CN112876425B

CN112876425B - 一种硫化氢荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112876425B
Application number: CN202110165278.4A
Authority: CN
Inventors: 许志红; 侯旭锋; 张文凯; 翟姚; 高志颖; 刘源; 汪坪; 杨金刚
Original assignee: Xuchang University
Current assignee: Xuchang University
Priority date: 2021-02-06
Filing date: 2021-02-06
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2041-02-06
Also published as: CN112876425A

Abstract

本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一种硫化氢荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针的结构式如下：

Description

一种硫化氢荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一种硫化氢(H2S)荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

硫化氢作为最重要的气体传递物，其在调节心血管、神经、内分泌、免疫、胃肠系统中有着许多重要的生理功能。此外，H2S充当内源活性氧(ROS)的清除剂。然而，异常浓度的H2S与各种人类疾病相关，包括唐氏综合症，高血压和糖尿病等症状。挥发性、亲脂性、扩散性、高反应性和涉及H2S的复杂反应使得生物系统中的H2S的检测非常困难。硫化氢是细胞中必不可少的分子，在损伤和氧化应激过程中起着重要的抗氧化作用，是与金属结合和相互作用的螯合剂，也是信号传导剂。所以，在环境监测和生物医学等范畴对H2S的检测具备极其重要的意义。传统用于检测H2S的方法预处理过程一般较为复杂，通常会导致样品破坏，并且无法用于体内检测，从而限制了这些检测方法的实际应用。选择性好、灵敏度高、操纵简单、检出限低等是荧光探针的长处，在研究传导细胞信号，细胞生理功能与效应等方面用有奇特的优势，已被广泛应用于细胞内各类活性物质的检测。因此，选择性识别和高灵敏度检测生物体内的H2S有十分重要的生物医学意义。

在生物检测技术手段方面，荧光探针具有选择性好、检出限低、对生物样品损伤较小以及可实现实时原位检测等独特优势，故应用荧光探针法识别细胞内H2S的浓度变化是近年来研究的热点之一。因为近红外光能穿透组织，降低光对生物样品的损伤，减少生物自身荧光的干扰。目前，国内外很多课题组都利用H2S特有的形状合成了许多优秀的荧光探针，但仍存在一些问题，主要是：①如何避免生物硫醇对探针的干扰和消耗；②如何下降探针的检出限实现低浓度检测H2S。

由于荧光方法具有高灵敏度、高选择性以及非生物破坏性等优点，检测小分子硫化氢化合物的荧光传感技术迅速发展。各种各样的荧光探针被设计合成，荧光机制主要有迈克尔加成反应；磺酰胺、磺酸酯键的裂解反应；金属配合物取代配位反应；二硫键断裂反应。

发明内容

为了克服现有技术中的问题，本发明提供了一种硫化氢荧光探针。该荧光探针对硫化氢反应比较稳定，具有良好的选择性和较高的灵敏度。

本发明还提供了上述荧光探针的制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种硫化氢荧光探针，其C21H15N2OSCI，结构式如下：

上述硫化氢荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)6-甲氧基-1-四氢萘酮与三氯氧磷反应得到化合物1，化合物1的结构式如下：

(2)步骤(1)中的化合物1与苯并噻唑-2-乙腈反应即得。

优选的，步骤(1)中化合物1的制备方法具体为：于(-10)～10℃下将三氯氧磷加入到DMF中，搅拌20～40min，然后加入6-甲氧基-1-四氢萘酮，于80～100℃下搅拌4～6h后，析出固体，经抽滤即得；其中，6-甲氧基-1-四氢萘酮与三氯氧磷的摩尔比为(0.5-2)：(0.5-2)。

进一步优选的，于0℃下将三氯氧磷加入到DMF中，搅拌30min，然后加入6-甲氧基-1-四氢萘酮，于90℃下搅拌 5h；6-甲氧基-1-四氢萘酮与三氯氧磷的摩尔比为1∶1。

优选的，步骤(2)中荧光探针的制备方法具体为：向乙醇中加入化合物1、苯并噻唑-2-乙腈及哌啶，于常温下搅拌10～ 14h，产生红色沉淀，经冰乙酸洗涤、过滤干燥，即得。

进一步优选的，化合物1、苯并噻唑-2-乙腈和哌啶的摩尔比为1∶1∶1。

上述硫化氢荧光探针在硫化氢检测中的应用。

上述硫化氢荧光探针的合成路线如下：

和现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明基于巯基参与的氯离子取代反应，荧光强度显著性降低并伴随明显的颜色变化，选取的干扰离等对检测效果几乎无影响，因而实现了对巯基化合物(尤其是硫化氢)的特异性识别响应；

2.本发明的荧光探针检测限可达0.095μM。

附图说明

图1为实施例1制备的硫化氢荧光探针的核磁氢谱图；

图2为实施例1制备的硫化氢荧光探针的核磁碳谱图；

图3中(a)为实施例1制备的荧光探针CHG的溶液(10μM)在不同硫化氢浓度下的荧光光谱，(b)为紫外灯下加入硫化氢前后的荧光变化图；

图4为硫化氢加入到实施例1制备的硫化氢荧光探针(10μM)后荧光光谱随时间的变化趋势；

图5为实施例1制备的硫化氢荧光探针溶液(10μM)在分别加入10当量的不同氨基酸及离子后紫外-可见吸收光谱的变化；

图6中(a)为实施例1制备的硫化氢荧光探针溶液(10μM)在不同硫化氢浓度下的紫外吸收光谱，(b)为日光下加入硫化氢前后的溶液颜色变化图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行进一步说明，但并不是对本发明的限制。

实施例1

本实施例荧光探针的制备过程具体包括以下步骤：

(1)化合物1的制备

向25mL的两口烧瓶中加入5mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，然后将2mL(20mmol)三氯氧磷(POCl3)在0℃下用恒压漏斗缓慢加入到两口烧瓶中(5min内滴加完毕)，搅拌30min后再加入0.2mLN，N-二甲基甲酰胺及0.3535g(2mmol)6-甲氧基-1-四氢萘酮，搅拌5min后缓慢升温至90～95℃，继续搅拌5h，得到反应液；冰水冷却后出现大量粘稠固体，经减压抽滤及真空干燥，得到化合物1，收率为75％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.27(s，1H)，530(s，1H)，3.72(q，J＝7.0Hz，2H)，3.49(s，1H)，3.19-3.09(m，3H)，1.90(dt，J＝11.4，5.8Hz，3H)，1.73-1.61(m，2H)，1.25(t，J＝7.0Hz，3H)，0.94- 0.77(m，1H)，0.07(s，1H).

合成路线如下：

(2)硫化氢荧光探针CHG的制备

向25mL圆底烧瓶中加入43mg(0.2mmol)苯并噻唑-2-乙腈，再加入50mg(0.2mmol)化合物1、3mL无水乙醇、 100uL哌啶，于室温下搅拌24h产生红色沉淀，得到的沉淀经冰乙酸洗涤、过滤、干燥，得到橙红色固体65mg。

对本实施例制备的硫化氢荧光探针进行核磁氢谱和碳谱分析，结果分别如图1、图2所示。具体的：

1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.63(s，1H)，8.09(d，J＝8.2Hz，1H)，7.88(d，J＝8.0Hz，1H)，7.74(d，J＝8.7Hz，1H)，7.47(dt，J＝ 40.0，7.5Hz，2H)，7.26(s，1H)，6.87-6.71(m，2H)，3.87(s，3H)，3.26-3.14(m，2H)，2.94(t，J＝7.8Hz，2H)，1.59(s，1H).

13C NMR(101MHz，CDCl3)δ

164.09(s)，162.04(s)，154.12(s)，144.28(s)，141.39(s)，140.48(s)，135.27(s)，129.30(s)，127.55(s)，127.06(s)，126.10(s)，125.73( s)，123.93(s)，121.77(s)，116.91(s)，113.41(s)，112.66(s)，104.96(s)，77.59(s)，77.27(s)，76.95(s)，58.72(s)，55.75(s)，28.20(s)，26. 24(s)，18.69(s).

本实施例制备的硫化氢荧光探针应用试验如下：

1)检测用储备液的配置

a.CHG样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)的配制：取0.0038g(M＝378)CHG溶于5mLDMSO中，配成浓度为1.00× 10-3mol·L-1的溶液。

b.各种氨基酸及阴离子均用去离子水配置成为浓度为1.00×10-2mol·L-1的溶液并稀释至1.00×10-3mol·L-1

c.PBS缓冲溶液(0.01mol·L-1，pH＝7.4)的配制：

母液配置：0.2mol·L-1K2HPO4：称取78g K2HPO4·12H2O溶于1000mL水中；0.2mol·L-1K2HPO4：称取27.2g 的K2HPO4·2H2O，溶于1000mL水中。

0.2mol·L-1PBS母液(pH＝7.4)：取19mL的0.2mol·L-1的K2HPO4，81mL 0.2mol·L-1的K2HPO4，即可。然后取50mL 0.2mol·L-1PBS溶液，加水稀释至1000mL即可。

下述检测中使用的缓冲溶液均为：PBS(0.01mol·L-1，pH＝7.4)和DMSO，PBS和DMSO的体积比为1∶1。

2)检测分析

取3mL缓冲溶液，加入30μL CHG样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)，再分别加入硫化氢储备液(1.00× 10-3mol·L-1)0～3当量，于25℃下反应30min，然后进行荧光检测，激发波长为480nm，狭缝：5/5nm，结果如图3(a) 所示。由图3(a)可以看出，随着硫化氢加入当量的增大，其荧光强度逐渐减弱。在0-25μM荧光强度与硫化氢浓度呈现较好的线性关系，根据检出限计算公式D＝3σ/k(其中σ为空白标准偏差，k为拟合曲线斜率)得到CHG检测硫化氢的检测限为0.095μM。图3(b)为反应前后的荧光照片，其中左边为仅CHG(黄色荧光)，右边为CHG+硫化氢(蓝色荧光)，通过两者的对比，可以明显看出，CHG与硫化氢共存时存在荧光响应，在待测样品溶液中，加入CHG后，即可判定硫化氢的存在。

取3mL缓冲溶液，加入30μL CHG探针样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)，再分别加入30μL硫化氢储备液(1.00× 10-3mol·L-1)，开始时每隔30秒进行荧光测试，然后间隔时间逐渐增长，荧光测试的激发波长为480nm，狭缝：5/5nm，结果如图4所示。由图4可以看出，探针在加入硫化氢之后，体系的荧光强度随时间的增加而减弱，30min左右体系的荧光强度几乎达到平衡状态。

取3mL缓冲溶液，加入30μL CHG样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)，再加入(0)仅CHG；(1)100μM Cys；(2)100 μM Hcy；(3)100μM GSH；(4)100μM CN-；(5)100μM HS-；(6)100μM CN-；(7)100μM HCO3-；(8)100μM HSO3-；(9)100μM SO42-；(10)100μM CO32-；(11)100μMSCN-；(12)100μM NO2-；(13)100μM F-；(14)100μM Cl-； (15)100μM Br-；(16)100μM I-，反应30min后进行紫外可见光谱检测，结果如图5所示。由图5可以看出，探针在加入Cys、Hcy、GSH以及H2S之后，体系的吸光度值有明显的降低且伴有红移现象，其他无干扰离子均无响应，说明本实施例的探针是一种活性硫选择性荧光探针。

取3mL缓冲溶液，加入30μL CHG样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)，再分别加入硫化氢储备液(1.00× 10-3mol·L-1)0～3当量，于25℃下反应30min，然后进行紫外-可见光谱扫描，结果如图6(a)所示。由图6(a)可以看出，随着硫化氢加入当量的增大，体系的吸光度随浓度的增加而减弱，在3当量时达到饱和，溶液的颜色由浅黄色变为无色，如图6(b)所示，由图6(b)可以看出，硫化氢可以使反应型活性硫化合物探针样品溶液发生明显的颜色变化。

需要说明的是：说明书附图中的probe即指的是CHG。

Claims

1.一种硫化氢荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的分子式C₂₁H₁₅N₂OSCl，结构式如下：

2.权利要求1所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)步骤(1)中的化合物1与苯并噻唑-2-乙腈反应即得。

3.根据权利要求2所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中化合物1的制备方法具体为：于(-10)～10℃下将三氯氧磷加入到DMF中，搅拌20～40min，然后加入6-甲氧基-1-四氢萘酮，于80～100℃下搅拌4～6h后，析出固体，经抽滤即得；其中，6-甲氧基-1-四氢萘酮与三氯氧磷的摩尔比为(0.5-2):(0.5-2)。

4.根据权利要求2所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中荧光探针的制备方法具体为：向乙醇中加入化合物1、苯并噻唑-2-乙腈及哌啶，于常温下搅拌10～24h，产生红色沉淀，经冰乙酸洗涤、过滤干燥，即得。

5.根据权利要求3所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，于0℃下将三氯氧磷加入到DMF中，搅拌30min，然后加入6-甲氧基-1-四氢萘酮，于90℃下搅拌5h；6-甲氧基-1-四氢萘酮与三氯氧磷的摩尔比为1:1。

6.根据权利要求4所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，化合物1、苯并噻唑-2-乙腈和哌啶的摩尔比为1:1:1。