CN114805699A - 同时检测HClO和pH的荧光/磷光发光寿命响应型聚合物探针及其应用 - Google Patents

同时检测HClO和pH的荧光/磷光发光寿命响应型聚合物探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了同时检测HClO和pH的荧光/磷光发光寿命响应型聚合物探针及其应用。本发明具有如下技术效果：本发明的发明人在研究同时检测次氯酸与pH的聚合物探针的过程中，通过对聚合物探针的组成进行研究，构建了一类具有良好的水溶性、生物相容性以及毒性小的光学探针，可用于细胞内不同pH值下次氯酸的检测；其次，本发明的聚合物探针，结合了比率法和时间分辨光学成像技术。指的是在收集发光强度信号的基础上，还收集了发光寿命的信号，将探针寿命的变化结合比率法，更进一步的进行信号区分，使检测更准确。在所述聚合物中，对pH响应的磷光单元，在不同的pH值下，寿命会有所变化，但始终长于短寿命的荧光单元。

Description

同时检测HClO和pH的荧光/磷光发光寿命响应型聚合物探针 及其应用
技术领域
本发明属于生物成像与检测领域，具体涉及同时检测HClO和pH的荧光/磷光发光寿命响应型聚合物探针及其应用。
背景技术
次氯酸(HClO)是一种内源性产生的活性氧(ROS)，作为先天免疫系统的一部分，其作用是抵抗微生物。HClO异常产生通常与多种病理生理过程密切相关，如心血管疾病、关节炎、神经退行性疾病等。
目前有许多种技术已被用于检测次氯酸，包括化学发光，比色，电化学和色谱分析法等。目前，对于次氯酸的荧光检测一般是利用其强氧化性，次氯酸能够特异性氧化探针的识别基团，使得光学性质发生变化，通过测量荧光强度的变化，来测定次氯酸的氧化性大小，反应出次氯酸的含量。但是，当次氯酸所处的酸碱度不同时，次氯酸将表现出不同的氧化性，一般情况下酸性的氧化性要强于碱性条件。对于复杂的细胞环境，仅通过测试次氯酸的氧化性来达到检测的目的很有可能造成定量不准确等一系列问题，所以在检测次氯酸的同时也要考虑到不同细胞器的pH情况。
“一针两用”的探针是为了更好的检测生物体内相关联的两个物质。
中国专利CN202110159473.6，公开了一类多目标同时检测的荧光/磷光发光寿命聚合物探针，该类探针通过聚合反应将各响应端连接起来，并利用各响应端发光寿命的变化实现两种或多种目标的同时检测。此发明的聚合物探针能够实现对ClO-和O2的同时检测，但是其没有提及能够实现对HClO和pH的同时检测。
目前尚未有现有技术公开能够同时且独立成像次氯酸和pH的荧光探针。因此，设计合成出在不同的pH条件下检测次氯酸的探针还是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一类新型的既有荧光又有磷光的发光寿命聚合物探针。此聚合物探针具有两个发光单元，其中荧光发光单元随着次氯酸的增加发光强度降低。同时，磷光发光单元随着pH值的升高，发光增强。即使在光谱略有交叠的情况下，利用发光寿命成像很容易的将两种信号分开，互不干扰。可以很好的在实时监控pH的情况下，对次氯酸进行准确的定量检测。并且设计了多个在不同pH值范围内有响应的磷光铱(III)配合物，并根据生物体内微环境的不同，选择性的与其他探针联用，设计成多功能的探针。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
本发明的同时检测HClO和pH的荧光/磷光发光寿命响应型聚合物探针，其利用荧光的发光强度变化和磷光的发光强度以及寿命变化来实现次氯酸在不同pH值条件下的检测，此聚合物探针具有如下结构通式：
Figure BDA0003549189770000021
其中，a、b、c为正整数，表示聚合度，55≤a≤80，2000≤b≤10000，55≤c≤200；
通式中A为聚合物的对次氯酸响应的荧光单元，为下列结构中的任意一种：
Figure BDA0003549189770000022
其中，n可独立地选择含有1至7个碳原子的直链、支链、环状烷基或者醚。
通式中B为一类可增加聚合物水溶性的基团单体，为下列结构中的任意一种：
Figure BDA0003549189770000031
其中，n＝17～19。
通式中C为一类对pH响应的磷光金属配合物单体，所述配合物单体结构如下：
Figure BDA0003549189770000032
所述配合物单体化学结构中的N^C配体为下列结构中的任意一种：
Figure BDA0003549189770000033
Figure BDA0003549189770000041
在本发明的一个优选的实施例中，所述聚合物探针，其Mn＝31134，PDI＝1.26,其化学结构式如下所示：
Figure BDA0003549189770000042
其中，
连有次氯酸响应单元A的重复单元的摩尔％为1％，
连有可增加聚合物水溶性的基团单体B的重复单元的摩尔％为95％，
连有对pH响应的磷光金属配合物单体的重复单元的摩尔％为4％，
n＝17-19。其中可增加聚合物水溶性的基团单体，不是单一物质，是混合物，可以称为mPEG950。
本发明的聚合物探针的制备方法，通过自由基聚合反应，将荧光次氯酸响应单体与磷光pH响应单体以及增加水溶性的单体连接在一起。
本发明提供了所述的聚合物探针在同时检测HClO和pH上的应用。本发明的聚合物探针可用于对次氯酸的特异性检测，可用于对pH的特异性检测，可用于特异性检测次氯酸在不同pH值下的检测，可通过磷光单元的寿命成像对体内外的次氯酸与pH的变化检测，可通过对pH响应单元结构的调节，使其在酸性、中性及碱性下都具有良好的响应，根据目标检测物的pH环境，与别的探针联用，开拓出更多的能检测相关性物质的探针。可应用于细胞成像和传感领域。作为聚合物探针，能够保持两种待测物信号的微环境一致的条件下，实时监测这两种信号，同时获得有效信息。除了发光波长信号之外，将寿命成像引入双检测的信号当中，使得更加有利于区分被检测信号。
本发明具有如下技术效果：
1)本发明的发明人在研究同时检测次氯酸与pH的聚合物探针的过程中，通过对聚合物探针的组成进行研究，构建了一类具有良好的水溶性、生物相容性以及毒性小的光学探针，可用于细胞内不同pH值下次氯酸的检测；其次，本发明的聚合物探针，结合了比率法和时间分辨光学成像技术。指的是在收集发光强度信号的基础上，还收集了发光寿命的信号，将探针寿命的变化结合比率法，更进一步的进行信号区分，使检测更准确。在所述聚合物中，对pH响应的磷光单元，在不同的pH值下，寿命会有所变化，但始终长于短寿命的荧光单元。其中随着pH值的升高，短寿命的荧光单元的寿命的长短基本没有变化，但是占比在逐渐降低。同时，长寿命的磷光单元的寿命值和占比同时增加。可以将磷光单元的寿命占比与荧光单元的寿命占比做比率分析，这样可以获得更多的有效信息。最后此探针所采用的配合物Ir1对pH具有良好的响应性，且pKa值在4.4，满足生物体内的抗菌物质的pH条件。
2)与中国专利CN202110159473.6相比，本发明的聚合物探针选择了特定的对次氯酸响应的荧光单元和对pH响应的磷光单元，获得的聚合物探针，能够同时检测次氯酸与pH，产生了预料不到的新的技术效果。
附图说明
图1为本发明所述探针的ClO-单响应聚合物在不同浓度NaClO发射滴定曲线，其中，A图为聚合物对次氯酸的浓度响应的发射滴定曲线，B图为在530nm处的发射峰强度同ClO-浓度线性相关图(R2＝0.997)。
图2为本发明所述探针的pH单聚合物在不同pH下滴定发射曲线，其中，A图为聚合物在不同pH值下的发射滴定曲线，B图为在575nm处的发射峰强度与不同pH值的相关图，其中计算得pKa＝4.4。
图3为本发明所述水溶性聚合物探针在pH和ClO-双响应聚合物在不同浓度NaClO与不同pH值下的发射滴定曲线。其中，A图为双响应的聚合物在不同pH值下的发射滴定曲线，B图为双响应的聚合物在不同次氯酸浓度下的发射滴定曲线。
图4为本发明所述水溶性聚合物探针pH和ClO-双响应聚合物在不同pH的寿命测试。其中，A图为双响应的聚合物在不同pH值下的寿命衰减曲线，B图为双响应的聚合物在不同次氯酸浓度下的寿命衰减曲线，C图为双响应的聚合物在不同pH值下的长寿命磷光单元与短寿命荧光单元的寿命占比图，D图为双响应的聚合物在不同pH值下的长寿命磷光单元与短寿命荧光单元的寿命占比具体的数值。
图5为双响应的聚合物与不同的金属离子以及常见的氧化还原性物质的选择性光谱测试。
具体实施方式
为了相关技术领域人员更好的理解本发明专利的内容，下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实例。
本发明中使用的化学试剂皆为市购。
以下述具体可用于HClO和pH的实时和定量检测的荧光/磷光聚合物探针，以P1为例：其Mn＝31134，PDI＝1.26
所述的聚合物化学结构式如下所示：
Figure BDA0003549189770000071
其中，
连有次氯酸响应单元A的重复单元的摩尔％为1％，
连有可增加聚合物水溶性的基团单体B的重复单元的摩尔％为95％，
连有对pH响应的磷光金属配合物单体的重复单元的摩尔％为4％，
n＝17-19。其中的可增加聚合物水溶性的基团单体，是混合物，不是一个单一物质，可以称为mPEG950(购自毕得)。
上述聚合物分子的合成步骤为：
首先合成带双键对pH敏感的铱配合物单体。再合成次氯酸响应单体，最后通过自由基聚合的方式将对pH敏感的磷光单体和对次氯酸敏感的荧光单体以及增加聚合物水溶性以及生物相容性的PEG同时聚合制备成聚合物探针P1。
实施例1聚合物探针的制备
一、对pH敏感的铱配合物单体的合成路线
Figure BDA0003549189770000081
化合物2[Ir(bpb)2Cl]2的合成：称取化合物1(1-(2-苯并噻唑基)-4-溴苯)(500mg，1.73mmol)与IrCl3·3H2O(290mg，0.82mmol)到双口瓶中，除氧，再向反应体系内注入8mL提前除氧的乙二醇乙醚/水(v/v＝3:1)的混合溶液，110℃、氮气环境下搅拌回流15h。反应结束后体系自然冷却至室温，然后向反应瓶中加入适量水使沉淀析出，减压抽滤，用适量乙醇洗涤沉淀后，真空干燥，得到亮黄色固体，产率约为99％，655mg。
化合物3[Ir(bpb)2hpa]的合成：称取化合物2(300mg，0.185mmol)、3-羟基-2-吡啶甲酸(59mg，0.424mmol)、Na2CO3(193mg，1.85mmol)到双口瓶中，除氧，再向反应体系内注入12mL提前除氧的乙二醇乙醚溶液，110℃下搅拌回流12h。反应结束后体系自然冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，二氯甲烷和水萃取，浓缩有机相。用二氯甲烷/甲醇(v/v＝200：1)柱色谱纯化，产率约为91％，305mg。1H NMR(400MHz,DMSO)δ＝13.41(s,1H),8.37–8.25(m,2H),8.13(d,J＝8.6Hz,1H),7.96-7.85(m,2H),7.68–7.54(m,4H),7.52(s,1H),7.44(dd,J＝4.5,1.7Hz,1H),7.31–7.21(m,3H),6.42(d,J＝1.9Hz,1H),6.19(d,J＝1.9Hz,1H),6.11(d,J＝8.4Hz,1H).
化合物4[Ir(mppb)2hpa]的合成：称取化合物3(200mg，0.22mmol)，2-甲氧基吡啶-4-硼酸(84.15mg，0.55mmol),四三苯基膦钯(50mg，0.043mmol)加入到双口瓶中，避光。氮气保护下，依次向双口瓶注入甲苯(2mL)，碳酸钾饱和溶液(2mL)，无水乙醇(6mL)，80℃，12h。反应结束后，二氯甲烷和水萃取。浓缩有机相，用二氯甲烷/甲醇(v/v＝300：1)柱色谱纯化，产率约为50％，106mg。1H NMR(400MHz,DMSO)δ＝8.38–8.31(m,2H),8.23(d,J＝7.7Hz,1H),8.06–7.99(m,4H),7.65-7.6(m,3H),7.55(s,1H),7.52(d,J＝7.6Hz,1H),7.46(dd,J＝4.3,1.8Hz,1H),7.41(dd,J＝8.1,1.6Hz,1H),7.34(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.28(m,1H),6.74(dd,J＝5.4,1.3Hz,1H),6.65(dd,J＝5.4,1.3Hz,1H),6.62(d,J＝1.5Hz,1H),6.52(s,1H),6.41(s,1H),6.36(d,J＝1.5Hz,1H),6.24(d,J＝8.4Hz,1H),3.76(d,J＝1.1Hz,6H).
化合物Ir1[Ir(mppb)2apa]的合成：称取化合物5(200.0mg，0.207mmol)，无水碳酸钾(100mg，0.72mmol)到双口瓶中，氮气保护下加入DMF(9mL)，冰水浴降至零度。将3-溴丙烯(0.2mL，2.3mmol)缓慢加入反应液后，恢复到室温，搅拌12h。停止反应后用二氯甲烷和水萃取三次，浓缩有机相。用二氯甲烷/甲醇(v/v＝200：1)柱色谱纯化。产率约为45％，94mg。1HNMR(400MHz,DMSO)δ＝8.45(m,1H),8.37(d,J＝8.1Hz,1H),8.31(m,1H),8.04(m,3H),7.99(d,J＝8.0Hz,1H),7.79(d,J＝8.8Hz,1H),7.65–7.61(m,1H),7.61–7.57(m,2H),7.55–7.49(m,2H),7.39(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.32(dd,J＝7.9,1.6Hz,1H),7.23(t,J＝7.8Hz,1H),6.74(dd,J＝5.4,1.3Hz,1H),6.65(dd,J＝5.4,1.3Hz,1H),6.63(d,J＝1.5Hz,1H),6.52(s,1H),6.40(s,1H),6.32(d,J＝1.6Hz,1H),6.23(d,J＝8.4Hz,1H),5.96(m,1H),5.46(dd,J＝17.3,1.9Hz,1H),5.20(dd,J＝10.8,1.7Hz,1H),4.75–4.60(m,2H),3.76(d,J＝1.4Hz,6H).
二、HClO响应小分子的合成路线：
Figure BDA0003549189770000091
化合物5的合成：称取化合物9-溴蒽(1.03g，4mmol)和AlC13(0.81g，6mmol)到双口瓶中，氮气、冰浴下加10mL CS2，然后缓慢滴加1.92mL(10mmol)草酰氯。冰浴搅拌2h，2h后恢复至室温反应12h。反应结束后加入60mL HCl(2M)，50℃搅拌10min，然后过滤，依次用水、5％NaOH水溶液、水洗涤产物。收集产物(0.93g，75％)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ＝9.05(d,J＝8.1Hz,1H),8.62(d,J＝8.8Hz,1H),8.57(d,J＝8.8Hz,1H),8.13(d,J＝6.7Hz,1H),8.04–7.92(m,3H).
化合物6的合成：称取化合物2(0.93g，3mmol)和单过硫酸氢钾(2.31g，15mmol)于双口反应瓶中，加入60mL甲醇，72℃，氮气氛围下，反应72h。反应结束后加入100mL水，抽滤、萃取，柱色谱(二氯：石油醚＝3：1)纯化，得到产物(0.86g，85％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝9.84(d,J＝9.0Hz,1H),9.07(d,J＝8.8,Hz,1H),8.84(d,J＝7.0,1.1Hz,1H),8.80(d,J＝8.7Hz,1H),7.98(m,1H),7.93(m,1H),7.85(m,1H).
化合物7的合成；称取化合物3(327mg，1mmol)，3-丁烯-1-胺(85mg，1.2mmol)，60mL甲醇，0.5mL三乙胺，78℃，反应12h。反应结束后，冷却至室温、萃取、柱色谱(石油醚：乙酸乙酯＝50：1)纯化，得到产物(100mg，26％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝10.08(d,J＝9.0Hz,1H),8.93(d,J＝8.7Hz,1H),8.80(d,J＝7.0Hz,1H),8.71(d,J＝8.9Hz,1H),7.89–7.80(m,2H),7.78–7.71(m,1H),6.04–5.91(m,1H),5.14(d,J＝17.1Hz,1H),5.06(d,J＝10.0Hz,1H),4.41–4.34(m,2H),2.60(dd,J＝14.4,7.2Hz,2H).
化合物S1的合成；称取化合物4(100mg，0.26mmol)，甲硫醇钠(22mg，0.31mmol)，无水碳酸钾(358mg，2.6mmol)，60mL甲醇，68℃反应4h。反应结束后，冷却至室温、萃取、柱色谱(石油醚：乙酸乙酯＝30：1)纯化，得到产物(40mg，37％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝10.10(d,J＝9.2Hz,1H),8.81(d,J＝7.0Hz,1H),8.71(d,J＝7.7Hz,1H),8.48(d,J＝8.4Hz,1H),7.90–7.84(m,1H),7.80–7.75(m,1H),7.71–7.66(m,1H),5.98(m,1H),5.15(d,J＝15.8Hz,1H),5.06(d,J＝10.2Hz,1H),4.42–4.36(m,2H),4.28(s,3H),2.60(dd,J＝14.5,7.1Hz,2H).
三、聚合物P1-3的合成路线
Figure BDA0003549189770000111
聚合物P1的合成：向Schlenk反应管内加入铱配合物Ir1 15mg，mPEG950 950mg，小分子(次氯酸响应单元)5mg，偶氮二异丁腈(3mg)和四氢呋喃(2mL)。密封后，冷冻-抽气-解冻，如此循环三次，升温至70℃避光反应24h。反应结束后，旋干，用甲醇和二氯甲烷透析。透析结束后旋干放置冰箱保存。Mn＝31134,PDI＝1.26
聚合物P2的合成：向Schlenk反应管内加入小分子(次氯酸响应单元)5mg，mPEG950950mg，偶氮二异丁腈(3mg)和四氢呋喃(2mL)。密封后，冷冻-抽气-解冻，如此循环三次，升温至70℃避光反应24h。反应结束后，旋干，用甲醇和二氯甲烷透析。透析结束后旋干放置冰箱保存。Mn＝28734,PDI＝1.49
聚合物P3的合成：向Schlenk反应管内加入铱配合物Ir1 15mg，mPEG950 950mg，偶氮二异丁腈(3mg)和四氢呋喃(2mL)。密封后，冷冻-抽气-解冻，如此循环三次，升温至70℃避光反应24h。反应结束后，旋干，用甲醇和二氯甲烷透析。透析结束后旋干放置冰箱保存。Mn＝31237,PDI＝1.25
测试例1：ClO-单响应聚合物P2在不同浓度NaClO发射滴定曲线
测试聚合物浓度为20μg/mL，测试溶剂为PBS缓冲溶液，激发波长为405nm，测试发射波长575nm。如图1所示，ClO-单响应聚合物荧光P1在0-45μM次氯酸中的发射光谱有着明显的线性变化，光谱数据说明了ClO-单响应聚合物P2对次氯酸敏感，符合次氯酸的响应条件。
测试例2：pH单响应聚合物P3在不同pH下滴定发射曲线
测试聚合物浓度为20μg/mL，测试溶剂为不同pH值的BR缓冲溶液，激发波长为405nm，测试发射波长575nm。如图2所示，对pH敏感的聚合物P2在不同pH值的BR缓冲溶液中由2变化到8的过程中，其发光强度在不断变强，光谱数据说明了聚合物P3对pH具有良好的响应性。
测试例3：pH和ClO-双响应聚合物P1在不同浓度NaClO与不同pH值下的发射滴定曲线
如图3A所示，测试聚合物浓度为20μg/mL，测试溶剂为pH＝2-8的溶液，激发波长为405nm。图中随着pH值的降低，波长为575nm处的强度明显降低，但是波长535nm的强度基本不变，说明pH值不会影响荧光单元的发光，但会影响磷光配合物单元的发光。如图3B所示测试浓度为30μg/mL，测试溶剂为0-90μM的PBS溶液中，激发波长为405nm。随着次氯酸浓度的增加，波长为530nm处的强度明显降低，575nm的光强度也降低，原因是随着次氯酸量的增加，溶液的pH值降低。说明次氯酸的含量会影响到pH值。
测试例4：pH和ClO-双响应聚合物P1在不同pH的寿命测试
测试浓度为60μg/mL，测试溶剂为不同pH值的BR缓冲溶液，激发波长为405nm。测试波长为575nm。如图4所示，pH值从3增加到7时，短寿命荧光单元寿命值基本不变，但是占比在明显下降。同时，长寿命的磷光单元，寿命明显增长，同时占比越来越高。可以利用寿命的比值来进行信号区分。进一步校准误差，提高了探针的准确性。符合聚合物对两个检测物质的响应。
从图4A可以看出，双响应的聚合物寿命随着pH值的增加而增加。
从图4B可以看出，双响应的聚合物寿命随着次氯酸的增加而增加。
从图4C可以看出，对衰减曲线拟合后发现，随着pH值的升高，长寿命的磷光单元寿命数值大小逐渐增加，且占比也逐渐增加，而荧光单元的短寿命数值基本不变，但是比例逐渐降低。
图4D为图4C的具体数值。
测试例5：pH和ClO-双响应聚合物P1选择性
测试浓度为20μg/mL，测试聚合物与各种金属离子以及常见的活性氧，证明聚合物对次氯酸与pH有很好的选择性。
测试聚合物浓度为20μg/mL，各种金属离子以及常见的活性氧浓度为100μM，在水溶液中，证明聚合物对次氯酸与pH有很好的选择性。
从图5可以看出，双响应的聚合物对次氯酸和pH有着很好的选择性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰、等同替换和改进等，皆应纳入权利要求书中记载的保护范围。

Claims (7)

1.同时检测HClO和pH的荧光/磷光发光寿命响应型聚合物探针，其特征在于，所述聚合物探针具有如下结构通式：
Figure FDA0003549189760000011
其中，a、b、c为正整数，表示聚合度，55≤a≤80，2000≤b≤10000，55≤c≤200；
所述通式中的A为次氯酸响应单元；
所述通式中的B为可增加聚合物水溶性的基团单体；
所述通式中的C为对pH响应的磷光金属配合物单体。
2.根据权利要求1所述的聚合物探针，其特征在于，所述的次氯酸响应单元，其结构式为下列结构式中的任意一种：
Figure FDA0003549189760000012
其中，n可独立地选择含有1至7个碳原子的直链、支链、环状烷基或者醚。
3.根据权利要求1所述的聚合物探针，其特征在于，所述可增加聚合物水溶性的基团单体，其结构式为下列结构式中的任意一种：
Figure FDA0003549189760000021
其中，n＝17～19。
4.根据权利要求1所述的聚合物探针，其特征在于，所述对pH响应的磷光金属配合物单体，结构如下：
Figure FDA0003549189760000022
所述配合物单体化学结构中的N^C配体，其结构式为下列结构式中的任意一种：
Figure FDA0003549189760000023
Figure FDA0003549189760000031
5.根据权利要求1所述的聚合物探针，其特征在于，所述聚合物探针，其Mn＝31134，PDI＝1.26
所述的聚合物化学结构式如下所示：
Figure FDA0003549189760000032
其中，
连有次氯酸响应单元A的重复单元的摩尔％为1％，
连有可增加聚合物水溶性的基团单体B的重复单元的摩尔％为95％，
连有对pH响应的磷光金属配合物单体的重复单元的摩尔％为4％，
n＝17-19。
6.如权利要求1-5任意一项所述的聚合物探针的制备方法，其特征在于，通过自由基聚合反应，将荧光次氯酸响应单体与磷光pH响应单体以及增加水溶性的单体连接在一起。
7.如权利要求1-4任意一项所述的聚合物探针在同时检测HClO和pH上的应用。
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