CN104927836A - 一种对环境极性敏感的近红外荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对环境极性敏感的近红外荧光探针及其合成方法和应用，其结构式为：取化合物I和化合物II溶于乙酸酐中，加入乙酸钠，得混合液，反应；然后，将混合液倒入碳酸氢钠溶液中，得黑绿色不溶物；用二氯甲烷将所述黑色不溶物重新溶解，并过柱分离，得金绿色固体，即得目标物，其中，化合物I为部花菁缩合剂单醛，化合物II为苯甲酰二氟硼；该探针分子的最大紫外吸收和荧光发射波长都位于近红外区(>650nm)，具有适中的斯托克斯位移(>30nm)，有效地较低了自吸收，提高了成像的准确度。该探针分子对活细胞和线虫染色完成后无须进行其它探针必经的洗涤过程，直接进行共聚焦成像即可，大大简便了成像操作过程。

Description

一种对环境极性敏感的近红外荧光探针及其合成方法和应用

技术领域

本发明属于合成与技术领域，具体涉及一种对环境极性敏感的近红外荧光探针及其合成方法和应用。

背景技术

环境敏感性荧光探针在生物化学研究领域应用广泛，其荧光性质依赖于环境疏水性。该类型探针一般在水溶液中荧光强度较弱，在非极性溶剂中具有较高的荧光强度，如8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)和硫磺素T，或者在非极性溶剂中有更短的发射波长，如尼罗红染料。但是上述极性敏感性探针的激发和发射波长都在可见区，对生物体损伤相对较大，不利于长时间以及活体检测。细胞及生物样本中含有大量大分子蛋白以及多肽等物质，其疏水空腔极性较小，利于极性敏感性荧光探针的发光。

荧光成像技术已经发展成为动态监控活细胞及活体中生物分子事件的最重要手段。新型荧光成像传感器的发展极大地促进了细胞生物学以及医学诊断成像等的进步。近红外激发和发射(>650nm)的荧光探针被广泛用于生物成像领域，由于其对生物组织样品较低的光损伤、较深的组织穿透能力、较低的生物背景荧光干扰等优点，具有近红外激发和发射的有机荧光染料能够极大地提高荧光成像的精确度。因此，新型的近红外荧光探针的合成和发展是非常必要的，尤其是对极性具有超高灵敏度的近红外荧光探针的设计、合成还是非常具有挑战性的。

发明内容

本发明目的是提供一种对环境极性敏感的近红外荧光探针及其合成方法和应用，该荧光探针能够弥补目前近红外激发和发射，对极性敏感的荧光探针较少的状况。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

一种对环境极性敏感的近红外荧光探针，其结构式如下：

一种对环境极性敏感的近红外荧光探针的合成方法，步骤如下：

化合物I(部花菁缩合剂单醛)的合成：

吲哚碘盐和缩合剂(吲哚碘盐和缩合剂参照现有技术进行制备，比如：文献：Tang,B.；Yu,F.；Li,P.；Tong,L.；Duan,X.；Xie,T.；Wang,X.J.Am Chem.Soc.2009,131,3016-3023.)，溶于甲苯-乙酸混合液，110℃反应2h；反应完毕后，60℃减压浓缩30min除去溶剂，过柱分离得黑红色固体，即为化合物I。

化合物II(苯甲酰二氟硼)的合成：

苯甲酰丙酮溶于乙醚中，三氟化硼乙醚溶液(三氟化硼质量分数为47％)滴入上述混合液，40℃回流搅拌2h，反应完毕后，冷却至室温，抽滤得淡黄色粉末固体，即为化合物II。

荧光探针MCY-BF的合成：

取化合物I和化合物II溶于乙酸酐(分析纯，含量≥98.5％)中，加入乙酸钠，得混合液，反应；然后，将混合液倒入碳酸氢钠溶液中，得黑绿色不溶物；用二氯甲烷将所述黑色不溶物重新溶解，并过柱分离，得金绿色固体，即为目标物。

优选的，每毫升乙酸酐(分析纯，含量≥98.5％)中加入的化合物I、化合物II以及乙酸钠的物质的量分别为0.02-0.1mmol、0.04-0.18mmol和0.02-0.1mmol。

优选的，所述混合液的反应温度为50-80℃，反应时间为1-3h。

优选的，所述碳酸氢钠溶液中碳酸氢钠的质量分数为10-30％。

优选的，所述化合物I、化合物II、乙酸钠以及碳酸氢钠的物质的量之比为2-10:4-15:2-10:260-510。

优选的，每毫升二氯甲烷溶解0.05-0.1g黑色不溶物。

优选的，所述过柱分离所用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶液，二氯甲烷和甲醇的体积比为90-110:0.8-1.5。

所述近红外荧光探针在活细胞和线虫活体成像中应用。

本发明的有益效果是：

1、该探针分子的最大紫外吸收和荧光发射波长都位于近红外区(>650nm)，具有适中的斯托克斯位移(>30nm)，有效地较低了自吸收，提高了成像的准确度。

2、该探针分子对极性超级敏感，在水、二甲基亚砜、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺等大极性溶剂中荧光强度较低，量子产率较低；在甲苯、乙酸乙酯、三氯甲烷等小极性溶剂中荧光强度较强，量子产率较高。其在甲苯(介电常数ε＝2.37)中荧光强度是二甲基亚砜(DMSO，ε＝47.2)中的146倍。

3、该探针分子具有较高的摩尔消光系数(除水外，都大于60000M^-1·CM^-1)。

4、该探针分子对活细胞和线虫染色效果良好。染色时间较短(15min)，染色效率较高。

5、该探针分子对活细胞和线虫染色完成后无须进行其它探针必经的洗涤过程，直接进行共聚焦成像即可，大大简便了成像操作过程。

6、该探针分子对的合成步骤相对简单、产率较高、容易纯化。

附图说明

图1为本发明的荧光探针在常见的十种溶剂中的紫外吸收光谱图；

图2是本发明的荧光探针在常见的十种溶剂中的荧光发射谱图；

图3是本发明的荧光探针在人体肝细胞和肝癌细胞中的荧光成像图；

图4是本发明的荧光探针在线虫活体(线虫卵和成虫)中的荧光成像图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例一

化合物I的合成：

吲哚碘盐(0.63g,2mmol)和缩合剂(0.34g,2mmol)溶于甲苯30mL,乙酸10mL混合液，110℃反应2h；反应完毕后，60℃减压浓缩30min除去溶剂，过柱分离,洗脱剂为二氯甲烷：甲醇体积比50:1得黑红色固体0.42g，即为化合物I(产率60％)。

化合物II的合成：

苯甲酰丙酮(0.48g，3mmol)溶于乙醚15mL中，三氟化硼乙醚溶液1mL滴入上述混合液，40℃回流搅拌2h，反应完毕后，冷却至室温，析出大量粉末，抽滤得淡黄色粉末固体0.54g，即为化合物II(产率85％)。

在氩气保护下，将化合物I(0.341g，1mmol)和化合物II(0.315g,1.5mmol)溶于乙酸酐10mL，加入无水乙酸钠(0.082g，1mmol)，得混合液，60℃反应2h。反应完毕后,冷却至室温，将20mL质量分数为10％的碳酸氢钠溶液加入上述混合液，析出黑绿色不溶物，用二氯甲烷(10mL),将黑绿色不溶物重新溶解，用柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶液，二氯甲烷和甲醇的体积比为100:1，得金绿色固体0.315g(59％产率)，即为近红外荧光探针MCY-BF。

实施例二

在氩气保护下，将化合物I(0.171g，0.4mmol)和化合物II(0.158g,0.5mmol)溶于乙酸酐5mL，加入无水乙酸钠(0.041g，0.4mmol)，得混合液，55℃反应1h。反应完毕后,冷却至室温，将15mL质量分数为20％的碳酸氢钠溶液加入上述混合液，析出黑绿色不溶物，用二氯甲烷(8mL)将黑绿色不溶物重新溶解，用柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶液，二氯甲烷和甲醇的体积比为90:1)，得金绿色固体0.12g(45％产率)，即为近红外荧光探针MCY-BF。

实施例三

在氩气保护下，将化合物I(0.100g，0.29mmol)和化合物II(0.091g,0.43mmol)溶于乙酸酐10mL，加入无水乙酸钠(0.021g，0.26mmol)，得混合液，80℃反应3h。反应完毕后,冷却至室温，将10mL质量分数为30％的碳酸氢钠溶液加入上述混合液，析出黑绿色不溶物，用二氯甲烷(5mL)将黑绿色不溶物重新溶解，用柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶液，二氯甲烷和甲醇的体积比为110:1)，得金绿色固体0.063g(40％产率)，即为近红外荧光探针MCY-BF。

熔点、红外、核磁及质谱表征

探针熔点(m.p.):250-253℃

红外吸收特征峰(IR):V_C-H＝2930cm^-1，V_B-O＝1150cm^-1

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):1.289(t,J＝4.4Hz,3H),1.654(s,6H),1.860(m,2H),2.509-2.570(m,4H),3.770(q,J＝4.4Hz,2H),5.582(d,J＝8.8Hz,1H),6.122(d,J＝9.6Hz,1H),6.489(s,1H),6.580(d,J＝11.2Hz,1H),6.740(d,J＝5.6Hz,1H),6.983(t,J＝4.8Hz,1H),7.517(t,J＝5.2Hz,1H),7.556(t,J＝4.8Hz,1H),7.833(d,J＝8.8Hz,1H),7.994(d,J＝5.2Hz,2H),8.041(t,J＝5.2Hz,2H),8.542(d,J＝9.6Hz,1H)¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):11.34,21.13,26.19,27.00,28.29,37.42,47.05,94.14,97.51,97.55,105.10,107.24,117.10,121.58,121.99,124.82,127.08,127.10,128.22,129.50,132.89,133.67,133.70,134.92,138.64,139.80,143.20,145.83,162.96,177.82,180.15HR-MS m/z calcd for C₃₁H₃₁BF₂ClNO₂[M+H]⁺534.2183,found 534.2172

效果实验

MCY-BF在常见的十种溶剂中的紫外吸收和荧光发射实验：

MCY-BF(储备液1mM)，分别加入十种不同溶剂(二甲基亚砜、水、甲醇、N、N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯)稀释，使其最终浓度为10μM，测量其紫外吸收。然后分别以其最大吸收为激发波长，测量其荧光发射光谱图，MCY-BF在十种溶剂中最大吸收和发射谱图分别显示于图1和图2中。可以看出其最大吸收和发射波长都在近红外区(>650nm)，并且它具有适中的斯托克斯位移(>30nm)。由图2可以看出MCY-BF对极性超级敏感，随着溶剂极性降低，其荧光强度明显升高，在甲苯(介电常数ε＝2.37)中荧光强度是二甲基亚砜(DMSO，ε＝47.2)中的146倍，量子产率在非极性溶剂中也有明显增加，如表1所示。

表1

MCY-BF对活细胞和线虫活体染色成像实验：

将人体肝细胞HL7702和肝癌细胞HepG2在普通DMEM(葡萄糖含量1100mg/L)培养液培养，在培养液中分别加入100μM的探针PBS水溶液20μL，使探针最终浓度为10μM，在37℃孵育15分钟，然后将细胞带有探针孵育液直接进行激光共聚焦荧光成像。如图3所示，其中，A-D为人体肝癌细胞染色图，A为DAPI商品化染料染色细胞核荧光图,激发波长405nm，收集荧光410-500nm，B为本专利探针染色细胞荧光图，激发波长633nm，收集荧光700-800nm，C为A和B图叠加，D为细胞明场图；E-H为人体肝细胞染色图，E为DAPI商品化染料染色细胞核荧光图，激发波长405nm，收集荧光410-500nm，F为本专利探针染色细胞荧光图，激发波长633nm，收集荧光700-800nm，G为E和F图叠加，H为细胞明场图。可以看出其对活细胞染色效果较好，由于其在水中基本无荧光，因此细胞背景较低。

线虫生长于附着有埃希氏杆菌的固体线虫培养基NGM中，在培养基中加入100μM的探针PBS水溶液100μL，使探针最终浓度为50μM，37℃中孵育15分钟，然后将线虫带有探针孵育液直接进行激光共聚焦荧光成像。如图4，A-C为线虫卵染色图，A为本专利探针染色荧光图，激发波长633nm，收集荧光700-800nm，B为卵明场图，C为A和B图叠加。D-F为线虫成虫染色图，D为本专利探针染色荧光图，激发波长633nm，收集荧光700-800nm，E为成虫明场图，F为D和E图叠加。可以看出其对线虫染色效果较好，基本无背景荧光。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种对环境极性敏感的近红外荧光探针，其结构式如下：

2.一种对环境极性敏感的近红外荧光探针的合成方法，步骤如下：取化合物I和化合物II溶于乙酸酐中，加入乙酸钠，得混合液，反应；然后，将混合液倒入碳酸氢钠溶液中，得黑绿色不溶物；用二氯甲烷将所述黑色不溶物重新溶解，并过柱分离，得金绿色固体，即得目标物，其中，化合物I为部花菁缩合剂单醛，化合物II为苯甲酰二氟硼。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：每毫升乙酸酐中加入的化合物I、化合物II以及乙酸钠的物质的量分别为0.02-0.1mmol、0.04-0.18mmol和0.02-0.1mmol。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述混合液的反应温度为50-80℃，反应时间为1-3h。

5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述碳酸氢钠溶液中碳酸氢钠的质量分数为10-30％。

6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述化合物I、化合物II、乙酸钠以及碳酸氢钠的物质的量之比为2-10:4-15:2-10:260-510。

7.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：每毫升二氯甲烷溶解0.05-0.1g黑色不溶物。

8.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述过柱分离所用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶液，二氯甲烷和甲醇的体积比为90-110:0.8-1.5。

9.权利要求1所述近红外荧光探针在活细胞和线虫活体成像中应用。