CN111777548B - 一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针csp - Google Patents

Abstract

本发明公开一种线粒体‑溶酶体迁移型膜电位荧光探针CSP，属于线粒体膜电位荧光探针技术领域。本发明一种线粒体‑溶酶体迁移型膜电位荧光探针CSP具有近红外聚集诱导荧光发射特性，利用其正电荷结构与线粒体负性膜电位的静电作用相结合，使探针靶向聚集于线粒体中；随着膜电位的降低，探针从线粒体中释放并迁移至溶酶体，通过探针与市售溶酶体特异性染料进行共定位荧光成像，利用二者的共定位系数随着膜电位的降低而升高的特性，从而实现对正常活细胞中线粒体膜电位的实时追踪，以及对死活细胞进行可视化区分应用。

Description

一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针CSP

技术领域

本发明属于线粒体膜电位荧光探针技术领域，具体涉及一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针CSP。

背景技术

线粒体三羧酸循环过程中，会将线粒体内部的质子主动运输到线粒体外，从而形成内负外正的线粒体膜电位(-160mV～-180mV)，是反映线粒体代谢功能和细胞活性的一种重要参数。线粒体膜电位异常会导致线粒体功能失调，常常与一些癌症，肥胖症以及帕金森症密切相关。此外，大量研究表明线粒体膜电位的降低被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一，甚至发生在细胞核凋亡特征(染色体浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。因此，开发高灵敏的实时监测线粒体膜电位的技术在细胞生物学和生物医学领域均具有重要的应用价值。

众所周知，荧光分子探针结合激光共聚焦显微镜成像技术，具有非破坏性、高灵敏性、操作简便、可动态观测等特性，已成为实时原位监测线粒体膜电位的重要工具。虽然许多膜电位敏感型荧光探针已经被报道，一些已经商品化。然而，该类探针大多数是基于聚集导致淬灭发光机理，即低浓度发光，高浓度或聚集状态时会发生荧光淬灭，严重影响其作为发光材料的实际应用，例如，低浓度易于遭受光漂白；而高浓度会导致聚集荧光淬灭等。相反，具有聚集诱导发光特性的分子由于溶解时不发光，聚集时高度发光的性能，具有良好的光稳定性、大的stokes位移、高信噪比、免洗成像以及长时间标记能力，已作为理想的生物荧光探针用于细胞及活体成像与跟踪。目前，文献也报道了数量有限的聚集诱导型线粒体膜电位探针，该类探针首先靶向聚集于具有正常膜电位的线粒体中并发射强荧光，随着膜电位的降低，荧光或者逐渐猝灭，或者迁移至细胞核。其中猝灭型探针因背景信号过高，检测灵敏度受限；线粒体-细胞核迁移型探针通过计算细胞核与整个细胞荧光强度的比值对膜电位进行评估，该数值无法直接通过激光共聚焦显微镜的成像软件自动获得，无疑给实际操作和检测带来极大不便。

发明内容

针对上述问题本发明提供了一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针CSP。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针CSP，结构式为：

进一步，所述线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针CSP的制备方法如下：合成分三步，首先4-溴苯基乙腈和4-二乙氨基-2-甲氧基-苯甲醛加热回流得到化合物2；然后化合物2和4-吡啶基硼酸反应得到化合物3；化合物3再与碘甲烷通过取代和置换反应得到最终产物CSP。

其合成路线为：

一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针CSP的应用，作为检测试剂在定性检测正常活细胞线粒体膜电位变化时的应用。

进一步，所述的正常活细胞为具有正常膜电位的活细胞为HeLa细胞。

一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针CSP的应用，作为检测试剂在同时检测或可视化区分死活细胞时的应用。

进一步，所述的活细胞为具有正常膜电位的活细胞；所述死细胞为膜电位消失的死细胞。

再进一步，所述死细胞和活细胞均为HeLa、A549和RAW细胞。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

(1)本发明线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针(CSP)以氰基二苯乙烯为聚集诱导荧光核，分别连接甲基吡啶正电荷结构为吸电子基团(A)，二乙基氨为给电子基团(D)，形成D-π-A构型，有利于增强分子间扭曲的分子内电荷转移效应(TICT)；在乙腈/水混合溶剂中随着水含量的增加，探针荧光逐渐增强，且固态荧光最大发射位于672nm，具有典型的近红外聚集诱导荧光发射特性；(2)本发明线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针的工作原理：探针分子中甲基吡啶正电荷结构容易与线粒体的负性膜电位通过静电作用结合，从而使分子靶向聚集于线粒体并发射近红外荧光；随着线粒体的负性膜电位逐渐降低甚至消失，探针分子从线粒体中释放出来，由于二乙基氨中N原子容易在酸性条件下发生质子化，促使探针逐渐迁移至弱酸性的溶酶体中；通过探针与市售溶酶体特异性染料进行共定位荧光成像，利用二者的共定位系数随着膜电位的降低而升高的特性，实现对活细胞线粒体膜电位的实时追踪；(3)所述探针对线粒体膜电位的监测具有良好的可逆性，即当线粒体膜电位恢复时，探针又可回迁至线粒体中，因此可作为一个独特的线粒体-溶酶体迁移型探针在线粒体相关生理过程中膜电位变化的实时原位监测中具有潜在的应用价值；(4)所述探针与市售溶酶体特异性染料的共定位系数可在共定位成像时，同时通过共聚焦仪器的系统软件自动获得，实际操作与参数获取具有快速、直观、简便的特点，可作为一个独特、可靠且实用的参数用来指示膜电位的变化；(5)所述探针兼具聚集诱导发光材料的优异特性，如大的Stoke位移(197nm)，高的固态量子产率(9.8％)，抗光漂白能力，高的成像信噪比以及免洗荧光成像能力等，使其优于传统聚集导致淬灭型染料，对膜电位的监测呈现高灵敏性和光稳定性，并且不受其他氨基酸和离子的干扰；(6)所述探针可用来区分正常活细胞与死细胞，由于正常活细胞中线粒体膜电位为正常状态，探针会靶向聚集与线粒体中，与市售溶酶体特异性染料的共定位重叠成像程度较低；死细胞中由于膜电位几乎处于消失状态，探针会迁移至溶酶体中，与市售溶酶体特异性染料具有良好的共定位成像，因此可通过探针与市售溶酶体特异性染料的共定位系数来区分活细胞与死细胞，具有快速、可视化、便捷的特点，预示其在生物研究与医疗诊断方面具有良好的应用前景；(7)所述的检测手段简单，只需包括荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜。

附图说明

图1.本发明探针CSP的核磁表征，¹H-NMR；

图2.本发明探针CSP的核磁表征，¹³C NMR谱；

图3.本发明探针CSP的质谱表征，LC-MS谱；

图4.本发明探针CSP在乙腈/水混合溶剂中随含水量变化的荧光发射光谱图；

图5.本发明探针CSP的相对荧光强度(I/I₀)在乙腈/水混合体系中随含水量变化的曲线；

图6.本发明探针CSP在乙腈/水混合溶剂中的动态光散射图；

图7.本发明探针CSP的固态荧光光谱图；插图：本发明探针CSP在紫外光下的固态荧光照片；

图8.本发明探针CSP在pH7.4时，常见金属离子、阴离子和氨基酸小分子存在下对其荧光光谱的干扰性；

图9.本发明探针CSP在具有正常膜电位的线粒体中，和市售线粒体特异性染料(MTDR)的共定位荧光成像；

图10.本发明探针CSP和市售溶酶体特异性染料(LB-NIR)经CCCP处理的膜电位降低以及CCCP被洗脱后膜电位恢复过程中，活细胞的实时荧光共定位图像；

图11.本发明探针CSP和市售溶酶体特异性染料(LB-NIR)经CCCP处理的膜电位降低以及CCCP被洗脱后膜电位恢复过程中，二者的共定位系数随CCCP处理时间变化的曲线；

图12.本发明探针CSP和市售溶酶体特异性染料(LB-NIR)分别在活细胞与固定细胞(死细胞)中的荧光共定位图像；

图13.本发明探针CSP和市售溶酶体特异性染料(LB-NIR)分别在活细胞与固定细胞(死细胞)中的共定位系数。

具体实施方式

实施例1

一种具有聚集诱导发射特性的线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针(CSP)的制备及表征：

(1)在圆底烧瓶中，将4-溴苯基乙腈(0.588g,3mmol)和t-BuOK(0.336g,3mmol)依次加入到(30mL)无水乙醇中，室温下搅拌10分钟；然后将4-二乙氨基-2-甲氧基-苯甲醛(0.621g,3mmol)缓慢加入到上述混合液中，回流6小时；将体系冷却至室温，真空浓缩溶剂，经硅胶柱色谱提纯(石油醚/乙酸乙酯,5:1,v/v)得到黄色固体为化合物2(0.806g,70％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ(ppm):8.26(d,J＝8.8Hz,1H),7.91(s,1H),7.53–7.48(m,4H),6.36(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H),6.11(s,1H),3.87(s,3H),3.43(q,J＝6.8Hz,4H),1.23(t,J＝7.2Hz,6H)。

(2)将化合物2(0.346g,0.9mmol)，K₂CO₃(0.138g,1mmol)和4-吡啶基硼酸(0.123g,1mmol)混合溶解在THF/H₂O(9mL/1mL)体系中，再加入Pd(PPh₃)₄(0.015g,0.013mmol)；将体系在氮气保护下回流12小时，冷却至室温，真空浓缩溶剂，经硅胶柱色谱提纯(石油醚/乙酸乙酯,1:1,v/v)得到橘色固体为化合物3(0.166g,48％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ(ppm):8.67(d,J＝5.2Hz,2H),7.82–7.48(m,7H),6.93(d,J＝8.8Hz,1H),6.15–5.93(m,2H),5.39–5.31(m,1H),3.86(s,3H),3.50–3.30(m,4H),1.25–1.13(m,6H)。

(3)将化合物3(0.077g,0.2mmol)与碘甲烷(0.036g,0.25mmol)在乙腈(2mL)中混合并回流4小时；将体系冷却至室温，再加入乙酸酐(10mL)，过滤沉淀，真空干燥，得到粗品无需纯化。将上述粗品溶解在丙酮(2mL)中，加入KPF₆(0.184mg,1mmol)；反应混合物在室温下搅拌24小时，真空浓缩溶剂，经硅胶柱色谱提纯(二氯甲烷/无水甲醇,10:1,v/v)得到紫红色固体为目标产物CSP(0.042mg,39％)。如图1和图2所述，¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ(ppm):8.98(d,J＝6.8Hz,2H),8.51(d,J＝6.8Hz,2H),8.21–8.10(m,3H),8.08(s,1H),7.82(d,J＝8.4Hz,2H),6.47(d,J＝9.2Hz,1H),6.24(s,1H),4.32(s,3H),3.90(s,3H),3.52–3.45(m,4H),1.16(t,J＝7.2Hz,6H).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)：13.03,44.51,47.47,56.14,93.83,99.82,104.87,109.69,119.85,124.09,126.11,129.31,138.56,146.04,152.29,160.92.HR-MS m/z：[M+H]⁺calclated for C₂₆H₂₉F₆N₃OP⁺,546.4042；measured,546.4005。

实施例2

本实施例探针CSP在乙腈/水混合溶剂中的近红外聚集诱导荧光发射特性：

用乙腈/水混合溶剂将探针稀释为终浓度为5μmol/L，固定激发波长为475nm，记录探针随含水量变化的荧光发射光谱(图4)，并绘制探针相对荧光强度(I/I₀)在乙腈/水混合体系中随含水量变化的曲线(图5)。随着水体积比由0％增加到95％，678nm的荧光强度依次增加，且在水体积为85％时达到最大值，说明探针具有典型的聚集诱导发光特性。通过动态光散射分析标表明，探针在乙腈/水混合溶剂(水体积比为85％)中形成了水合直径为135.1nm的聚集态(图6)水体积比为85％，进一步证实了探针的聚集诱导荧光发射特性。

实施例3

本实施例探针CSP的固态荧光发射性能

固定激发波长为475nm，记录探针的固态荧光发射光谱。如图7所示，固态探针的最大荧光发射强度为672nm，处于近红外发光范围(荧光发射>650nm)，说明探针具有近红外发射的聚集诱导性能。同时，Stoke位移高达197nm，能有效降低激发光的干扰。此外，固态探针在紫外光下呈现明亮的红色荧光(插图)；计算探针的固态荧光量子产率为9.8％。

实施例4

将探针CSP浓度保持在5μmol，分别考察该探针在常见离子及氨基酸存在下，对其荧光光谱的干扰性。如图8所示，在DMSO/PBS(1/9，v/v)体系中，pH 7.4时，分别加入下述物质(1mmol)对探针CSP的荧光强度几乎没有干扰。图8中各物质依次为：1.CSP；2,CSP+GSH；3,CSP+Cys；4,CSP+Lys；5,CSP⁺Thr；6,CSP+Ser；7,CSP+K⁺；8,CSP+Na⁺；9,CSP+Ca²⁺；10,CSP+Mg^{2 +}；11,CSP+Cu²⁺；12,CSP+Fe³⁺；13,CSP+ClO^-。

实施例5

为了观察探针CSP是否能够靶向聚集于具有正常膜电位的活细胞线粒体中，进行了探针与市售线粒体特异性染料MitoTracker Deep Red(MTDR)的共定位实验。将贴壁的HeLa细胞与MTDR(终浓度0.3μmol/L)在pH 7.4的条件下，于37℃、5％CO₂的孵育箱中孵育30min后，用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)轻轻洗涤3次，除去多余的染料。然后加入探针CSP(终浓度1μmol/L)继续共同孵育30min，在激光共聚焦显微镜下观察二者的共定位情况。考虑到探针CSP的近红外荧光发射与市售MTDR的近红外红光发射范围有些重叠，为了获得具有合适信噪比的共定位图像，在此探针CSP固定激发波长为488nm，选择假绿色荧光成像，收集绿色通道范围550-650nm；MTDR的固定激发波长为633nm，收集红色通道范围680-750nm。由图8可知，荧光探针CSP呈典型的绿色棒状线粒体形态，且与MTDR(图9)能够很好地重叠，得到黄色荧光(图9)，经软件处理荧光探针MSO与MTDR的平均共定位系数(CLC)高达0.90。说明荧光探针CSP与MTDR具有显著的共定位成像，能够靶向定位于具有正常膜电位的活细胞线粒体中。此外，由于探针CSP具有独特的聚集诱导发光性能，只在靶向细胞器中聚集时才发光，因此经细胞孵育后无需洗涤，即具有免洗荧光成像能力。

实施例6

将贴壁的HeLa细胞与市售溶酶体特异性染料LysoBrite NIR(LB-NIR)(终浓度0.3μmol/L)在pH 7.4的条件下，于37℃、5％CO₂的孵育箱中孵育30min后，用磷酸盐缓冲液(pH7.4)轻轻洗涤3次，除去多余的染料。然后加入探针CSP(终浓度1μmol/L)继续共同孵育30min，然后在细胞中加入carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone(CCCP)，快速降低线粒体膜电位，在激光共聚焦显微镜下观察二者的共定位情况。考虑到探针CSP的近红外荧光发射与市售MTDR的近红外红光发射范围有些重叠，为了获得具有合适信噪比的共定位图像，在此探针CSP固定激发波长为488nm，选择假绿色荧光成像，收集绿色通道范围550-650nm；MTDR的固定激发波长为633nm，收集红色通道范围680-750nm。由图10和11所示，在没有加入CCCP之前，探针CSP与LB-BIR的平均共定位系数(CLC)只有约0.25左右，进一步证实在正常膜电位的细胞中，探针CSP之靶向聚集于线粒体，而非溶酶体。当加入CCCP后，探针与CSP的荧光重叠程度逐渐增强，且在10min时二者的平均共定位系数(CLC)升高至0.83以上，说明随着膜电位的降低，探针CSP从线粒体释放出来并迁移至溶酶体中；随后，采用PBS缓冲液将细胞中CCCP洗脱，发现探针CSP和LB-NIR的荧光重叠程度逐渐减弱，且二者的平均共定位系数(CLC)在15min内基本降低至0.35以下，说明随着膜电位的恢复，探针CSP又从溶酶体基本回迁至线粒体中，这些结果表明探针CSP能够作为一个独特的线粒体-溶酶体迁移型荧光探针实时追踪线粒体膜电位的可逆变化，且探针CSP与LB-BIR的平均共定位系数(CLC)可以作为一个可靠，实用又便利的参数指示膜电位的变化。

实施例7

分别选取HeLa，A549和RAW三种细胞的正常活细胞(具有正常的线粒体膜电位)和固定细胞，经探针CSP和LB-NIR染色后，在激光共聚焦显微镜下观察二者的共定位情况。探针CSP和LB-NIR孵育活细胞的过程类似于实施例5和6中HeLa细胞的染色过程。固定细胞的染色过程如下：将贴壁的HeLa，A549和RAW三种细胞首先用1mL 4％的多聚甲醛溶液处理30min，之后用PBS洗去多聚甲醛溶液，再分别与LB-NIR(终浓度0.3μmol/L)在pH 7.4的条件下，于37℃、5％CO₂的孵育箱中孵育30min后，用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)轻轻洗涤3次，除去多余的染料。然后加入探针CSP(终浓度1μmol/L)继续共同孵育30min，在激光共聚焦显微镜下观察二者的共定位情况。如图12和13所示，三种活细胞中，探针与LB-NIR的共定位荧光重叠程度较低，平均共定位系数仅为0.22左右，说明探针CSP靶向聚集于线粒体中；对应的固定细胞中，二者的共定位系数高达0.89以上，说明固定细胞中，由于膜电位的消失，探针CSP已基本迁移至溶酶体中，这些结果表明探针CSP可作为一个独特的线粒体-溶酶体迁移型探针用来同时检测或可视化区分活细胞与死细胞。

本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

Claims (5)

1.一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针CSP，其特征在于，结构式为：

。

2.权利要求1所述的一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针CSP在制备检测正常活细胞线粒体膜电位的检测试剂中的应用，其特征在于：所述的正常活细胞为具有正常膜电位的活HeLa细胞。

3.权利要求1所述的一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针CSP在制备检测正常活细胞线粒体膜电位的检测试剂中的应用，其特征在于：所述检测试剂同时检测或可视化区分死活细胞。

4.根据权利要求3所述的一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针CSP在制备检测正常活细胞线粒体膜电位的检测试剂中的应用，其特征在于：所述的活细胞为具有正常膜电位的活细胞；所述死细胞为膜电位消失的死细胞。

5.根据权利要求4所述的一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针CSP在制备检测正常活细胞线粒体膜电位的检测试剂中的应用，其特征在于：所述死细胞和活细胞均为HeLa、A549和RAW细胞。

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