CN103333211B - 一类双波长发射、双异核金属配合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一类双波长发射、双异核金属配合物，其制备方法及应用。该类双异核金属配合物具有结构通式：(L1L2)M-L3-M’(L4L5)Ym，其中：M、M’各自独立地选自Ru、Os、Ir、Re，但M与M’不同时为同一种金属。该类双异核金属配合物可作为电致化学发光物质，其自身或与胺类作为共反应物，既可以分别在各自的发射波长下进行单波长ECL检测，也可以实现双发射波长下的比例ECL检测。特别是，当M、M’其中之一为Ir时，该类双异核金属配合物只对RNA进行专一染色，染色后荧光明显增强，可用于RNA定性、定量检测，以及核酸标记、临床医疗诊断、血细胞分析、免疫分析检测、癌症治疗等相关领域。

Description

一类双波长发射、双异核金属配合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明具体涉及一类双波长发射、双异核金属配合物，其制备方法及应用。该类双异核金属配合物可作为电致化学发光（ECL）物质，自身或选择三丙胺，三乙醇胺，二丁基乙醇胺等任一种胺类作为共反应物，通过电化学扫描产生ECL双波长发射。既可以分别在各自的发射波长下进行单波长ECL检测，也可以实现双发射波长下的比例ECL检测。特别是，当M、M’其中之一为Ir时，该类双异核金属配合物只对RNA进行专一染色，染色后荧光明显增强，可用于RNA定性、定量检测，以及核酸标记、临床医疗诊断、血细胞分析、免疫分析检测、癌症治疗等相关领域。
背景技术
电化学发光Electrogenerated chemiluminescence（也称为电致化学发光，ECL）是在电极表面产生的电活性物质经历电子转移反应形成激发态，之后激发态能量以光的形式释放出来。基于ECL的分析方法兼具化学发光分析和电化学分析的优点，融化学发光、电化学、微电子技术、传感技术于一体，不需外加光源、原位响应、检测灵敏度高、线性范围宽、仪器简单，越来越多地应用在生物分析(蛋白质、激素、肿瘤、病毒检测)、临床、卫生、食品、农业、环境监测、军事等领域。其中，以三联吡啶钌(Ru(bpy)3 2+)与三丙胺(TPA)共混合体系的ECL应用最广泛。为保证对Ru(bpy)3 3+的及时在线还原，实际检测中必须使用大大过量的TPA(通常1μM Ru(bpy)3 3+:100mM TPA)。但是，TPA会自身氧化产生ECL背景干扰。以铂电极为例，这种干扰光的强度竟达到12%（相对于使用Ru(bpy)3 2+时的ECL发光强度）。该背景干扰光的存在必然影响到ECL检测的信噪比、灵敏度以及最低检测限的进一步提高，在根本上制约ECL检测的发展。针对上述问题，国内外研究人员在调节体系的pH值及组成成份、添加表面活性剂、采用不同的金属络合物、组建多核金属络合物体系、在电极表面涂膜包覆标记物改变电极性能等方面做了大量的工作。
组建双核及多核钌金属络合物体系是在不改变共反应物结构及其在电极表面直接氧化过程的条件下，通过引入更多的反应活性中心达到增强ECL强度的效果，从而取得更高的检测灵敏度。现有的方法都是通过不同的刚性连接臂将两个或多个三联吡啶钌连接到一起，虽然一定程度上增强了发光强度，但刚性连接产生的空间位阻不可避免地阻碍了发光标记物与共还原碱剂的分子间相互作用（1、M M Richter,A J Bard.Anal.Chem.,1998,70:310～318；2、M N Li,C Z Zhao,L C Sun,et al.J.Organomet.Chem.,2006,691:4189～4195；3、M Zhou,J Roovers.Macromolecules.,2001,34,244～252）。我们利用柔性的长碳链代替刚性连接，彻底解决了空间位阻问题，在保留两个钌活性中心各自活性的基础上，获得了两个Ru(bpy)3 2+中心之间的分子内作用、标示物与TPA的分子间作用、以及分子内和分子间ECL的协同增效作用，降低了体系中TPA的添加量，获得了显著的ECL增强（中国发明专利ZL200910011299.X）。
鉴于双波长发射比例荧光检测可以有效地避免背景干扰，提高检测限，拓宽实际应用范围，而ECL本身也是一种荧光发射过程。因此，可将双波长发射比例荧光检测应用到ECL检测中。厦门大学陈曦教授将Ru(bpy)3 2+和FTIC（荧光素异硫氰酸酯）分别掺杂到硅胶纳米颗粒中(Lan Luan,Zhi-jie Lin,Genghuang Wu,Xiao-li Huang,Zhi-min Cai,Xi Chen,Chem.Commun.,2011,47,3963-3965)，借助电化学使硅胶表层的Ru(bpy)3 2+产生ECL（红光），同时通过外加光源激发硅胶内表层的FTIC，使之产生荧光发射（绿光），实现了Ru(bpy)3 2+的ECL和FTIC的荧光发射两者间的红绿光编码。为我们的工作提供了很好的启示。前期工作（中国发明专利ZL200910011299.X）表明，双核钌标示物的荧光强度随着碳链连接臂的延长逐渐增加，当碳链长度接近10时，两个Ru(bpy)3 2+中心的荧光发射强度相当于单核Ru(bpy)3 2+强度的两倍。如果将发射绿光的联吡啶铱配合物与发射红光的联吡啶钌配合物通过适当的柔性碳链连接起来，就可以得到含有两个完全不同金属核心的双核联吡啶钌-铱标示物分子，实现红-绿光双波长发射的比例ECL检测。
RNA作为一种重要的生物大分子，参与了蛋白质的合成过程，并作为遗传信息载体，受到了人们的广泛关注。获得RNA合成、转录和加工过程中的信息在分子生物学，生命科学和医学诊断等领域中具有至关重要的作用。利用荧光技术进行RNA的定量分析具有灵敏度高、响应快、仪器使用便捷等优点，引起了科研工作者的大量关注。目前，可用于RNA专一染色的商业化荧光染料只有一种，称为绿色花菁类染料“SYTO RNA-Select”。特别是，这种染料在应用中具有一些局限性。首先，此类染料在染细胞过程中与RNA结合后光稳定性较差，在氧气的存在下，很容易发生光氧化降解反应。限制了其在高光稳定性荧光成像等领域中的应用。其次，此类染料在染细胞的过程中只能实现绿光单发射波长检测。因此，开发可同时满足光稳定好，具有双发射波长，对RNA具有特异选择性、并能够实现其定性定量检测的荧光探针是一项极具挑战性的工作。
在众多种类的荧光染料中，金属配合物类荧光染料以其光稳定性好，斯托克斯位移大，荧光量子产率适中等优点已得到一定的应用。特别是钌类配合物荧光染料因其光稳定性好和较大的斯托克斯位移等特异性能，使其在细胞定位、血细胞分析等领域的应用中脱颖而出。Jim A.Thomas等人报道了一例双核多吡啶钌(II)配合物，尽管该配合物分子具有四个正电荷，但其仍能进入活细胞，定位细胞DNA上[Martin R.Gill，Jorge Garcia-Lara，Simon J.Foster，Carl Smythe，Giuseppe Battaglia，Jim A.Thomas.Nature Chemistry,2009,406,662-667]。NaphtaliA.O’Connor等人在单核吡啶钌(II)配合物的分子上连接了一个菲啶基团，使分子进入细胞后，可定位RNA，且其荧光强度和荧光寿命均有显著提高[Naphtali A.O’Connor,NathanStevens,Diana Samaroo.Chem Comm,2009,2640-2642]。然而，这类染料中的绝大部分只具有单一的发射波长且很少可以对RNA进行专一染色。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一类双波长发射、双异核金属配合物，该配合物的制备方法及应用。
本发明提供的双异核金属配合物具有通式Ⅰ的结构：
(L1L2)M-L3-M’(L4L5)Ym (Ⅰ)
通式Ⅰ中：
Y为卤素离子、ClO4 -、BF4 -、PF6 -、NO3 -或OTs -，m=2,3,4；
M、M’各自独立地选自Ru，Os，Ir，Re，并且M与M’不同时为同一种金属；
当M、M’选自Ru、Os时，与其对应的配体L1、L2、L4、L5各自独立地选自：具有通式Ⅱ结构的2,2’-联吡啶及其衍生物和具有通式Ⅲ结构的邻菲罗啉及其衍生物；
当M、M’中的一个为Ir时，与其对应的配体L1与L2或L4与L5各自独立地选自具有通式Ⅳ结构的2-苯基吡啶及其衍生物；
当M、M’中的一个为Re时，与其对应的配体L1与L2或L4与L5中的一个选自2,2’-联吡啶及其衍生物和邻菲罗啉及其衍生物，此时，另一个配体选自卤素和吡啶及其衍生物；或者与其对应的配体L1与L2或L4与L5同时为羰基。
其中，R1、R2、R3、R4、R7各自独立地选自H,C1-18烷基，CHO,COOH,NH2,C1-6烷基氨基，OH，SH，C1-6烷氧基，C1-6酰胺基，取代或未取代苄基，(CH2)xPTZ，卤素，C1-6卤代烷基；所述(CH2)xPTZ，其x=1-10，PTZ为吩噻嗪；
配体L3具有以下结构：
L3结构中，n为1～30的整数，R5、R6各自独立地选自H、C1-10烷基、CHO、COOH、NH2、NO2、CN、OH、SH、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、C1-6酰胺基、C1-6卤代烷基、具有C1-10烷基的吩噻嗪基和卤素。本发明中，L3为通过不同长度饱合碳链n(n=1,2,3…)连接的两个2,2’-联吡啶配体和/或其衍生物。
本发明提供的双波长发射、双异核金属配合物的制备方法，包括如下步骤：
⑴分别制备以L1、L2和L4、L5为配体的金属配合物中间体
将配体L1、L2和配体L4、L5与以Y’为负离子的金属M盐、M’盐分别进行配位反应，得到通式分别为L1L2M-Y’和L4L5M’-Y’的金属配合物中间体；所述Y’为卤素离子、ClO4 -、BF4 -、PF6 -、NO3 -或OTs-；
(2)制备配体L3
(2.1)当R5与R6相同时
以4-甲基-4’-R5-联吡啶为原料，经甲基锂化反应后，不经分离，直接向反应体系中加入相当于4-甲基-4’-R5-联吡啶0.2-0.5当量的Br(CH2)nBr进行取代反应，反应结束后分离提纯得到配体L3；
(2.2)当R5与R6不同时
①以4-甲基-4’-R5-联吡啶为原料，经甲基锂化反应后，不经分离，直接向反应体系中加入相当于4-甲基-4’-R5-联吡啶1-5当量的Br(CH2)nBr进行取代反应，反应结束后分离提纯得到中间配体L3’；
②再以4-甲基-4’-R6-联吡啶为原料，经甲基锂化反应后，不经分离，直接向反应体系中加入相当于4-甲基-4’-R6-联吡啶1-5当量的步骤①获得的中间配体L3’进行取代反应，反应结束后经分离提纯后得到配体L3；
⑶制备中间体2
将L3与金属配合物中间体L1L2M-Y’进行配位，得到中间体2；反应温度为20-200℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO中的一种或几种的组合；
⑷制备中间体3
将中间体2与L4L5M’-Y’反应，得到中间体3，反应温度为20-200℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO中的一种或几种的组合；
⑸制备目标产物
将双异核金属配合物中间体3(L1L2)M-L3-M’(L4L5)-Y’与含Y的钠盐、钾盐或铵盐按投料摩尔比1：1～10进行负离子置换反应，得到目标产物(L1L2)M-L3-M’(L4L5)Ym，m=2、3、4；
所述Y为卤素离子、ClO4 -、BF4 -、PF6 -、NO3 -或OTs -。
本发明的一个技术方案，步骤⑶所述反应完成后，先各自进行负离子置换反应，再进行后续步骤⑷、步骤⑸。即本申请中负离子置换可以在涉及Y’的每步反应结束后进行，也可以直到得到最终产物后才进行。
本发明提供的双波长发射、双异核金属配合物可作为ECL物质，因此，本发明的另一目的在于提供所述双波长发射、双异核金属配合物作为电致化学发光物质的应用。
本发明提供的双波长发射、双异核金属配合物自身可以通过电化学扫描产生ECL双波长发射，既可在双异核各自的发射波长下进行单波长ECL检测，也可以在双发射波长下进行比例ECL检测。
进一步的，本发明提供的双波长发射、双异核金属配合物还可以与三丙胺、三乙醇胺、二丁基乙醇胺等胺类中的一种作为共反应物，通过电化学扫描产生ECL双波长发射，进而进行比例ECL检测，借助两个发射波长处的ECL比例消除背景干扰。
本发明提供的双波长发射、双异核金属配合物，当M、M’其中之一为Ir时，所述双波长发射、双异核金属配合物只对RNA进行专一染色，并且染色后荧光明显增强，可用于RNA定性、定量检测，以及核酸标记、临床医疗诊断、血细胞分析、免疫分析检测、癌症治疗等相关领域。
本发明的有益效果在于：提供了一类双波长发射、双异核金属配合物，其制备方法及应用。该类双异核金属配合物可作为ECL物质。特别是，当M、M’其中之一为Ir时，该类双异核金属配合物只对RNA进行专一染色，染色后荧光明显增强，对于RNA定性、定量检测，以及核酸标记、临床医疗诊断、血细胞分析、免疫分析检测、癌症治疗等相关领域有很好的应用。
附图说明
图1是双异核金属配合物Os-(CH2)8-Ru和Os-(CH2)12-Ru在乙腈溶液中的相对荧光强度对比图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。
图2是双异核金属配合物Os-(CH2)8-Ir和Os-(CH2)12-Ir在乙腈溶液中的相对荧光强度对比图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。
图3是双异核金属配合物Ru-(CH2)8-Ir和Ru-(CH2)12-Ir在乙腈溶液中的相对荧光强度对比图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。
图4是双异核金属配合物Os-(CH2)12-Ru在乙腈溶液中的ECL发光图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对ECL发光强度。
图5是双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）及对比化合物双核钌配合物（Ru-(CH2)8-Ru）、双核铱配合物（Ir-(CH2)8-Ir）在pH7.36、浓度20mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中的相对荧光强度比照图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。
图6是双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）在pH7.36、浓度20mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中与RNA结合前后相对荧光强度比照图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。
图7是双核铱配合物（Ir-(CH2)8-Ir）在pH7.36、浓度20mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中与RNA结合前后相对荧光强度比照图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。
图8是双核钌配合物（Ru-(CH2)8-Ru）在pH7.36、浓度20mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中与RNA结合前后相对荧光强度比照图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。
图9是双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）在pH7.36、浓度20mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中随着RNA倍数的增加其相对荧光强度比照图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。
图10是双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）在pH7.36、浓度20mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中随着RNA倍数的增加其相对荧光强度比照图。横坐标为RNA相对于Ru-(CH2)8-Ir浓度的倍数，纵坐标为相对荧光强度。
图11是双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）在pH7.36、浓度20mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中其分子铱部分和钌部分的荧光强度比率随着RNA倍数的增加图。横坐标为RNA相对于Ru-(CH2)8-Ir浓度的倍数，纵坐标为Ru-(CH2)8-Ir分子铱部分和钌部分的荧光强度比率。
图12是双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）在pH7.36、浓度20mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中分别和80倍浓度的RNA和DNA进行相互作用后的相对荧光强度。
图13是双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）分别与RNA、胰凝乳蛋白酶（Chymotrysin）、溶菌酶（Lysozyme）、牛血清蛋白（BSA）、人血清蛋白（HAS）、蛋白酶（Protease）和小牛胸腺DNA作用前后荧光强度的测定。
图14A为双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的白场显微成像照片，图14B是化合物Ru-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色绿色通道(500nm-573nm)的荧光显微成像照片，图14C是化合物Ru-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色红色通道(590nm-690nm)的荧光显微成像照片，图14D是化合物Ru-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的荧光显微成像叠加照片。
图15A为双核钌配合物Ru-(CH2)8-Ru对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的白场显微成像照片，图15B是化合物Ru-(CH2)8-Ru对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色590nm-690nm接收通道的荧光显微成像照片，图15C是化合物Ru-(CH2)8-Ru对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的荧光显微成像叠加照片。
图16A为双核铱配合物Ir-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的白场显微成像照片，图16B是化合物Ir-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色500nm-573nm接收通道的荧光显微成像照片，图16C是化合物Ir-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的荧光显微成像叠加照片。
图17A为商品化绿色花菁类核酸染料（SYTO RNA-Select）对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色510nm-550nm接收通道的荧光显微成像照片，图17B是化合物Ru-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色590nm-690nm接收通道的荧光显微成像照片，图17C是荧光显微成像叠加照片。
图18A为商品化双苯咪唑类DNA染料（Hochest）对固定细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色510nm-550nm接收通道的荧光显微成像照片，图18B是化合物Ru-(CH2)8-Ir对固定细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色590nm-690nm接收通道的荧光显微成像照片，图18C是荧光显微成像叠加照片。
图19A为化合物Os-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的白场显微成像照片，图19B是化合物Os-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色绿色通道(500nm-573nm)的荧光显微成像照片，图19C是化合物Os-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色红色通道(635nm-755nm)的荧光显微成像照片，图19D是化合物Os-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的荧光显微成像叠加照片。
具体实施方式
<双异核金属配合物>
本发明提供的新化合物双异核金属配合物具有下列结构通式Ⅰ：
(L1L2)M-L3-M’(L4L5)Ym （Ⅰ）
通式Ⅰ中，Y为卤素离子、ClO4 -、BF4 -、PF6 -、NO3 -或OTs-，m=2,3,4。M、M’各自独立地选自Ru，Os，Ir，Re，并且M与M’不同时为同一种金属；
当M、M’选自Ru、Os时，与其对应的配体L1、L2、L4、L5各自独立地选自：具有通式Ⅱ结构的2,2’-联吡啶及其衍生物和具有通式Ⅲ结构的邻菲罗啉及其衍生物。即M、M’中的一个为Ru或Os，例如，当M为Ru时，与其对应的配体L1、L2各自独立地选自：具有通式Ⅱ结构的2,2’-联吡啶及其衍生物和具有通式Ⅲ结构的邻菲罗啉及其衍生物；当M’为Ru时，则与其对应的配体L4、L5各自独立地选自：具有通式Ⅱ结构的2,2’-联吡啶及其衍生物和具有通式Ⅲ结构的邻菲罗啉及其衍生物。
当M、M’中的一个为Ir时，与其对应的配体L1与L2或L4与L5各自独立地选自具有通式Ⅳ结构的2-苯基吡啶及其衍生物。例如，当M为Ir时，与其对应的配体L1、L2各自独立地选自具有通式Ⅳ结构的2-苯基吡啶及其衍生物；当M’为Ir时，则与其对应的配体L4、L5各自独立地选自具有通式Ⅳ结构的2-苯基吡啶及其衍生物。
当M、M’中的一个为Re时，与其对应的配体L1与L2、L4与L5其中之一选自2,2’-联吡啶及其衍生物和邻菲罗啉及其衍生物，此时，另一个配体选自卤素或具有通式V结构的吡啶及其衍生物；或者与其对应的配体L1与L2、L4与L5同时为羰基。例如，当M为Re时，与其对应的配体L1与L2中的一个（如L1）选自2,2’-联吡啶及其衍生物和邻菲罗啉及其衍生物，则另一个配体（如L2）选自卤素和吡啶及其衍生物；或者当M为Re时，与其对应的配体L1与L2同时为羰基。
其中，R1、R2、R3、R4和R7各自独立地选自H,C1-18烷基，CHO,COOH,NH2,C1-6烷基氨基，OH，SH，C1-6烷氧基，C1-6酰胺基，取代或未取代苄基，(CH2)xPTZ，卤素，C1-6卤代烷基；所述(CH2)xPTZ，其x=1-10，PTZ为吩噻嗪；
L3选自以下配体：
L3结构中，n为1～30的整数，R5、R6各自独立地选自H、C1-10烷基、CHO、COOH、NH2、NO2、CN、OH、SH、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、C1-6酰胺基、C1-6卤代烷基、具有C1-10烷基的吩噻嗪基或卤素。
除另有说明外，本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。例如，“C1-6烷基”包括C6烷基、C5烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴、碘。
本发明的一个具体实施方式中，优选地，R1和R2各自独立地选自H、C1-8烷基、COOH、NH2、OH或卤素；更优选地，R1和R2各自独立地选自H、C1-6烷基或COOH；最优地，R1和R2各自独立地选自H或甲基。
本发明的一个具体实施方式中，优选n为1-30的整数，最优选n为10-20的整数。
本发明的一个具体实施方式中，优选地，R3为H、C1-8烷基、COOH、NH2、OH或卤素；更优选地，R3为H、C1-6烷基或卤素；最优地，R3为H、甲基、F。
本发明的一个具体实施方式中，优选地，R4为H、C1-6烷基、或卤素；更优选地，R4为C1-4烷基、或卤素；最优地，R4为甲基或F。
本发明的一个具体实施方式中，Y优选卤素离子。
本发明的一个具体实施方式中，优选地，R5和R6各自独立地选自H、C1-8烷基、COOH、NH2、OH或卤素；更优选地，R5和R6各自独立地选自H、C1-6烷基、NH2或OH；最优地，R5和R6各自独立地选自H或CH3。
本发明的一个具体实施方式中，优选地，R7为H、C1-8烷基、COOH、NH2、OH或卤素；更优选地，R7为H、C1-6烷基或NH2；最优地，R7为H、甲基、NH2。
最优地，本发明所述的双异核金属配合物选自如下化合物：
<双异核金属配合物的制备方法>
用于制备上述双异核金属配合物的方法包括如下步骤：
（1）分别制备以L1、L2和L4、L5为配体的金属配合物中间体
将配体L1、L2和配体L4、L5与以Y’为负离子的金属M盐、M’盐分别进行配位反应，得到通式分别为L1L2M-Y’和L4L5M’-Y’的金属配合物中间体；所述Y’为卤素离子、ClO4 -、BF4 -、PF6 -、NO3 -或OTs-；反应温度为20-200℃，反应时间为1-48h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂；
上述反应中，L1、L2或L4、L5可相同，也可不同。当L1、L2或L4、L5相同时，优选将反应用配体L1、L2或L4、L5同时与金属M盐、M’盐反应，即配体L1、L2同时与金属M盐反应，配体L4、L5同时与金属M’盐反应；此时，金属M盐：（L1+L2）以及M’盐：（L4+L5）的摩尔比均优选控制在1：1.8～3的范围内。当L1、L2或L4、L5不相同时，优选将反应用配体L1、L2或L4、L5分别与金属M盐、M’盐反应，即金属M盐先与配体L1反应后再与配体L2反应，金属M’盐先与配体L4反应后再与配体L5反应；此时，金属M盐与每个配体各自的摩尔比（M盐：L1，M盐：L2）均优选控制在1：0.8～2的范围内，M’盐与每个配体各自的摩尔比（M’盐：L4，M’盐：L5）均优选控制在1：0.8～2的范围内。
本发明所述Y’一般为化工原料中自带的反离子，常规是卤素离子。反应过程中由于离子交换可转换成卤素离子、ClO4 -、BF4 -、PF6 -或OTs、NO3 -等，各种反离子间可以根据需要进行互相置换。此外，以Y’为负离子的金属M、M’盐可以列举但不限定于RuCl3·nH2O、(NH4)2[OsCl6]、K2OsCl6、OsCl3、IrCl3·nH2O、Re(CO)5Cl等。
在一个优选实施方式中，反应温度为40-200℃，反应时间为1-40h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂。
在一个更优选实施方式中，反应温度为80-180℃，反应时间为1-30h，反应溶剂选自乙醇、乙二醇、水、DMF以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂。
在一个最优选实施方式中，反应温度为70-150℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自乙醇、乙二醇、水及其混合溶剂。
(2)制备配体L3
(2.1)当R5与R6相同时
以4-甲基-4’-R5-联吡啶为原料，与LDA（二异丙胺锂）经甲基锂化反应后，不经分离，直接向反应体系中加入相当于4-甲基-4’-R5-联吡啶0.2-0.5当量的Br(CH2)nBr进行取代反应，反应结束后分离提纯得到配体L3；
甲基锂化反应条件：反应温度为-78～50℃，反应时间为0.5～8h，反应溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、DMF、DMSO中的一种或几种的组合；
上述4-甲基-4’-R5-联吡啶与LDA的反应中，4-甲基-4’-R5-联吡啶与LDA的摩尔比优选为1：0.8～3，更优选为1：0.8～2，特别优选为1：0.9～1.5。反应温度优选为-78～25℃，更优选为-78～0℃。反应时间优选为0.5～4h，更优选为1～2h。反应溶剂优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈，更优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃，特别优选二氯甲烷、四氢呋喃。
取代反应条件：反应温度为-78～100℃，反应时间为1～96h，反应溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、DMF、DMSO中的一种或几种的组合；
4-甲基-4’-R5-联吡啶与Br(CH2)nBr的摩尔比优选为1：0.8～10，更优选为1：0.8～5，特别优选为1：2～5。与Br(CH2)nBr的反应中，反应温度优选为-78～80℃，更优选为-78～70℃，特别优选为10～60℃。反应时间优选为1～80h，更优选为1～60h，特别优选为1～48h。反应溶剂优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈，更优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃，特别优选二氯甲烷、四氢呋喃。
本步骤所得产物优选用二氯甲烷、氯仿等有机溶剂萃取分离后，粗产品进一步用硅胶柱色谱等分离精制。
(2.2)当R5与R6不同时
①以4-甲基-4’-R5-联吡啶为原料，与LDA经甲基锂化反应后，不经分离，直接向反应体系中加入相当于4-甲基-4’-R5-联吡啶1-5当量的Br(CH2)nBr进行取代反应，反应结束后分离提纯得到中间配体L3’；
甲基锂化反应条件：反应温度为-78～50℃，反应时间为0.5～8h，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、DMF、DMSO中的一种或几种的组合；
上述4-甲基-4’-R5-联吡啶与二异丙胺锂的反应中，4-甲基-4’-R5-联吡啶与LDA的摩尔比优选为1：0.8～3，更优选为1：0.8～2，特别优选为1：0.9～1.5。反应温度优选为-78～25℃，更优选为-78～0℃。反应时间优选为0.5～4h，更优选为1～2h。反应溶剂优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈，更优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃，特别优选二氯甲烷、四氢呋喃。
取代反应条件：反应温度为-78～100℃，反应时间为1～96h，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、DMF、DMSO中的一种或几种的组合；
4-甲基-4’-R5-联吡啶与Br(CH2)nBr的摩尔比优选为1：1～10，更优选为1：1～5，特别优选为1：2～5。与Br(CH2)nBr的反应中，反应温度优选为-78～80℃，更优选为-78～70℃，特别优选为10～60℃。反应时间优选为1～80h，更优选为1～60h，特别优选为1～48h。反应溶剂优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈，更优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃，特别优选二氯甲烷、四氢呋喃。
②再以4-甲基-4’-R6-联吡啶为原料，与LDA经甲基锂化反应后，不经分离，直接向反应体系中加入相当于4-甲基-4’-R6-联吡啶1-5当量的步骤①获得的中间配体L3’进行取代反应，反应结束后经分离提纯得到配体L3；
甲基锂化反应条件：反应温度为-78～50℃，反应时间为0.5～8h，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、DMF、DMSO中的一种或几种的组合；
上述4-甲基-4’-R6-联吡啶与二异丙胺锂的反应中，4-甲基-4’-R6-联吡啶与LDA的摩尔比优选为1：0.8～3，更优选为1：0.8～2，特别优选为1：0.9～1.5。反应温度优选为-78～25℃，更优选为-78～0℃。反应时间优选为0.5～4h，更优选为1～2h。反应溶剂优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈，更优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃，特别优选二氯甲烷、四氢呋喃。
取代反应条件：反应温度为-78～100℃，反应时间为1～48h，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、DMF、DMSO中的一种或几种的组合；
4-甲基-4’-R6-联吡啶与L3’的摩尔比优选为1：1～10，更优选为1：1～5，特别优选为1：2～5。与L3’的反应中，反应温度优选为-78～80℃，更优选为-78～70℃，特别优选为10～60℃。反应时间优选为1～80h，更优选为1～60h，特别优选为1～48h。反应溶剂优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈，更优选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃，特别优选二氯甲烷、四氢呋喃。
本步骤所得产物优选用二氯甲烷、氯仿等有机溶剂萃取分离后，粗产品进一步用硅胶柱色谱等分离精制。
（3）制备中间体2
将L3与金属配合物中间体L1L2M-Y’进行配位，得到中间体2，反应温度为20-200℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO中的一种或几种的组合；
上述反应中，L1L2M-Y’与中间体L3的摩尔比优选为1：1～10，更优选为1：1～8，特别优选为1：1～5。反应温度优选为70～150℃，更优选为80～150℃。反应时间优选为1～12h，更优选为1.5～5h。反应溶剂优选乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF，更优选乙醇、乙二醇、水，特别优选乙醇、乙二醇。
本步骤所得产物优选用硅胶柱色谱等分离精制，得到的产品可通过含Y的钠盐、钾盐、铵盐等进行Y离子置换。
（4）制备中间体3
将中间体2与L4L5M’-Y’反应，得到中间体3，反应温度为20-200℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂；
上述反应中，中间体2与L4L5M’-Y’的摩尔比优选为1：1～10，更优选为1：1～6，特别优选为1：1～3。反应温度优选为50～150℃，更优选为70～120℃。反应时间优选为3～15h，更优选为4～7h。反应溶剂优选乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF，更优选乙二醇、乙腈、DMF，特别优选乙腈、DMF。
本步骤所得产物优选用硅胶柱色谱等分离精制，得到的产品可与含Y的钠盐、钾盐、铵盐等进行下述步骤（5）所述的Y离子置换。
（5）制备目标产物
将双异核金属配合物中间体3(L1L2)M-L3-M’(L4L5)-Y’与含Y的钠盐、钾盐或铵盐进行负离子置换反应，得到目标产物(L1L2)M-L3-M’(L4L5)Ym，m=2、3、4；
本发明所述Y的离子置换还可以在步骤⑶所述反应完成后，先进行负离子置换反应，再进行后续步骤⑷、步骤⑸。即在步骤⑶反应结束后进行以Y置换Y’的负离子置换反应，置换后的产物再进行后续步骤。
各产品与含Y的钠盐、钾盐或铵盐等一般按投料摩尔比1：1-10进行负离子置换反应。反应温度为10-100℃，优选为20～80℃，更优选为20～60℃，特别优选为20～40℃。反应时间为5分钟-2h，优选为5分钟～1.5h，更优选为8分钟～1.5h，特别优选为10分钟～1h。反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、丙酮、水、DMF、DMSO中的一种或几种的组合，优选甲醇、乙醇、乙二醇、丙酮、水，更优选甲醇、丙酮、水，特别优选甲醇、丙酮。
由本发明上述方法合成的双异核金属配合物，可以采用核磁、质谱来确定其结构。
本发明还提供利用上述双异核金属配合物在电致化学发光、生物染色方面的应用。
本发明的双异核金属配合物用作电致化学发光、生物染色时具备的有益效果在于：
新双异核金属配合物分子中将不同金属配合物通过柔性碳链连接，能够产生ECL双波长发射、荧光双波长发射，电致化学发光、生物染色时可实现双波长、双通道检测，光化学、电化学稳定性好。
新双异核金属配合物产品原料易得，结构简单，一般通过几步反应即可合成目标分子，易产业化。
为了进一步说明本发明的双异核金属配合物，实施例和比较例中分别以双核钌配合物Ru-(CH2)8-Ru和双核铱配合物Ir-(CH2)8-Ir作为参照物，进行对比说明。其中，双核钌配合物（Ru-(CH2)8-Ru）和双核铱配合物（Ir-(CH2)8-Ir）结构如下：
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。此外，作为电致化学发光、生物染色是本发明新双异核金属配合物(L1L2)M-L3-M’(L4L5)-Ym的两种用途，但不能认定本发明的化合物仅用于电致化学发光、生物染色，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明双异核金属配合物用作电致化学发光、生物染色的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的双异核金属配合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。本发明的特征和优点在参考附图和本发明的实施例之后将变得显而易见。
实施例1Os-(CH2)8-Ru的合成
(1)分别制备以L1、L2和L4、L5为配体的金属配合物中间体
Os(bpy)2Cl2的合成：
将(NH4)2[OsCl6](1.0g，2.3mmol)和2,2’-联吡啶（0.72g，4.6mmol)溶于30ml乙二醇中，在氮气保护、磁力搅拌下加热回流1h。反应混合液冷却到室温后，加入1M的Na2S2O4（60mL）在冰水浴中保持30min。过滤，得到的紫黑色沉淀物先后用水和乙醚充分洗涤，真空干燥，得黑色固体0.92g，产率70%。
Ru(bpy)2Cl2·2H2O的合成
将RuCl3·3H2O（3.9g，19.9mmol）和2,2’-联吡啶（4.68g，30mmol）溶于50mL除水DMF中，氮气保护下加入无水LiCl（4.2g，1.0mmol），混合液避光回流反应8h，冷却至室温，加入250mL丙酮，得到的悬浊液在0-3℃冰箱放置过夜（约16h）。过滤，得到的黑绿色固体用水（3×25mL）洗涤，然后再用乙醚（3×25mL）洗涤，真空干燥，得亮黑色晶状颗粒产品5.5g，收率35﹪。
(2)制备配体L3
将1g4-甲基-2,2’-联吡啶(5.88mmol)与40mL除水THF加入100mL Schlenk瓶中，并用橡胶塞密封置于冰水浴中，抽真空，氮气置换。抽取2.94mL二异丙胺锂（LDA，2M)缓慢注入到100mL Schlenk瓶中，无色溶液变为棕褐色，冰水浴搅拌1h。
将0.80g1,8-二溴辛烷(2.94mmol)注入Schlenk瓶中，撤去冰水浴，50℃反应48h后溶液变为卡其色，浓缩溶剂，加入50mL水，并用二氯甲烷(3×50mL)萃取，无水硫酸钠干燥有机相，旋转蒸干后硅胶柱色谱分离（石油醚-丙酮，5：1）得白色固体1.05g，收率79%。
（3）制备中间体2
将L3配体bpy-(CH2)8-bpy(300mg,0.66mmol)与Os(bpy)2Cl2(315mg,0.55mmol)加入到10mL乙二醇溶剂中，氮气保护下，避光加热回流2h。冷却后用硅胶柱色谱分离，展开剂为CH3COCH3：H2O：KNO3饱和水溶液=15：1：1（V/V/V），收集墨绿色组分，蒸干展开剂，将其溶解于干燥的甲醇中，过滤除去不溶的硝酸钾，再将甲醇浓缩至约5mL，然后将其滴加至饱和的NH4PF6水溶液中，置换NO3 -反离子，将析出的沉淀过滤，水洗，干燥后得墨绿色产品Os-(CH2)8-bpy,438mg，收率64%。
（4）制备中间体3和Os-(CH2)8-Ru
将上述中间体2，Os-(CH2)8-bpy(200mg,0.16mmol)和Ru(bpy)2Cl2·2H2O(83mg,0.16mmol)加入到双颈瓶中，再加入乙醇和水的混合溶剂(8:1,V/V)45mL，在氮气保护下回流5h。反应停止后，蒸干溶剂，把得到的红色油状物溶于乙腈中。利用硅胶柱色谱进行分离提纯，展开剂：CH3COCH3：H2O：KNO3饱和水溶液=10：1：1（V/V/V），收集墨绿色组分，蒸干展开剂，将其溶解于干燥的甲醇中，过滤除去不溶的硝酸钾，再将甲醇浓缩至约5mL，然后将其滴加至饱和的NH4PF6水溶液中，置换NO3 -反离子，将析出的沉淀过滤，水洗，干燥后得墨绿色产品227mg，收率73%。
1H-NMR(400MHz,δppm,CD3COCD3):1.23-1.42(m,12H),1.60-1.77(m,4H),2.86-2.96(m,4H),7.32-7.64(m,12H),7.79(d,J=5.9Hz,1H),7.83-8.30(m,21H),8.65-8.89(m,12H).
HRMS(ESI,m/z):1/3[(M-3PF6 -)]+calculated for C70H66N12F6PRuOs504.4611,found504.4632.
实施例2Os-(CH2)12-Ru的合成
该化合物的合成可参照上述Os-(CH2)8-Ru的合成路线，除利用二溴癸烷代替二溴辛烷之外，其它同实施例1收率76%。
1H-NMR(400MHz,δppm,CD3COCD3):1.22-1.44(m,20H),1.62-1.78(m,4H),2.87-2.97(m,4H),7.32-7.65(m,12H),7.79(d,J=6.0Hz,1H),7.84-8.28(m,21H),8.60-8.91(m,12H).
HRMS(ESI,m/z):1/3[(M-3PF6 -)]+calculated for C74H74N12F6P Ru Os523.1487,found523.1474.
实施例3Os-(CH2)8-Ir的合成
(1)制备金属配合物中间体(F2ppy)2Ir(μ-Cl)2Ir(F2ppy)2
称取0.50g IrCl3·nH2O(1.42mmol)和相应的F2ppy配体(2.84mmol)加入到双颈瓶中，在双排管上抽真空-充氮气-抽真空，循环三次，然后用氮气保护反应体系。用注射器注入乙二醇和水的混合物(3:1,V/V)后，将反应混合物加热至115℃，搅拌反应约24h，有沉淀生成。反应停止后将反应混合物降至室温，过滤得到沉淀。所得沉淀分别用水、乙醇洗涤，得到黄色固体铱二氯桥化合物0.73g，收率83%。
(2)Os(bpy)2Cl2、中间体L3、Os-(CH2)8-bpy的合成同实施例1
(3)制备Os-(CH2)8-Ir
将铱二氯桥化合物(80mg,0.064mmol)和Os-(CH2)8-bpy(100mg,0.08mmol)加入到双颈瓶中，再加入二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(2:1,V/V)20mL，在氮气保护下回流过夜。反应停止后，蒸干溶剂，把得到的红色油状物溶于乙腈中。利用硅胶柱色谱进行分离提纯，展开剂：CH3COCH3：H2O：KNO3饱和水溶液=30：1：1（V/V/V），收集红色组分，蒸干展开剂后将其溶于适量的乙腈溶剂中，过滤除去不溶的硝酸钾，再将乙腈蒸干，溶于极少量甲醇，然后将其加入饱和的NH4PF6水溶液以置换NO3 -对离子，将析出的沉淀过滤、充分水洗，干燥后得红色固体粉末状产品129mg，收率82%。
1H-NMR(400MHz,δppm,CD3COCD3):1.24-1.43(m,12H),1.63-1.78(m,4H),2.83-2.95(m,4H),5.79(dd,J=8.5,2.2Hz,2H),6.76(t,J=11.1Hz,2H),7.24(m,2H),7.37(d,J=6.7Hz,1H),7.43-7.52(m,5H),7.60(d,J=5.0Hz,1H),7.70-7.76(m,1H),7.79(d,J=5.9Hz,1H),7.88-8.09(m,15H),8.20(d,J=5.1Hz,1H),8.32(t,J=8.4Hz,1H),8.39(d,J=8.2Hz,2H),8.70(s,1H),8.74-8.84(m,6H),8.89(d,J=8.2Hz,1H).
HRMS(ESI,m/z):1/3[(M-3PF6 -)]+calculated for C72H62N10F4Os Ir509.1446,found509.1451.
实施例4Os-(CH2)12-Ir的合成
该化合物的合成可参照上述Os-(CH2)8-Ir的合成路线，除利用二溴癸烷代替二溴辛烷之外，其它同实施例3。收率85%。
1H-NMR(400MHz,δppm,CD3CN):1.12-1.33(m,20H),1.52-1.65(m,4H),2.69-2.79(m,4H),5.60-5.70(m,2H),6.56-6.66(m,2H),6.97-7.01(m,2H),7.07(dd,J=5.9,1.7Hz,1H),7.17-7.23(m,5H),7.28(dd,J=5.6,1.6Hz,1H),7.36(d,J=5.9Hz,1H),7.42-7.46(m,1H),7.48-7.58(m,7H),7.72-7.86(m,8H),7.92(dd,J=5.4,0.8Hz,1H),8.05-8.09(m,1H),8.25(t,J=12.9Hz,4H),8.37(m,5H),8.44(d,J=8.2Hz,1H).
实施例5Ru-(CH2)8-Ir的合成
(1)Ru(bpy)2Cl2 .2H2O、(F2ppy)2Ir(μ-Cl)2Ir(F2ppy)2、中间体L3的合成同实施例1
(2)制备Ru-(CH2)8-Ir
将铱二氯桥化合物(300mg,0.24mmol)和Ru-(CH2)8-bpy(554mg,0.48mmol)加入到双颈瓶中，再加入二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(2:1,V/V)30mL，在氮气保护下回流过夜。反应停止后，蒸干溶剂，把得到的红色油状物溶于乙腈中。利用硅胶柱色谱进行分离提纯，展开剂：CH3COCH3：H2O：KNO3饱和水溶液=30：1：1（V/V/V），收集红色组分，蒸干展开剂后将其溶于适量的乙腈溶剂中，过滤除去不溶的硝酸钾，再将乙腈蒸干，溶于极少量甲醇，然后将其加入饱和的NH4PF6水溶液以置换NO3 -对离子，将析出的沉淀过滤、充分水洗，干燥后得红色固体粉末状产品826mg，收率92%。
1H-NMR(400MHz,δppm,CD3COCD3):1.25-1.45(m,12H),1.62-1.82(m,4H),2.83-2.94(m,4H),5.79(dd,J=8.5,2.3Hz,2H),6.67-6.85(m,2H),7.24(m,2H),7.45(dd,J=5.9,1.6Hz,1H),7.53-7.64(m,6H),7.68-7.78(m,1H),7.84-7.96(m,3H),7.98-8.11(m,8H),8.14-8.25(m,6H),8.30-8.42(m,3H),8.65-8.94(m,8H).
HRMS(ESI,m/z):1/2[(M-2PF6 -)]+calculated for C72H62N10F10PRuIr791.1705,found791.1732.
实施例6Ru-(CH2)12-Ir的合成
该化合物的合成可参照上述Ru-(CH2)8-Ir的合成路线，除利用二溴癸烷代替二溴辛烷之外，其它同实施例5。收率94%。
1H-NMR(400MHz,δppm,CD3COCD3):1.16-1.48(m,20H),1.62-1.80(m,4H),2.81-2.91(m,4H),5.79(dd,J=8.5,2.2Hz,2H),6.67-6.85(m,2H),7.24(m,2H),7.45(dd,J=5.8,1.6Hz,1H),7.52-7.64(m,6H),7.68-7.78(m,1H),7.86-7.94(m,3H),8.00-8.11(m,8H),8.14-8.25(m,6H),8.31-8.44(m,3H),8.67-8.95(m,8H).
HRMS(ESI,m/z):1/2[(M-2PF6 -)]+calculated for C76H70N10F10PRuIr819.2018,found819.2023.
实施例7双异核金属配合物Os-(CH2)8-Ru、Os-(CH2)12-Ru荧光发射光谱测定
分别配制Os-(CH2)8-Ru、Os-(CH2)12-Ru的乙腈溶液（浓度分别为1.0×10-3mol·L-1）。利用上述母液进一步稀释，配制得到3mL浓度为0.05mM的Os-(CH2)8-Ru、Os-(CH2)12-Ru的待测乙腈溶液，将待测液分别移入到石英比色皿中，测定其荧光光谱，如图1所示。激发波长λex=455nm，所用仪器为荧光分光光度计，型号：FP-6500。
实施例8双异核金属配合物Os-(CH2)8-Ir、Os-(CH2)12-Ir荧光发射光谱测定
分别配制Os-(CH2)8-Ir、Os-(CH2)12-Ir的乙腈溶液（浓度分别为1.0×10-3mol·L-1）。其余步骤及仪器同实施例7。荧光光谱如图2所示。激发波长λex=365nm。
实施例9双异核金属配合物Ru-(CH2)8-Ir、Ru-(CH2)12-Ir荧光发射光谱测定
分别配制Ru-(CH2)8-Ir、Ru-(CH2)12-Ir的乙腈溶液（浓度分别为1.0×10-3mol·L-1）。其余步骤及仪器同实施例7。荧光光谱如图3所示。激发波长λex=365nm。
实施例10双异核金属配合物Os-(CH2)12-Ru的ECL发射测定
配制Os-(CH2)12-Ru的乙腈溶液（浓度分别为1.0×10-3mol·L-1）。利用上述母液进一步稀释，配制得到浓度为6.7×10-5M的Os-(CH2)12-Ru的待测乙腈溶液，在其中加入10mM的三丙胺后，将待测液分别移入到光谱电解池中。电化学发光强度IECL测试由CHI660D电化学工作站和LS55荧光分光光度计联用测得，如图4所示。测试采用的工作电极为铂电极(Pt)，参比电极为非水Ag/Ag+电极（0.01M AgNO3/0.1M(n-Bu)4NPF6溶于乙腈），辅助电极为铂丝。
实施例11双异核金属配合物Ru-(CH2)8-Ir、参比物双核钌配合物（Ru-(CH2)8-Ru）和双核铱配合物（Ir-(CH2)8-Ir）荧光发射光谱测定
分别配制浓度为1mM的化合物Ru-(CH2)8-Ir、Ru-(CH2)8-Ru和Ir-(CH2)8-Ir的DMSO(二甲基亚砜)溶液，各取6μL，再加pH7.36、20mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，置于三个比色皿中，测定其荧光强度，如图5所示。
Ru-(CH2)8-Ir的激发波长为λex=458nm；Ir-(CH2)8-Ir的激发波长为λex=405nm；Ru-(CH2)8-Ru的激发波长为λex=458nm，所用仪器为荧光分光光度计，型号：FP-6500。
实施例12双异核配合物Ru-(CH2)8-Ir与参比物双核钌配合物Ru-(CH2)8-Ru和双核铱配合物Ir-(CH2)8-Ir与RNA结合前后荧光发射光谱及相对荧光强度变化的测定
按照实施例11配制Ru-(CH2)8-Ir、Ru-(CH2)8-Ru和Ir-(CH2)8-Ir的稀释液，不同之处在于三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液的加入量为10mM，分别测定荧光强度。
再配制浓度为1mM的RNA水溶液。取浓度为1mM的化合物Ru-(CH2)8-Ir、Ru-(CH2)8-Ru和Ir-(CH2)8-Ir的DMSO(二甲基亚砜)溶液6μL于三个比色皿中，再向其中分别加入浓度为1mM的RNA溶液160μL，最后加pH7.36、10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，测定其荧光强度。
与RNA结合前后相对荧光强度如图6～图8所示。化合物Ru-(CH2)8-Ir与RNA结合后，其中，525nm处相对荧光强度可增加4倍，615nm处相对荧光强度发生了一定程度的淬灭作用；化合物Ru-(CH2)8-Ru与RNA结合后，615nm处相对荧光强度可增加2倍；化合物Ir-(CH2)8-Ir与RNA结合后，525nm处相对荧光强度被淬灭。Ru-(CH2)8-Ir的激发波长为λex=458nm；Ir-(CH2)8-Ir的激发波长为λex=405nm；Ru-(CH2)8-Ru的激发波长为λex=458nm，所用仪器为荧光分光光度计，型号：FP-6500。
实施例13双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）随RNA浓度增加的荧光强度变化图及最大荧光发射峰强度与RNA浓度线性关系的测定
配制浓度为1mM的RNA的水溶液。配制浓度为1mM的双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）的DMSO(二甲基亚砜)溶液，取6μL，再加pH7.36、10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，置于比色皿中，测定其荧光强度。随后，每次取相对于双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）测试液浓度不同倍数的RNA水溶液于比色皿中，并将缓冲液搅拌均匀后，测定其荧光强度。激发波长λex=458nm，分别测得双异核配合物Ru-(CH2)8-Ir的荧光发射峰（512nm）强度和荧光发射峰（615nm）强度随RNA倍数增加的线性关系图，如图9、图10所示。由图中可以看出，化合物Ru-(CH2)8-Ir与RNA结合后，525nm处相对荧光强度可增加4倍，615nm处相对荧光强度发生了一定程度的淬灭作用。所用仪器为荧光分光光度计，型号：FP-6500。
实施例14双异核金属配合物Ru-(CH2)8-Ir分别与RNA、胰凝乳蛋白酶（Chymotrysin）、溶菌酶（Lysozyme）、牛血清蛋白（BSA）、人血清蛋白（HAS）、蛋白酶（Protease）和小牛胸腺DNA作用前后荧光强度的测定
取6μL浓度为1mM双异核金属配合物Ru-(CH2)8-Ir的DMSO溶液，加pH7.4、20mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，置于比色皿中，测定其荧光强度，如图11所示。取6μL浓度为1mM的化合物Ru-(CH2)8-Ir的DMSO溶液置于比色皿中，向其中加入浓度为1mM的RNA溶液160μL，最后加pH7.4、20mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，测定其荧光强度，如图12所示。在相同条件下，取6μL浓度为1mM的双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）的DMSO溶液置于六个比色皿中，分别在其中加入浓度为5mg/mL的RNA、胰凝乳蛋白酶（Chymotrysin）、溶菌酶（Lysozyme）、牛血清蛋白（BSA）、人血清蛋白（HAS）、蛋白酶（Protease）和小牛胸腺DNA的溶液150μL，再加pH7.4、20mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，测定其荧光强度，如图13所示。
相同条件下（相同底物浓度、RNA、胰凝乳蛋白酶（Chymotrysin）、溶菌酶（Lysozyme）、牛血清蛋白（BSA）、人血清蛋白（HAS）、蛋白酶（Protease）和小牛胸腺DNA浓度），双异核金属配合物Ru-(CH2)8-Ir与RNA结合后其分子铱部分（512nm）和钌部分（615nm）荧光强度比率可增加1.70倍；与DNA结合后分子铱部分（512nm）和钌部分（615nm）荧光强度比率可增加0.55倍；与胰凝乳蛋白酶（Chymotrysin）结合后分子铱部分（512nm）和钌部分（615nm）荧光强度比率可增加0.30倍；与溶菌酶（Lysozyme）结合后分子铱部分（512nm）和钌部分（615nm）荧光强度比率可增加0.08倍；与牛血清蛋白（BSA）结合后分子铱部分（512nm）和钌部分（615nm）荧光强度比率可增加0.08倍；与人血清蛋白（HAS）结合后分子铱部分（512nm）和钌部分（615nm）荧光强度比率可增加0.14倍；与蛋白酶（Protease）结合后分子铱部分（512nm）和钌部分（615nm）荧光强度比率可增加0.11倍。双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）对RNA有良好的特异性结合。激发波长λex=458nm，所用仪器为荧光分光光度计，型号：FP-6500。
实施例15激光共聚焦扫描显微镜下观察双异核金属配合物Ru-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)的染色
配制浓度为1mM的双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）的DMSO(二甲基亚砜)溶液，取40μL加到装有2mL培养基MCF-7(人乳癌细胞)细胞的培养皿中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育120min。然后在激光共聚焦扫描显微镜(TCS-SP2,Germany)上观察细胞形态。选取代表性区域，同时用405nm和458nm两个波长激发，接收通道分别选用500nm-573nm和590nm-690nm。图14A为双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后的白场显微成像照片，图14B是双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后500nm-573nm接收通道的荧光显微成像照片，图14C是双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后590nm-690nm接收通道的荧光显微成像照片，图14D是双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后的荧光显微成像叠加照片。如图可观察到双异核金属配合物（Ru-(CH2)8-Ir）对MCF-7(人乳癌细胞)细胞核仁特异性染色，且染色结果可以从红绿双接收通道分别进行观察。所用仪器为激光共聚焦扫描显微镜，型号：TCS-SP2。激发光通道：405nm，458nm。
实施例16激光共聚焦扫描显微镜下观察双核钌配合物（Ru-(CH2)8-Ru）对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)的染色
配制浓度为1mM的双核钌配合物（Ru-(CH2)8-Ru）的DMSO(二甲基亚砜)溶液，取40μL加到装有2mL培养基MCF-7(人乳癌细胞)细胞的培养皿中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育120min。然后在激光共聚焦扫描显微镜(TCS-SP2,Germany)下观察细胞形态。选取代表性区域，用458nm波长激发，接收通道选用590nm-690nm。图15A为双核钌配合物（Ru-(CH2)8-Ru）对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后的白场显微成像照片，图15B是双核钌配合物（Ru-(CH2)8-Ru）对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后590nm-690nm接收通道的荧光显微成像照片，图15C是双核钌配合物（Ru-(CH2)8-Ru）对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后的荧光显微成像叠加照片。如图可观察到双核钌配合物（Ru-(CH2)8-Ru）在120min内不会进入到MCF-7(人乳癌细胞)细胞内。所用仪器为激光共聚焦扫描显微镜，型号：TCS-SP2。激发光通道：458nm。
实施例17激光共聚焦扫描显微镜下观察双核铱配合物（Ir-(CH2)8-Ir）对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)的染色
配制浓度为1mM的双核铱配合物（Ir-(CH2)8-Ir）的DMSO(二甲基亚砜)溶液，取40μL加到装有2mL培养基MCF-7(人乳癌细胞)细胞的培养皿中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育120min。然后在激光共聚焦扫描显微镜(TCS-SP2,Germany)下观察细胞形态。选取代表性区域，用405nm波长激发，接收通道选用500nm-573nm。图16A为双核铱配合物（Ir-(CH2)8-Ir）对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后的白场显微成像照片，图16B是双核铱配合物（Ir-(CH2)8-Ir）对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后500nm-573nm接收通道的荧光显微成像照片，图16C是双核铱配合物（Ir-(CH2)8-Ir）对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后的荧光显微成像叠加照片。如图可观察到双核铱配合物（Ir-(CH2)8-Ir）在120min内可以很快的进入到MCF-7(人乳癌细胞)细胞内，但不会对MCF-7(人乳癌细胞)细胞核仁产生特异性染色。所用仪器为激光共聚焦扫描显微镜，型号：TCS-SP2。激发光通道：405nm。
实施例18激光共聚焦扫描显微镜下观察化合物Ru-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后，与商品化绿色花菁类核酸染料（SYTO RNA-Select）的复染
配制浓度为1mM的化合物Ru-(CH2)8-Ir的DMSO(二甲基亚砜)溶液和浓度为5mM的商品化RNA染料“SYTO RNA-Select”的DMSO(二甲基亚砜)溶液。先取Ru-(CH2)8-Ir溶液40μL加到装有2mL培养基MCF-7(人乳癌细胞)细胞的培养皿中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育60min后，加入5μL RNA染料“SYTO RNA-Select”的DMSO(二甲基亚砜)溶液，继续在细胞培养箱中孵育30min。然后在激光共聚焦扫描显微镜(TCS-SP2，Germany)下观察细胞形态。选取代表性区域，同时用405nm和488nm两个波长激发，接收通道分别选用510nm-550nm和590nm-690nm。图17A为商品化RNA染料“SYTO RNA-Select”对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后510nm-550nm接收通道的荧光显微成像照片，图17B是化合物Ru-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后590nm-690nm接收通道的荧光显微成像照片，图17C是荧光显微成像叠加照片。如图可观察到化合物Ru-(CH2)8-Ir与商品化绿色花菁类核酸染料（SYTO RNA-Select）相同，都能够对细胞核仁具有特异性染色，且复染的共区域化系数很高（0.95）。所用仪器为激光共聚焦扫描显微镜，型号：TCS-SP2。激发光通道：405nm，458nm。
实施例19激光共聚焦扫描显微镜下观察化合物Ru-(CH2)8-Ir对固定细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后，与商品化双苯咪唑类DNA染料（Hochest）的复染
将可传代MCF-7(人乳癌细胞)细胞接种培养皿中，37℃，5%CO2条件下培养24小时，吸掉培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗2遍，加入适量冰冻的无水甲醇，37℃孵育30min，吸掉固定用甲醇，用PBS洗2遍，加入2mL液体培养基。配制浓度为1mM的化合物Ru-(CH2)8-Ir的DMSO(二甲基亚砜)溶液和浓度为3mM商品化双苯咪唑类DNA染料（Hochest）的DMSO(二甲基亚砜)溶液。取Ru-(CH2)8-Ir溶液40μL和DNA商品化染料Hochest5μL加到装有固定MCF-7(人乳癌细胞)细胞的培养皿中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育15min。在激光共聚焦扫描显微镜(TCS-SP2，Germany)下观察细胞形态。选取代表性区域，同时用405nm和458nm两个波长激发，接收通道分别选用510nm-550nm和590nm-690nm。图18A为商品化双苯咪唑类DNA染料（Hochest）对固定细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后510nm-550nm接收通道的荧光显微成像照片，图18B是化合物Ru-(CH2)8-Ir对固定细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后590nm-690nm接收通道的荧光显微成像照片，图18C是荧光显微成像叠加照片。如图可观察到化合物Ru-(CH2)8-Ir能对细胞核仁进行特异性染色。所用仪器为激光共聚焦扫描显微镜，型号：TCS-SP2。激发光通道：405nm，458nm。
实施例20激光共聚焦扫描显微镜下观察化合物Os-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)的染色
配制浓度为1mM的化合物Os-(CH2)8-Ir的DMSO(二甲基亚砜)溶液，取40μL加到装有2mL培养基MCF-7(人乳癌细胞)细胞的培养皿中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育120min。然后在激光共聚焦扫描显微镜(TCS-SP2,Germany)下观察细胞形态。选取代表性区域，同时用405nm和458nm两个波长激发，接收通道分别选用500nm-573nm和635nm-755nm。图19A为化合物Os-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后的白场显微成像照片，图19B是化合物Os-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后500nm-573nm接收通道的荧光显微成像照片，图19C是化合物Os-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后635nm-755nm接收通道的荧光显微成像照片，图19D是化合物Os-(CH2)8-Ir对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色后的荧光显微成像叠加照片。如图可观察到化合物Os-(CH2)8-Ir同样可以对MCF-7(人乳癌细胞)细胞核仁特异性染色，且染色结果可以从红绿双接收通道分别进行观察。所用仪器为激光共聚焦扫描显微镜，型号：TCS-SP2。激发光通道：405nm，458nm。

Claims (6)

1.一类双波长发射、双异核金属配合物，其特征在于：所述配合物具有通式Ⅰ的结构；
(L1L2)M-L3-M’(L4L5)Ym (Ⅰ)
通式Ⅰ中：
Y为卤素离子、ClO4 -、BF4 -、PF6 -、NO3 -或OTs-，m＝3,4；
M、M’各自独立地选自Ru，Os，Ir，Re，并且M与M’不同时为同一种金属；
当M、M’选自Ru、Os时，与其对应的配体L1、L2、L4、L5各自独立地选自：具有通式Ⅱ结构的2,2’-联吡啶及其衍生物和具有通式Ⅲ结构的邻菲罗啉及其衍生物；
当M、M’中的一个为Ir时，与其对应的配体L1与L2或L4与L5各自独立地选自具有通式Ⅳ结构的2-苯基吡啶及其衍生物；
当M、M’中的一个为Re时，与其对应的配体L1与L2或L4与L5中的一个选自2,2’-联吡啶及其衍生物和邻菲罗啉及其衍生物，此时，另一对应的配体选自卤素或具有通式V结构的吡啶及其衍生物；或者，与其对应的配体L1与L2或L4与L5同时为羰基；
其中，R1、R2、R3、R4、R7各自独立地选自H,C1-18烷基，CHO,COOH,NH2,C1-6烷基氨基，OH，SH，C1-6烷氧基，C1-6酰胺基，(CH2)xPTZ，卤素和C1-6卤代烷基；所述(CH2)xPTZ，其x＝1-10，PTZ为吩噻嗪；
配体L3具有以下结构：
L3结构中，n为1～30的整数，R5、R6各自独立地选自H、C1-10烷基、CHO、COOH、NH2、NO2、CN、OH、SH、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、C1-6酰胺基、C1-6卤代烷基、具有C1-10烷基的吩噻嗪基和卤素；
但，当M、M’选自Ru、Os，且L3结构中R5、R6同时为CH3，L1、L2、L4与L5同时为2,2’-联吡啶，Y为PF6 -且m＝4时，n≠3、5、7。
2.一种用于制备权利要求1所述的双波长发射、双异核金属配合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
⑴分别制备以L1、L2和L4、L5为配体的金属配合物中间体
将配体L1、L2和配体L4、L5与以Y’为负离子的金属M盐、M’盐分别进行配位反应，得到通式分别为L1L2M-Y’和L4L5M’-Y’的金属配合物中间体；所述Y’为卤素离子、ClO4 -、BF4 -、PF6 -、NO3 -或OTs-；
(2)制备配体L3
(2.1)当R5与R6相同时
以4-甲基-4’-R5-联吡啶为原料，经甲基锂化反应后，不经分离，直接向反应体系中加入相当于4-甲基-4’-R5-联吡啶0.2-0.5当量的Br(CH2)nBr进行取代反应，反应结束后分离提纯得到配体L3；
(2.2)当R5与R6不同时
①以4-甲基-4’-R5-联吡啶为原料，经甲基锂化反应后，不经分离，直接向反应体系中加入相当于4-甲基-4’-R5-联吡啶1-5当量的Br(CH2)nBr进行取代反应，反应结束后分离提纯得到中间配体L3’；
②再以4-甲基-4’-R6-联吡啶为原料，经甲基锂化反应后，不经分离，直接向反应体系中加入相当于4-甲基-4’-R6-联吡啶1-5当量的步骤①获得的中间配体L3’进行取代反应，反应结束后经分离提纯得到配体L3；
⑶制备中间体2
将L3与金属配合物中间体L1L2M-Y’进行配位，得到中间体2；反应温度为20-200℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO中的一种或几种的组合；
⑷制备中间体3
将中间体2与L4L5M’-Y’反应，得到中间体3，反应温度为20-200℃，反应时间为1-24h，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、水、DMF、DMSO中的一种或几种的组合；
⑸制备目标产物
将双异核金属配合物中间体3(L1L2)M-L3-M’(L4L5)-Y’与含Y的钠盐、钾盐或铵盐按投料摩尔比1：1～10进行负离子置换反应，得到目标产物(L1L2)M-L3-M’(L4L5)Ym，m＝3、4；
所述Y为卤素离子、ClO4 -、BF4 -、PF6 -、NO3 -或OTs-。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：步骤⑶所述反应完成后，各自进行负离子置换反应，再进行后续反应步骤⑷、⑸。
4.如权利要求1所述的一类双波长发射、双异核金属配合物作为ECL物质的应用，其特征在于：所述双波长发射、双异核金属配合物通过电化学扫描产生ECL双波长发射，在各自的发射波长下进行单波长ECL检测，或者在双发射波长下进行比例ECL检测。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述双波长发射、双异核金属配合物与三丙胺、三乙醇胺、二丁基乙醇胺中的一种作为共反应物，通过电化学扫描产生ECL双波长发射，进而进行ECL检测。
6.如权利要求1所述的一类双波长发射、双异核金属配合物在RNA染色中的应用，其特征在于：当M、M’其中之一为Ir时，所述双波长发射、双异核金属配合物只对RNA进行专一染色，并且染色后荧光明显增强，可用于RNA定性、定量检测，以及核酸标记。
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