批MCF细胞中加入0，5，10，15μM的荧光染料分子，此条件是在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育24小时，根据细胞存活度的公式：细胞存活率％＝OD570(样品)/OD570(对照组)×100，可算得细胞存活率(图6)。从图6中我们可以看出，染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的浓度为10μM时，细胞存活率分别为83％、88％左右，当二者的浓度达到15μM时，细胞存活率仍然分别有约80％、85％，说明了本发明荧光染料分子的细胞毒性小，因此可以用来做细胞检测及跟踪溶酶体。
实施例4：光稳定性测试
MCF细胞由DEME(invitrogen)培养液培养，成像前一天，MCF细胞放于激光共聚焦皿中，成像时MCF细胞分别和2μM的荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的DMSO溶液于37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育12min，用中性的PBS缓冲溶液洗涤3次后，再往培养皿中分别加入0.5μM商品化溶酶体染色剂Lysosome@Tracker Red溶液继续孵育12min，用中性的PBS缓冲溶液洗涤3次。用双光子荧光共聚焦成像，设置绿色通道tracker1，激发波长为690nm，发射波段为380～420nm，这个通道用来接受染料分子Lyso-MCO在不同时间点(0-20min)发射的荧光。在相同测试条件下，重设绿色通道tracker1，激发波长为700nm，发射波段为425～465nm，这个通道用来接受染料分子Lyso-MCO在不同时间点(0-20min)发射的荧光。设置红色通道tracker2，激发波长为577nm，发射波长为580-600nm，这个通道用来接收商品化溶酶体染色剂Lysosome@Tracker Red发射的荧光。从图10和11可以看出，荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的最长观察时间皆为20min，在10min时，商品化溶酶体染色剂Lysosome@TrackerRed的荧光发射强度几乎降低为0，而荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的荧光强度还有70％左右，这表明荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的光稳定性远胜于Lysosome@Tracker Red。
实施例5：细胞溶酶体定位测试
MCF细胞由DEME(invitrogen)培养液培养，成像前一天，MCF细胞放于激光共聚焦皿中，成像时MCF细胞分别和2μM的荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的DMSO溶液于37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育12min，用中性的PBS缓冲溶液洗涤3次后，再往培养皿中分别加入0.5μM商品化溶酶体染色剂Lysosome@Tracker Red溶液继续孵育12min，用中性的PBS缓冲溶液洗涤3次。用双光子荧光共聚焦成像，设置绿色通道tracker1，激发波长为690nm，发射波段为380～420nm，这个通道用来接受染料分子Lyso-MCO发射的荧光。设置红色通道tracker2，激发波长为577nm，发射波长为580-600nm，这个通道用来接收商品化溶酶体染色剂Lysosome@Tracker Red发射的荧光。在相同测试条件下，重设绿色通道tracker1，激发波长为700nm，发射波段为425～465nm，这个通道用来接受染料分子Lyso-MCO发射的荧光。从图12可以看出，荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO的绿色通道与商品化溶酶体染色剂Lysosome@Tracker Red的红色通道之间图像重叠效果很好，并得到了很高的位置重合系数(定位系数分别为0.9475和0.9398)。这一结果表明：荧光染料Lyso-MCO和Lyso-NCO能够成功地选择性定位细胞中的溶酶体。

Claims (6)

1.一种双光子荧光染料，其特征在于其结构式为：
2.一种权利要求1所述的双光子荧光染料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)中间体1的合成
在圆底烧瓶中加入3,6-二碘咔唑2.095g、KOH 0.560g、对甲苯磺酸三缩乙二醇单甲醚酯2.40g和DMF 30mL，充分搅拌溶解，室温下反应24小时，反应过程中TLC跟踪；反应结束后向反应液中加入水，然后用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，硅胶柱分离，得到淡黄色固体即为中间体1；
(2)Lyso-MCO的合成
称取1.412g中间体1、0.33g 4-甲氧基苯乙炔、5.6mg Pd(OAc)2、19.1mg CuI、26.2mg P(C6H5)3、30mL DMF以及6mL Et3N于烧瓶中，在N2保护下110℃反应2天，反应液过滤除去催化剂和不溶物，减压蒸馏除去DMF和Et3N，CH2Cl2萃取，硅胶柱分离，收集得到淡黄色固体Lyso-MCO；
(3)Lyso-NCO的合成
称取1.412g中间体1、0.36g 4-乙炔基-N,N-二甲基苯胺、5.6mg Pd(OAc)2、19.1mg CuI、26.2mg P(C6H5)3、30mL DMF以及6mL Et3N于烧瓶中，在N2保护下110℃反应2天，反应液过滤除去催化剂和不溶物，减压蒸馏除去DMF和Et3N，CH2Cl2萃取，硅胶柱分离，收集得到墨绿固体Lyso-NCO。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中，硅胶柱分离时的洗脱液为石油醚/乙酸乙酯＝6/1，v/v。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中，硅胶柱分离时的洗脱液为V(PE)/V(CH2Cl2)＝14:1。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中，硅胶柱分离时的洗脱液为V(PE)/V(CH2Cl2)＝13:1。
6.一种权利要求1所述的双光子荧光染料的用途，其特征在于：所述双光子荧光染料在活细胞成像时作为溶酶体示踪剂使用。
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