CN108218923A - 一种检测pH的水溶性磷光聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于比率法检测pH的水溶性磷光聚合物P及其制备方法和应用。该聚合物由两种铱配合物(Ir1、Ir2)和聚乙烯吡咯烷酮构成，其中Ir1是参比配合物，对pH没有响应；Ir2能够对pH特异性响应，其发光强度会随着pH的降低而减弱；而聚乙烯吡咯烷酮赋予聚合物良好的水溶性和生物相容性。本发明公开的水溶性磷光聚合物P的发光强度以及发射寿命会随着pH的降低而减少，进而通过共聚焦成像对细胞内pH进行检测，是一种集优良的水溶性、生物相容性于一身的磷光探针，在生物成像与传感方面具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于有机光电功能材料技术领域，具体涉及一种用于比率法检测pH的水溶性磷光聚合物及其制备方法和应用。
背景技术
pH值是通常意义上溶液酸碱程度的衡量标准，pH值包括胞内(pHi)和胞外(pHe)，pH值在医学、化学、农业上都有广泛的用途。pH值作为重要的生理参数在一些生理过程中起着至关重要的作用，例如：真核细胞中在进行膜转运，受体循环，溶酶体降解等过程时均是受到细胞内的pH(如吞噬小泡)的控制和直接影响；同时pH值也被描述为癌症的一个显著标志，据研究所示，癌症细胞显示“逆转”的pH梯度，正常组织的pH值一般为7.4，而实体瘤内部的缺氧状态使肿瘤细胞进行无氧糖酵解后产生乳酸，而肿瘤内部血管系统的缺乏使产生的乳酸不能充分排出，导致肿瘤内呈酸性，其细胞pHe在5.7～7.8，均值为7.06，肿瘤中的酸性环境可以作为信号触发载药胶束快速释放药物、细胞内吞及细胞器靶向。
磷光过渡金属配合物，如铱配合物，是一类非常重要的光电材料，金属中心和配体之间的电荷转移和能量迁移展现出特殊的光电性能，具有高效的三线态磷光发射、较长的寿命、大的斯托克斯位移等优点，广泛应用于发光二极管和生物医学领域。过去几十年里，聚合物的研究取得了重大进展。与传统的聚合物相比，水溶性聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮等具有优异的水溶性，较好的生物相容性，并可以通过改变聚合物骨架结构、共轭程度或者引入官能团等方法来调节它的光电性能。因此，将磷光过渡金属配合物引入到共轭聚合物中，通过改变金属中心、配体结构或修饰聚合物骨架可以获得更多性能优异的聚合物光电材料，在光电领域，尤其是生物传感领域有着广泛的应用。
目前，关于以铱配合物为检测位点，水溶性聚合物为基体材料的用于检测pH的生物探针的报道还较为少见。现有技术中的pH探针多为单一的小分子，其生物相容性、水溶性较差，毒性大，发光易受生物体内多种因素的影响，不利于对pH进行精确的检测。因此设计合成出应用比率法来检测pH的水溶性聚合物是非常有必要的。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种检测pH的水溶性磷光聚合物并公开其制备方法和相关应用，该聚合物可应用于比率法检测pH，比率法可减少干扰因素进而精确、特异性检测pH，且具有优良的水溶性和生物相容性，在pH检测、细胞成像和活体成像等领域具有良好的应用前景。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：本发明涉及一种检测pH的水溶性磷光聚合物，其特征在于，其结构通式如下：
具有pH检测功能的磷光铱配合物Ir(2-4)的合成路线如下：
能够用于比率法成像的水溶性磷光聚合物的合成路线如下：
其中，a+b+c＝1，a、b、c取不同的值分别对应不同含量的铱配合物；n可独立地选择含有2至8个碳原子的直链、支链或者环状烷基(醚)链。
具体地合成步骤为：
(1)将1和IrCl3·3H2O(在乙二醇乙醚和水的混合溶液中于110℃和N2保护下反应24h，得到铱二氯桥2；
(2)将铱二氯桥2与N^N配体3在50℃和N2保护下反应5h后将反应溶液降至室温，向其中加入KPF6继续搅拌4小时，反应结束后旋去有机溶剂，并将得到的固体通过柱层析分离提纯，得到棕黄色粉末4；
(3)将4、吡啶硼酸和四三苯基膦钯加入反应瓶中，注入除氧后的混合溶剂(甲苯：乙醇：K2CO3(2M)＝3：1：1)，氮气氛围下反应18h，旋干有机溶剂，通过柱层析分离得到橙黄色粉末状固体Ir(2-4)，即具有pH响应的磷光铱配合物；
(4)向聚合管内加入Ir1、Ir(2-4)、AIBN和吡咯烷酮和3mL四氢呋喃，在氮气氛围下反应过夜，后处理用乙醚沉降，抽滤得到橙黄色固体。
进一步地，所述水溶性磷光聚合物可用于比率法特异性检测pH的变化。
进一步地，所述水溶性磷光聚合物可用于比率法检测细胞内源性或外源性的pH。
进一步地，所述水溶性磷光聚合物可应用于活体领域检测pH的变化。
本发明的有益效果是：本发明为了解决现有技术中小分子pH探针生物相容性差、水溶性差、毒性大、发光影响因素多等多种问题制备了一种水溶性磷光聚合物，该聚合物能够精准、特异性检测pH变化；具有长的发射寿命，结合比率法和时间分辨技术排除背景荧光信号的干扰，提高检测信噪比；同时，该聚合物具有良好的水溶性和生物相容性，可以实现对细胞内源性/外源性的pH检测；毒性小，对生物样品的损伤小，可以实现对活体领域pH的变化的检测。
附图说明
图1是本发明实施例3中铱配合物Ir1分别在中性(pH＝7.34)和酸性(pH＝3.01)环境下的发射光谱；
图2是本发明实施例3中铱配合物Ir2分别在中性(pH＝7.34)和酸性(pH＝3.01)环境下的发射光谱；
图3是本发明实施例4中水溶性聚合物探针P的滴定发射光谱；
图4是本发明实施例5中水溶性聚合物探针P的滴定发射光谱中两个发射峰比值(I580/I470)的大小随着pH的变化的图谱；
图5是本发明实施例6中水溶性聚合物探针P在580nm处发射峰滴定寿命测试的图谱；
图6是本发明实施例7中水溶性聚合物探针P的离子选择性实验图谱；
图7是本发明实施例8中水溶性磷光聚合物探针P的细胞共聚焦成像实验结果。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例1：对pH敏感的配合物Ir2制备
具体的操作步骤为：
(1)化合物2的制备：将1(2.2mmol)和IrCl3·3H2O(1.2mmol)在乙二醇乙醚和水的混合溶液(12mL)中于110℃和N2保护下反应24h，得到铱二氯桥2，产率80％；
化合物4的制备：将铱二氯桥2(1.0mmol)与N^N配体3(0.5mmol)在50℃和N2保护下反应5h。将反应溶液降至室温，向其中加入KPF6(1.4mmol)继续搅拌4小时，反应结束后旋去有机溶剂，并将得到的固体通过柱层析分离提纯，得到黄棕色粉末4，产率80％；
1H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm):8.96(d,J＝8.8Hz,1H),8.61-8.52(m,4H),8.46(d,J＝4.8Hz,1H),8.31(dd,J＝10.0Hz,8.8Hz,1H),8.24(d,J＝8.0Hz,1H),8.02-7.96(m,2H),7.84(d,J＝7.6Hz,2H),7.71(dd,J＝8.0Hz,4.8Hz,1H),7.45-7.39(m,3H),7.31(ddd,J＝7.2Hz,7.2Hz,2.8Hz,2H),7.14(d,J＝9.2Hz,1H),7.03(d,J＝8.8Hz,1H),6.94-6.87(m,2H),6.67(s,1H),6.55(d,J＝1.6Hz,1H),6.51(d,J＝1.6Hz,1H),5.93-5.83(m,1H),5.19(dd,J＝17.2Hz,1.6Hz,1H),5.10(dd,J＝10.0Hz,1.2Hz,1H),3.87(t,J＝5.2Hz,2H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):169.4,169.3,153.6,153.1,148.6,147.2,147.1,147.0,145.9,145.8,143.5,143.4,141.4,141.3,140.2,136.3,136.2,136.1,134.5,134.1,133.1,131.6,131.5,130.3,130.2,129.9,129.8,127.9,127.8,127.6,127.5,127.3,126.5,126.4,126.3,125.5,125.4,124.1,123.8,123.6,119.1,119.0,117.0,100.0,98.3,46.2.
(3)配合物Ir2的制备：将4(0.7mmol)、吡啶硼酸(2.1mmol)和四三苯基膦钯(0.15mmol)加入反应瓶中，注入除氧后的混合溶剂(甲苯：乙醇：K2CO3(2M)＝3：1：1)，氮气氛围下反应18h，旋干有机溶剂，通过柱层析分离得到橙黄色粉末状固体Ir2，即具有pH响应的磷光铱配合物，产率78％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):9.01(d,J＝12.0Hz,1H),8.47(d,J＝8.0Hz,1H),8.37-8.35(m,4H),8.27-8.25(m,4H),8.19-8.14(m,2H),8.08(dd,J＝5.2Hz,0.8Hz,1H),7.99(dd,J＝7.6Hz,0.8Hz,1H),7.85(dd,J＝12.0Hz,4.0Hz,1H),7.70-7.65(m,2H),7.52(dd,J＝8.0Hz,3.6Hz,1H),7.47-7.43(m,2H),7.34-7.27(m,3H),7.24(d,J＝8.0Hz,1H),6.96-6.94(m,4H),6.89-6.82(m,4H),6.49-6.42(m,2H),5.91-5.82(m,1H),5.21(dd,J＝16.0Hz,4.0Hz,1H),5.07(d,J＝10.4Hz,0.8Hz,1H),3.94(s,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm):169.4,169.3,151.6,151.4,149.7,149.6,148.1,148.0,147.8,147.7,147.6,147.4,147.0,146.9,143.9,142.4,141.1,140.5,140.2,139.8,139.7,135.3,134.0,133.6,133.1,132.9,131.4,131.0,129.4,129.1,127.7,127.6,127.5,127.4,127.2,127.1,125.8,125.5,124.7,124.2,124.1,122.4,122.2,121.7,121.6,117.9,117.8,117.0,98.7,29.6,29.3.
实施例2：对pH敏感的配合物水溶性聚合物探针P的制备
a+b+c＝1，a、b、c取不同的值分别对应不同含量的铱配合物。
具体操作步骤为：向聚合管内加入Ir1(0.15mmol)、Ir2(0.05mmol)、AIBN(0.5mmol)和吡咯烷酮(100mmol)和3mL四氢呋喃，在氮气氛围下反应过夜，后处理用乙醚沉降，抽滤得到橙黄色固体
实施例3：配合物Ir1、Ir2对pH响应性发射光谱测试
本发明采用的铱配合物Ir1、Ir2光谱测试浓度为10μM，测试溶剂为混有1％DMSO的PBS溶液，测发射光谱时，激发波长为405nm。
配合物Ir1在中性(pH＝7.34)和酸性(pH＝3.01)溶液中的发射光谱如图1所示。其发光受pH的影响非常微弱，发光随着pH的增加几乎未变，说明铱配合物Ir1可以作为参比应用于pH检测中，与Ir2构建比率法，减少了环境中不必要的干扰，增加了检测的准确性。
配合物Ir2在中性(pH＝7.34)和酸性(pH＝3.01)溶液中的发射光谱如图2所示。其发光对pH非常敏感，发光随着pH的降低而降低，表明根据其发光强度，Ir2可应用于pH的特异性检测。
实施例4：聚合物P对pH响应性发射光谱测试
如图3所示，P同时呈现出Ir1和Ir2的发射峰，通过在不同pH的溶液中测试，Ir1发射峰的位置和强度几乎没有变化，而Ir2的发射随着发光随着pH的降低而降低，表明P对pH非常敏感，可以应用于对pH的特异性检测。
实施例5：聚合物P的滴定发射光谱
聚合物P测试浓度为1mg/mL，随着pH的降低，470nm处的发射强度几乎不变，580nm处的发射强度下降明显，而I580/I470则呈现出有规律的减少，表明通过比率法，聚合物P可以实现对pH的特异性检测。
实施例6：聚合物P的滴定寿命测试
聚合物P的测试浓度为1mg/mL，pH的范围为3.01到7.34。其滴定寿命测试结果如图5所示，580nm处的寿命明显降低，从1300ns左右降至500ns，因此可以通过监测580nm处寿命来特异性检测pH的变化。
实施例7：水溶性聚合物探针P的离子选择性实验
结果如图6所示，在ClO-、H2O2等存在下，其580nm处发射峰强度变化不大，对pH变化不敏感。因此，探针P对于pH具有很好的特异性响应，可以用于特异性检测pH的变化。
实施例8：聚合物P的细胞共聚焦成像实验
聚合物P细胞共聚焦成像实验，实验结果如图7所示，采用的浓度为1mg/mL。具体过程为，在37℃恒温箱中培养HeLa细胞24小时，然后将HeLa细胞与聚合物P在37℃下共孵育1小时，培养介质为含有10mL尼日利亚菌素(10ng mL-1)的不同pH的PBS缓冲溶液。孵育结束进行共聚焦测试。如图7所示，红光通道的发光随着pH的升高而增强而绿光通道的发光无明显变化，其比值随着pH的升高而增加。因此可以通过监测发光和两者的比值来监测细胞内pH的变化。说明磷光聚合物P可以通过比率法结合细胞寿命成像来特异性检测细胞内的pH。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。
Claims (5)
1.一种检测pH的水溶性磷光聚合物，其特征在于，其结构通式如下：
其中Ar为下列结构中的任意一种：
a+b+c＝1，a、b、c取不同的值分别对应不同含量的铱配合物；n可独立地选择含有2至8个碳原子的直链、支链或者环状烷基(醚)链。
2.如权利要求1所述的一种检测pH的水溶性磷光聚合物的制备方法，其特征在于，合成路线为：
其中N^N配体为下列中的任一个：
其制备方法包含以下步骤：
(1)将1和IrCl3·3H2O(在乙二醇乙醚和水的混合溶液中于110℃和N2保护下反应24h，得到铱二氯桥2；
(2)将铱二氯桥2与N^N配体3在50℃和N2保护下反应5h，将反应溶液降至室温，向其中加入KPF6继续搅拌4小时；反应结束后旋去有机溶剂，并将得到的固体通过柱层析分离提纯，得到棕黄色粉末4；
(3)将棕黄色粉末4、吡啶硼酸和四三苯基膦钯加入反应瓶中，注入除氧后的混合溶剂(甲苯：乙醇：K2CO3(2M)＝3：1：1)，在氮气氛围下反应18h，旋干有机溶剂，通过柱层析分离得到橙黄色粉末状固体Ir(2-4)；
(4)向聚合管内加入Ir1、Ir(2-4)、AIBN和吡咯烷酮和3mL四氢呋喃，在氮气氛围下反应过夜，后处理用乙醚沉降，抽滤得到橙黄色固体。
3.如权利要求1或2所述的一种检测pH的水溶性磷光聚合物对pH的特异性检测的应用。
4.如权利要求1或2所述的一种检测pH的水溶性磷光聚合物特异性检测细胞外源性或内源性的pH的应用。
5.如权利要求1或2所述的一种检测pH的水溶性磷光聚合物在活体内检测pH的变化的应用。
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