CN105223171A - 一种近红外磷光铱配合物的合成及其荧光检测成像应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磷光铱配合物的制备方法及其荧光检测应用。该磷光配合物的化学式为[Ir(CHO-btiq)₂(bpy)][PF₆]。本发明提供了该磷光铱配合物的制备方法，本发明还提供了该磷光铱配合物在检测半胱氨酸和高半胱氨酸中的应用。该磷光铱配合物的发射光谱位于近红外区域，生物成像中拥有光损伤小、组织穿透性强和背景自发荧光小的优点，在小动物活体荧光成像中具有良好的应用前景。本发明提供的铱配合物能够实现半胱氨酸和高半胱氨酸的高选择性检测，为构建一种简单、高选择性检测半胱氨酸和高半胱氨酸的荧光化学传感器提供了可能。

Description

一种近红外磷光铱配合物的合成及其荧光检测成像应用

技术领域

本发明属于氨基酸检测领域，更具体地，本发明涉及一种磷光铱配合物的合成及其用于含巯基的半胱氨酸和高半胱氨酸的检测，该种磷光铱配合物具有检测半胱氨酸和高半胱氨酸的有益效果。

背景技术

半胱氨酸(Cys)和高半胱氨酸(Hcy)是含巯基的氨基酸，属于人体中的硫醇，能够平衡生物体内的氧化还原反应，体内半胱氨酸和高半胱氨酸的含量与人体身体健康状况紧密相关。研究表明，半胱氨酸含量高低会影响人体生长速度，造成水肿、肝损伤等疾病。高半胱氨酸在新陈代谢和内稳态过程中扮演非常重要的角色。Hcy与人类的心血管疾病、进行性老年痴呆症有直接关联，血清内高半胱氨酸的高水平是心血管疾病的风险因子，因此发展Cys和Hcy的检测方法具有重要意义。常见检测硫醇的方法有色谱法和电化学法等，虽然这些方法能很好地检测出硫醇的存在，但这些方法在存在一定的局限性，如设备成本高、操作复杂、耗时长等。因此，需要发展一种简单、实时可视化的检测方法用于硫醇的检测。

荧光成像检测是一种价格低廉的灵敏非侵入式可视化检测技术，荧光成像手段具有监测灵敏、成像迅速和可同时观测多分子事件等优点。另外，荧光探针的丰富促进了荧光成像技术的发展，目前荧光染料大概分为以下几类：(1)有机荧光染料；(2)磷光金属配合物；(3)半导体量子点；(4)荧光蛋白等。其中，磷光铱配合物与传统的荧光染料相比具有优异的磷光物理性质，如具有Stokes位移大、发光效率高、光稳定性好、发光颜色可调、发光寿命长等优点。磷光铱配合物具有较长的发光寿命，通过时间分辨技术可以有效地消除自发荧光的影响。基于以上的优点，已经发展了铱配合物的荧光探针用于半胱氨酸和高半胱氨酸的荧光检测，但是目前磷光铱配合物用于半胱氨酸和高半胱氨酸的检测限于体外离体检测和细胞层次的荧光检测成像，而未实现小动物活体荧光成像检测，主要困难在于以下方面：(1)多数的配合物荧光探针的激发光位于紫外区域，而位于紫外区域的激发光在活体荧光成像上存在组织穿透深度不够、对活体组织有光损伤的缺点；(2)配合物荧光探针的发光量子效率低，不能很好地实现活体荧光成像的应用。所以，本发明针对以上的困难，通过设计与合成近红外磷光发射的铱配合物的荧光探针，发展了该探针用于细胞和活体层次上的半胱氨酸和高半胱氨酸的荧光成像检测。

发明内容

本发明提供了一种磷光铱配合物的合成，该配合物具有醛基结构，可以用于检测半胱氨酸或高半胱氨酸，而且配合物的发射光谱位于近红外区域，具有光损伤小、组织穿透性强的特点，可用于细胞和活体的荧光成像。

1.本发明提供的一种磷光铱配合物化学式为[Ir(CHO-btiq)₂(bpy)][PF₆]，结构式如式1所示

2.本发明还提供了该配合物的合成方法，合成步骤如下：

a)称取2-4mmol的2-氯喹啉-3-甲醛和2-4mmol的苯并噻吩-2-硼酸于100mL圆底烧瓶中，加入3摩尔当量碳酸钾，加入40-50mL体积比V/V＝1：1的四氢呋喃和水混合溶剂，最后加入8％摩尔当量的四(三苯基磷)钯，在氮气保护气氛中70℃加热回流24至48小时。反应结束后，用二氯甲烷萃取，水相用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥过夜，柱层析分离，得到结构式如式II的配体。

b)称取1-2mmol的配体II，0.5-1mmol的三水合氯化铱于50mL圆底烧瓶中，加入20-30mL体积比V/V＝3：1的乙二醇乙醚和水混合溶剂，在氮气气氛中110℃加热回流24至48小时。反应得到红褐色沉淀，减压抽滤，用水和乙醇洗涤3次，得到如式III的二氯桥铱配合物。

c)称取0.2-0.5mmol的二氯桥配合物，0.4-1.0mmol的1,10-邻菲罗啉于50mL圆底烧瓶中，加入24-30mL体积比V/V＝1：2的甲醇和二氯甲烷混合溶剂，在氮气气氛中50℃加热回流5-10小时，向反应体系中加入5-10摩尔当量六氟磷酸钾，室温下搅拌2至4小时，减压抽滤收集滤液，进行柱层析分离，得到结构式I的铱配合物[Ir(CHO-btiq)₂(bpy)][PF₆]。

3.本发明还提供该磷光铱配合物在检测半胱氨酸和高半胱氨酸中的应用，在所述的应用中：

a)用体积比V/V＝4:1的乙腈和水混合溶剂将该磷光铱配合物配制成10-20μM的稀溶液；

b)配制1-2mmol的半胱氨酸或高半胱氨酸水溶液；

c)在铱配合物的稀溶液中加入0-40摩尔当量的半胱氨酸、高半胱氨酸水溶液，37℃反应5小时；

d)用荧光分光光度计检测铱配合物溶液的荧光变化。

4.本发明还提供了该磷光铱配合物在相同条件下对其他氨基酸的响应情况，在所述的应用中：

a)用体积比V/V＝4:1的乙腈和水混合溶剂将该磷光铱配合物配制成10μM的稀溶液；

b)配制浓度为1-2mmol的常见的氨基酸水溶液，包括甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、甲硫氨酸、精氨酸、酪氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸；

c)在铱配合物稀溶液中加入相同当量的上述氨基酸水溶液，37℃反应5小时；

d)用荧光分光光度计检测铱配合物溶液的荧光变化。

5.该发明提供了该磷光铱配合物在细胞成像中的应用，在所述应用中：

a)将5μM的铱配合物PBS溶液加入到细胞培养液中，在37℃下孵化30min,用激光共聚焦荧光显微镜进行细胞荧光成像，收集荧光通道为650±10nm和680±10nm。

b)分别往上述含铱配合物培养液中加入50μMCys和Hcy，在37℃下孵化3小时,用激光共聚焦荧光显微镜进行细胞荧光成像，收集荧光通道为650±10nm和680±10nm。

6.该发明提供了该磷光铱配合物在细胞成像中的应用，在所述应用中：

将100μL的10μM铱配合物生理盐水溶液通过皮下注射到裸鼠的腹部，同时注射100μL的100μMHcy生理盐水溶液。采用515nm激光器进行激发，收集的荧光范围为大于630nm的发射信号。

有益效果：鉴于目前半胱氨酸和高半胱氨酸的检测磷光铱配合物探针，其激发光的缺陷不能有效地实现荧光活体成像。磷光铱配合物具有显著的结构功能关系，可以通过改变配体结构来改变配合物的功能和性质，可以使磷光铱配合物的发射光谱落在近红外区域。近红外荧光探针在生物成像中具有光损伤小、组织穿透性强和背景自发荧光干扰小的特点，在生物成像上具有优势。综上所述，我们通过改变铱配合物的配体结构，使磷光铱配合物具有半胱氨酸、高半胱氨酸检测和近红外发光的性能，将该荧光探针用于细胞和活体上半胱氨酸和高半胱氨酸的可视化荧光成像检测。

附图说明

图1铱配合物[Ir(CHO-btiq)₂(bpy)][PF₆]溶液加不同当量半胱氨酸的吸收光谱。

图2铱配合物[Ir(CHO-btiq)₂(bpy)][PF₆]溶液加不同当量半胱氨酸的磷光发射光谱。

图3铱配合物[Ir(CHO-btiq)₂(bpy)][PF₆]溶液加不同当量高半胱氨酸的吸收光谱。

图4铱配合物[Ir(CHO-btiq)₂(bpy)][PF₆]溶液加不同当量高半胱氨酸的磷光发射光谱。

图5铱配合物[Ir(CHO-btiq)₂(bpy)][PF₆]对半胱氨酸/高半胱氨酸的特异性响应。

图6铱配合物[Ir(CHO-btiq)₂(bpy)][PF₆]的细胞荧光成像。

图7铱配合物[Ir(CHO-btiq)₂(bpy)][PF₆]的活体荧光成像。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

下文给出了本发明化合物的具体实施例，但对本发明不构成任何限制。本实施例中所用的原料均为已知化合物，可以由商业途径获得，或可按相关文献设计方法合成。

在下述实施例中，所涉及的理化参数由下述仪器测定的：¹HNMR谱在BrukerAVANCE核磁仪上采用400MHz测定；质谱数据在AppliedBiosystemsVOYGERDE-STR型质谱仪上测得；紫外可见吸收光谱在ShimadzuUV-2700型紫外-可见吸收光谱仪上完成；磷光发射光谱由PerkinElmerLS-55荧光光谱仪测定；细胞荧光成像在OLYMPUSFV1000型激光共聚焦荧光显微镜上进行；荧光活体成像在CLINXIVScope7550活体成像系统上完成。

实施例1

铱配合物[Ir(CHO-btiq)₂(bpy)][PF₆]的合成：

(a)称取4mmol(766.4mg)2-氯喹啉-3-甲醛和4mmol(712.1mg)苯并噻吩-2-硼酸于100mL圆底烧瓶中，加入3摩尔当量碳酸钾，加入40mL体积比V/V＝1：1的四氢呋喃和水混合溶剂，最后加入8％摩尔当量的四(三苯基磷)钯，在氮气保护气氛中70℃加热回流24小时。反应结束后，反应液用二氯甲烷萃取，水相用二氯甲烷萃取三次(3×10mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥过夜，减压除去溶剂后柱层析分离，得到式II的配体CHO-tbiq。核磁表征数据：¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ＝10.55(s,1H),8.82(s,1H),8.23(d,J＝8.5Hz,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.98–7.92(m,1H),7.89(dd,J＝7.1,5.9Hz,2H),7.65(t,J＝7.5Hz,1H),7.60(s,1H),7.50–7.39(m,2H)；质谱表征数据：MALDI-TOF-MS:m/z322.7(M⁺)。

(b)称取1mmol(290.3mg)配体II(CHO-tbiq)，0.5mmol三水合氯化铱于50mL圆底烧瓶中，加入28mL体积比V/V＝3：1的乙二醇乙醚和水混合溶剂，在氮气气氛中110℃加热回流24小时。反应得到红褐色沉淀，抽滤，用水和乙醇洗涤3次，得到式III的二氯桥铱配合物。

(c)称取0.2mmol(321.7mg)式III二氯桥配合物，0.41mmol(81.2mg)1,10-邻菲罗啉于50mL圆底烧瓶中，加入24mL体积比V/V＝1：2的甲醇和二氯甲烷混合溶剂，在氮气气氛中50℃加热回流10小时，在反应体系中加入10摩尔当量六氟磷酸钾，室温下搅拌4小时，抽滤收集滤液，进行柱层析分离，得到式I的铱配合物。核磁表征数据：¹HNMR(400MHz,DMSO)δ＝11.01(d,J＝8.3Hz,2H),9.06(d,J＝5.0Hz,2H),8.95(s,2H),8.74(d,J＝8.1Hz,2H),8.12(dd,J＝8.2,5.3Hz,2H),8.06(d,J＝8.1Hz,2H),8.00(s,2H),7.90(d,J＝7.6Hz,2H),7.22(dd,J＝14.9,7.5Hz,4H),7.09(d,J＝8.9Hz,2H),6.92(t,J＝7.4Hz,2H),6.73(t,J＝7.6Hz,2H),6.47(d,J＝8.2Hz,2H)；质谱表征数据：MALDI-TOF-MS:m/z950.1([M-PF₆]⁺)。

实施例2

铱配合物对半胱氨酸的响应：

a)用体积比V/V＝4:1乙腈和水混合溶剂将该磷光铱配合物配制成10μM的稀溶液。

b)配制2mmol的半胱氨酸水溶液。

c)在铱配合物的稀溶液中分别加入0-40当量的半胱氨酸水溶液，37℃反应5小时。

d)用紫外分光光度计和荧光分光光度计检测溶液的紫外吸收光谱和荧光发射光谱的变化，如图1和图2所示。随着半胱氨酸加入量的增加，该铱配合物在338nm和480nm处的紫外吸收逐渐减弱，在495nm处的紫外吸收增强；荧光信号则随着半胱氨酸加入量的增加发生蓝移，并且信号增强。这是因为铱配合物中的醛基和半胱氨酸的巯基发生环化反应，生成五元环，导致吸收和荧光信号发生变化。

实施例3

铱配合物对高半胱氨酸的响应：

a)用体积比V/V＝4:1的乙腈和水混合溶剂将该磷光铱配合物配制成10μM的稀溶液。

b)配制2mmol的高半胱氨酸水溶液。

c)在铱配合物的稀溶液中分别加入0-40摩尔当量的高半胱氨酸水溶液，37℃反应5小时。

d)用紫外分光光度计和荧光分光光度计检测溶液的紫外吸收光谱和荧光发射光谱的变化，如图3和图4所示。随着半胱氨酸加入量的增加，铱配合物在338nm和480nm处的紫外吸收逐渐减弱，在495nm处的紫外吸收增强；荧光信号则随着高半胱氨酸加入量的增加发生蓝移，并且信号增强。这是因为铱配合物中的醛基和高半胱氨酸的巯基发生环化反应生成六元环，导致紫外和荧光信号发生变化。

实施例4

铱配合物对半胱氨酸/高半胱氨酸的特异性响应：

a)用体积比V/V＝4:1乙腈和水混合溶剂将该磷光铱配合物配制成10μM的稀溶液。

b)配制2mmol的常见氨基酸水溶液，包括甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、甲硫氨酸、精氨酸、酪氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸。

c)在铱配合物的稀溶液中分别加入40摩尔当量的上述常见氨基酸水溶液，37℃反应5小时。

d)用紫外分光光度计和荧光分光光度计检测溶液的紫外吸收光谱和荧光发射光谱的变化，采用荧光信号强度比I₆₆₄/I₆₇₂为输出信号，如图5所示。

e)保持铱配合物的浓度为10μM，分别加入40摩尔当量上述常见氨基酸的水溶液后再加入40摩尔当量的半胱氨酸/高半胱氨酸，用荧光分光光度计检测溶液的荧光信号的变化，采用荧光信号强度比I₆₆₄/I₆₇₂为输出信号，如图5所示。

实施例5

铱配合物在细胞成像中的应用：

a)将5μM的铱配合物PBS溶液加入到细胞培养液中，在37℃下孵化30min,用激光共聚焦荧光显微镜进行细胞荧光成像，收集荧光通道为650±10nm和680±10nm，成像结果见图6的对照组。

b)分别往上述含铱配合物培养液中加入50μMCys和Hcy，在37℃下孵化3小时,用激光共聚焦荧光显微镜进行细胞荧光成像，收集荧光通道为650±10nm和680±10nm，成像结果见图6的实验组，实验结果表明实验组细胞的荧光信号较于对照组有明显增强。

实施例6

铱配合物在活体荧光成像中的应用：

将100μL的10μM铱配合物生理盐水溶液通过皮下注射到裸鼠的腹部，同时注射100μL的100μMHcy生理盐水溶液。1小时后进行活体荧光成像，采用515nm激光器进行激发，收集的荧光范围为大于630nm的发射信号，活体荧光检测成像结果见图7，从图中可以明显观察到腹部皮下的荧光增强信号。

以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种磷光铱配合物，其特征在于，其化学式为：[Ir(CHO-btiq)₂(bpy)][PF₆]，如式I所示

。

2.根据权利要求1所述的一种磷光铱配合物的合成方法，其特征在于，其合成步骤如下：

结构式如式II所示的配体由2-氯喹啉-3-甲醛与苯并噻吩-2-硼酸反应合成；

结构式如式III所示的配合物由式II的配体与三水合氯化铱反应合成；

结构式如式I所示的配合物由式III的配合物与1,10-邻菲罗啉反应，在反应体系中加入六氟磷酸钾经搅拌即得产物。

。

3.根据权利要求2所述的一种磷光铱配合物的合成方法，其特征在于，式II的化合物合成步骤如下：

摩尔当量比1:1的2-氯喹啉-3-甲醛与苯并噻吩-2-硼酸，加入8％摩尔当量的四(三苯基膦)钯和3摩尔当量的碳酸钾，在四氢呋喃和水的混合溶剂中反应24至48小时，反应温度为70℃。

4.根据权利要求2所述的一种磷光铱配合物的合成方法，其特征在于，式III的铱配合物合成步骤如下：

1.5-2mmol的式II配体与0.75-1mmol三水合氯化铱在乙二醇乙醚和水的混合溶剂中加热反应得到。

5.根据权利要求2所述的一种磷光铱配合物的合成方法，其特征在于，式I的配合物合成步骤如下：

a)式II所示的配合物与1,10-邻菲罗啉的摩尔质量比为1:2，反应温度为50-70℃，反应时间为5-10小时；

b)在反应体系中加入5-10摩尔当量的六氟磷酸钾，搅拌2-4小时。

6.根据权利要求1所述的一种磷光铱配合物的应用，其特征在于，该铱配合物具有醛基，醛基可以和半胱氨酸和高半胱氨酸发生环化反应，生成四氢噻唑或巯基吗啉环，会引起铱配合物的荧光信号变化，从而达到检测半胱氨酸和高半胱氨酸的目的。

7.根据权利要求6所述的一种磷光铱配合物的应用，其特征在于，

a)用体积比V/V＝4:1的乙腈和水的混合溶剂将该磷光铱配合物配制成10-50μM的稀溶液；

b)配制浓度为1-2mmol的半胱氨酸或高半胱氨酸水溶液；

c)在铱配合物的稀溶液中加入0-40摩尔当量的半胱氨酸、高半胱氨酸水溶液，37℃反应3至5小时；

d)用荧光分光光度计检测溶液的荧光变化。

8.根据权利要求6所述的一种磷光铱配合物的应用，其特征在于，对于其他常见的氨基酸没有响应，检测步骤如下：

a)用体积比V/V＝4:1的乙腈和水的混合溶剂将该磷光铱配合物配制成10-50μM的稀溶液；

b)配制浓度为1-2mmol的常见的氨基酸水溶液，包括甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、甲硫氨酸、精氨酸、酪氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸；

c)在铱配合物的稀溶液中加入相同当量的上述常见氨基酸水溶液，37℃反应3至5小时；

d)用荧光分光光度计检测溶液的荧光变化。

9.根据权利要求1所述的一种磷光铱配合物的应用方法，其特征在于，半胱氨酸和高半胱氨酸的细胞荧光检测成像步骤如下：

a)将5μM的铱配合物PBS溶液加入到细胞培养液中，在37℃下孵化30min,用激光共聚焦荧光显微镜进行细胞荧光成像，收集荧光通道分别为650±10nm和680±10nm；

b)分别往上述含铱配合物培养液中加入50μMCys和Hcy，在37℃下孵化3小时,用激光共聚焦荧光显微镜进行细胞荧光成像，收集荧光通道分别为650±10nm和680±10nm。

10.根据权利要求1所述的一种磷光铱配合物的应用方法，其特征在于，高半胱氨酸的活体荧光检测成像步骤如下：

将100μL的10μM铱配合物生理盐水溶液通过皮下注射到裸鼠的腹部，同时注射100μL的100μMHcy生理盐水溶液；采用515nm激光器进行激发，收集的荧光范围为大于630nm的发射信号。