CN112321492A - 监测线粒体自噬的荧光粘度探针及制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种监测线粒体自噬的荧光粘度探针CS‑Py‑BC，属于粘度荧光探针技术领域。本发明提供的一种监测线粒体自噬的荧光粘度探针CS‑Py‑BC具有聚集诱导发光特性，并且可以通过共价键固定于线粒体中，作为检测试剂用于监测线粒体自噬过程中线粒体的粘度变化，检测手段简单灵敏。

Description

监测线粒体自噬的荧光粘度探针及制备和应用
技术领域
本发明属于粘度荧光探针技术领域，具体涉及一种监测线粒体自噬的荧光粘度探针及制备和应用。
背景技术
作为真核细胞的一种重要细胞器，线粒体被认为是细胞的能量工厂，调控细胞的能量代谢，信号传导以及细胞的分化，生长与死亡。线粒体损伤或功能障碍会导致许多病理过程，如衰老，凋亡和细胞损伤等。为了保持线粒体质量和数量的稳定，细胞可通过自我吞噬的方式将受损或过量的线粒体选择性分解并进行再利用。线粒体自噬是自我吞噬的一种，即受损线粒体被选择性的隔绝成自噬线粒体，然后自噬线粒体与附近的溶酶体融合，形成自噬溶酶体(即包裹线粒体的自噬体)，依靠溶酶体内酸性水解酶将自噬溶酶体中的线粒体降解的过程。线粒体自噬水平异常与许多神经退行性疾病，癌症，肥胖症以及糖尿病等疑难杂症的密切相关。因此，开发监测线粒体自噬发生过程的探针将有助于深刻理解线粒体自噬相关的生理和病理过程，并将为筛选线粒体自噬抑制剂或促进剂提供有力工具。
一般来说，线粒体自噬发生时，线粒体会被自噬体吞噬并与溶酶体结合，由于线粒体和溶酶体的内在差异，线粒体基质内粘度，pH或极性等微环境会发生明显变化。很明显，通过检测线粒体内微环境的变化可为实时监测线粒体自噬过程提供一种有效且实用分析方法。其中，粘度是生物系统的一个重要参数，线粒体基质内粘度直接影响着线粒体的新陈代谢，粘度异常可能导致线粒体功能障碍。目前，文献已经报道了许多线粒体靶向型粘度荧光探针，然而能够真正用于线粒体自噬过程监测的高灵敏粘度探针极其有限，且这些探针大多数仅仅通过静电作用与线粒体膜电位结合，即当线粒体膜电位降低时，静电吸引力减弱甚至消失，探针就会脱离线粒体基质，这一结果对线粒体标记和成像极其不利。此外，该类探针多是基于聚集导致淬灭发光机理，即低浓度发光，高浓度或聚集状态时会发生荧光淬灭，严重影响其作为发光材料的有效性。具有聚集诱导(AIE)发光特性的分子在溶解时，由于分子内自由旋转不发光或发光很弱；然而，一旦聚集或限制在刚性环境中，分子内运动的受限就会发出强烈的荧光。因此，开发具有聚集诱导发光特性且可监测线粒体自噬发生过程的高灵敏度荧光粘度探针是非常有必要的。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种具有近红外聚集诱导荧光发射特性的荧光粘度探针(CS-Py-BC)，利用其正电荷结构与线粒体负性膜电位的静电作用相结合，使探针靶向聚集于线粒体中，同时通过分子中氯化苄官能团与线粒体膜蛋白的巯基共价键合，使探针固定于线粒体内。利用AIE分子运动受限的特性实现对线粒体粘度的高灵敏识别，同时通过跟踪线粒体自噬过程中的粘度变化实现对线粒体自噬过程的可视化监测。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种监测线粒体自噬的荧光粘度探针，其特征在于，结构式为：
Figure BDA0002740896800000021
一种监测线粒体自噬的荧光粘度探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将4-溴苯基乙腈和t-BuOK依次加入到无水乙醇中；然后将4-二乙氨基-2-甲氧基-苯甲醛(化合物1)缓慢加入到上述混合液中，加热回流反应；反应结束后冷却至室温，真空浓缩溶剂，经硅胶柱色谱提纯得到黄色固体，即化合物2((Z)-2-(4-溴苯基)-3-(4-(二乙氨基)-2-甲氧基苯基)丙烯腈)；
步骤2：将化合物2、K2CO3和4-吡啶基硼酸混合溶解在THF/H2O体系中，再加入Pd(PPh3)4；将体系在氮气保护下加热回流，反应结束后冷却至室温，真空浓缩溶剂，经硅胶柱色谱提纯得到橘色固体，即化合物3((Z)-3-(4-(二乙氨基)-2-甲氧基苯基)-2-(4-(吡啶-4-基)苯基)丙烯腈)；
步骤3：将化合物3和和对二氯苄溶于无水甲醇中，加热回流反应；反应结束后冷却至室温，向体系中加入醋酸酐；过滤得到沉淀并在真空中干燥，产物无需纯化直接进行下一步反应；
步骤4：将步骤3得到的产物溶解于丙酮中，加入KPF6并加热回流反应，反应结束后体系冷却至室温，减压旋蒸，除去溶剂，制得粗品；
步骤5：将步骤4制得的粗品经硅胶柱色谱提纯，得到紫黑色固体，即荧光粘度探针CS-Py-BC。
本发明所述的荧光粘度探针CS-Py-BC的制备反应式如下：
Figure BDA0002740896800000031
本发明所述的化合物3的制备过程可参考具有类似结构的现有技术，参考文献为G.L.Niu,R.Y.Z,Y.Gu,J.G.Wang,C.Ma,R.T.K.Kwok,J.W.Y.Lam,H.H.Y.Sung,I.D.Williams,K.S.Wong,X.Q.Yu and B.Z.Tang,Biomaterials,2019,208,72–82.
进一步，所述步骤3中化合物3和对二氯苄的摩尔比为1:10。
进一步，所述步骤3中加热回流的反应时间为20～24h，反应温度为80℃。
进一步，所述步骤4中加热回流的反应时间为20～24h，反应温度为70℃。
进一步，所述步骤5中的硅胶柱色谱用体积配比为10:1的二氯甲烷/无水甲醇洗脱剂。
本发明提供的荧光粘度探针具有聚集诱导发光的特性，探针的近红外荧光强度随环境粘度的增加而逐渐增强。
一种监测线粒体自噬的荧光粘度探针在制备监测活细胞线粒体内粘度变化试剂中的应用。所述荧光粘度探针的氯化苄官能团与线粒体膜蛋白的巯基共价结合固定于线粒体上，基于此，可用于制备监测活细胞线粒体内粘度变化的试剂。
一种监测线粒体自噬的荧光粘度探针在制备监测线粒体自噬过程中线粒体粘度变化试剂中的应用，实现对线粒体自噬过程的可视化监测。
一种监测线粒体自噬的荧光粘度探针在HeLa细胞中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述的监测线粒体自噬的线粒体固定型荧光粘度探针以氰基二苯乙烯为聚集诱导荧光核，分别连接氯化苄取代的吡啶正电荷结构为吸电子基团(A)，二乙基氨和甲氧基为给双电子基团(D)，形成D-π-A构型；在乙腈-水混合溶剂中随着水含量的增加，探针荧光逐渐增强，具有典型的聚集诱导荧光发射特性；
(2)所述探针对粘度变化的识别原理：在溶解状态或低粘度溶液中，由于分子内单键自由旋转，整个分子不共平面，探针几乎没有荧光；当处在粘度较大的溶液中时，分子内自由旋转运动受到限制，使得整个分子共平面，探针就会发出很强的荧光；
(3)所述探针在水-甘油体系中，当溶液粘度η从0.903cP增加到1000cP时，650nm处的近红外荧光强度逐渐增强超过92倍；并且log I650与logη存在良好的线性关系(R2＝0.9923)，斜率高达0.678，具有高灵敏定量检测环境粘度的特性；
(4)所述探针对环境粘度的检测具有所述探针对粘度响应具有高选择性，不受环境极性，pH和生物体系其他物质的干扰；
(5)所述探针利用分子中吡啶正电荷结构与线粒体负性膜电位的静电作用相结合，使探针靶向聚集于线粒体中，同时通过吡啶连接的氯化苄官能团与线粒体膜蛋白的巯基共价键合，使探针进一步固定于线粒体内；应用于线粒体自噬过程中粘度变化监测时，可有效抵御自噬过程中微环境变化(如线粒体碱化和膜去极化造成线粒体膜电位降低等)的影响，具有高灵敏、可靠性、可视化、快速便捷等特点，预示其在线粒体相关生物研究与医疗诊断方面具有良好的应用前景；
(6)所述的检测手段简单，只需包括荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜。
附图说明：
图1为本发明探针CS-Py-BC的核磁表征，1H-NMR谱；
图2为本发明探针CS-Py-BC的核磁表征，13C-NMR谱；
图3为本发明探针CS-Py-BC的核磁表征，HR-MS谱；
图4为本发明探针CS-Py-BC在乙腈-水混合溶剂中随含水体积含量变化的荧光发射光谱图；
图5为本发明探针CS-Py-BC的相对荧光强度(I/I0)在乙腈-水混合体系中随体积含量变化的曲线；
图6为本发明探针CS-Py-BC在水-甘油混合溶剂中随甘油体积含量变化的荧光发射光谱图；
图7为本发明探针CS-Py-BC的log I在水/甘油混合体系中随logη变化的曲线；
图8为本发明探针CS-Py-BC在不同极性溶液中的荧光发射光谱图；
图9为本发明探针CS-Py-BC在不同甘油体积含量的水-甘油(0％,50％和90％)混合溶剂中，随pH由3.0变化到8.0时的荧光发射光谱图；
图10为本发明探针CS-Py-BC在常见金属离子、阴离子和生物活性小分子存在下，对甘油的荧光光谱的选择性；
图11为本发明探针CS-Py-BC与市售线粒体特异性染料(MTDR)共染活细胞，经CCCP处理使细胞膜电位降低前后，二者的荧光共定位成像图像；
图12为本发明探针CS-Py-BC在制霉菌素(nystatin)刺激的HeLa细胞粘度变化的实时荧光成像；
图13为本发明荧光探针CS-Py-BC分别在富含营养物质的正常培养基、诱导细胞发生自噬过程的饥饿培养基和抑制自噬的培养基中培养的细胞荧光成像变化图。
图14为本发明荧光探针CS-Py-BC与HeLa细胞孵育30min后，加入雷帕霉素以及自噬抑制剂(氯喹)诱导线粒体发生自噬，细胞的荧光成像变化图。
具体实施方式
实施例1
一种监测线粒体自噬的荧光粘度探针的制备及表征：
Figure BDA0002740896800000071
(1)在圆底烧瓶中，将4-溴苯基乙腈(0.588g,3mmol)和t-BuOK(0.336g,3mmol)依次加入到(30mL)无水乙醇中，室温下搅拌10分钟；然后将4-二乙氨基-2-甲氧基-苯甲醛(0.621g,3mmol)缓慢加入到上述混合液中，回流6小时；将体系冷却至室温，真空浓缩溶剂，经硅胶柱色谱提纯(石油醚/乙酸乙酯,5:1,v/v)得到黄色固体为化合物2(0.806g,产率70％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm):8.26(d,J＝8.8Hz,1H),7.91(s,1H),7.53–7.48(m,4H),6.36(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H),6.11(s,1H),3.87(s,3H),3.43(q,J＝6.8Hz,4H),1.23(t,J＝7.2Hz,6H)。
(2)将化合物2(0.346g,0.9mmol)，K2CO3(0.138g,1mmol)和4-吡啶基硼酸(0.123g,1mmol)混合溶解在THF/H2O(9mL/1mL)体系中，再加入Pd(PPh3)4(0.015g,0.013mmol)；将体系在氮气保护下回流12小时，冷却至室温，真空浓缩溶剂，经硅胶柱色谱提纯(石油醚/乙酸乙酯,1:1,v/v)得到橘色固体为化合物3(0.166g,产率48％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm):8.67(d,J＝5.2Hz,2H),7.82–7.48(m,7H),6.93(d,J＝8.8Hz,1H),6.15–5.93(m,2H),5.39–5.31(m,1H),3.86(s,3H),3.50–3.30(m,4H),1.25–1.13(m,6H)。
(3)将化合物3(0.077g,0.2mmol)与对二氯苄(0.348mg,2mmol)在无水乙醇(2mL)中混合并回流24小时；将体系冷却至室温，再加入乙酸酐(10mL)，过滤沉淀，真空干燥，得到粗品无需纯化。将上述粗品溶解在丙酮(2mL)中，加入KPF6(0.184mg,1mmol)；反应混合物在室温下搅拌24小时，真空浓缩溶剂，经硅胶柱色谱提纯(二氯甲烷/无水甲醇,10:1,v/v)得到紫黑色固体为目标产物CS-Py-BC(0.049mg,产率37％)。如图1和图2所述，1H NMR(400MHz,DMSO-d6):9.18(d,J＝6.4Hz,2H),8.54(d,J＝6.4Hz,2H),8.19–8.10(m,3H),8.09(s,1H),7.82(d,J＝8.4Hz,2H),7.54(q,J＝8.1Hz,4H),6.47(d,J＝9.2Hz,1H),6.24(s,1H),5.82(s,1H),4.77(s,2H),3.89(s,3H),3.51–3.45(m,4H),1.16(t,J＝6.8Hz,6H).13CNMR(150MHz,DMSO-d6):δ(ppm)：171.98,160.92,154.53,145.26,139.77,138.63,135.05,132.43,130.14,129.50,129.46,129.05,127.56，126.10,124.96,119.79，65.40，62.49,56.14,54.52,45.94,22.96,15.65，12.99.HR-MS m/z(图3)：[M+H]+calclated forC33H34ClF6N3OP+,668.1954；measured,668.2018。
实施例2
荧光探针CS-Py-BC在乙腈-水混合溶剂中的聚集诱导荧光发射特性
用乙腈-水混合溶剂将实施例1中的荧光探针稀释至终浓度为5μmol/L，固定激发波长为470nm，记录探针随水体积含量变化的荧光发射光谱(图4)，并绘制探针相对荧光强度(I/I0)在乙腈-水混合体系中随体积含量变化的曲线(图5)。随着水体积比由0％增加到95％，686nm的荧光强度逐渐增强并蓝移至645nm，且在水体积为85％时达到最大值，说明探针具有典型的聚集诱导发光特性。
实施例3
荧光探针CS-Py-BC在水-甘油混合溶剂中对粘度的荧光响应特性
用水-甘油混合溶剂将实施例1中的荧光探针稀释至终浓度为5μmol/L，固定激发波长为470nm，记录探针随含甘油体积含量变化(或粘度系数η)的荧光发射光谱(图6)，并绘制探针在650nm处的荧光强度数值(log I650)，在水-甘油混合体系中随粘度系数(logη)变化的曲线(图7)。随着甘油体积比由0％(0.903cP)增加到100％(1000cP)，650nm的荧光强度依次增加，且在甘油体积为100％时达到最大值，说明探针的相对荧光强度随着环境粘度的增加显著增强。
实施例4
将实施例1中的荧光探针CS-Py-BC浓度保持在5μmol/L，考察该探针在不同极性溶液中的荧光发射光谱。如图8所示，探针只在100％甘油体系中具有显著荧光增强，而在其他不同极性溶剂中，荧光相对变化不大，说明探针对粘度的响应基本不受溶剂极性的影响。
实施例5
将实施例1中的荧光探针CS-Py-BC浓度保持在5μmol/L，考察该探针分别在含有10％,50％和90％甘油的水-甘油体系中，随pH变化的荧光光谱。如图9所示，随着pH从3.0增加到8.0，探针的荧光强度基本保持稳定，说明探针对粘度的响应不受pH变化的影响。
实施例6
将实施例1中的荧光探针CS-Py-BC浓度保持在5μmol/L，分别考察该探针在常见离子及生物活性小分子存在下，对其荧光光谱的选择性。如图10所示，在DMSO/PBS(1/199，v/v)体系中，pH 7.4时，分别加入下述物质(1mmol)对探针CS-Py-BC的荧光强度几乎没有干扰。图10中各物质依次为：1.CS-Py-BC+甘油；2,CS-Py-BC+水；3,CS-Py-BC+Na+；4,CS-Py-BC+K+；5,CS-Py-BC+Ba2+；6,CS-Py-BC+Ca2+；7,CS-Py-BC+Cu2+；8,CS-Py-BC+Hg2+；9,CS-Py-BC+Fe2+；10,CS-Py-BC+Fe3+；11,CS-Py-BC+ClO-；12,CS-Py-BC+Cl-；13,CS-Py-BC+CO3 2-；14,CS-Py-BC+NO3-；15,CS-Py-BC+S2O3 2-；16,CS-Py-BC+Phe；17,CS-Py-BC+Trp；18,CS-Py-BC+Thr；19,CS-Py-BC+Ser；20,CS-Py-BC+Pro；21,CS-Py-BC+Arg；22,CS-Py-BC+GSH；23,CS-Py-BC+His；24,CS-Py-BC+Gln。
实施例7
为了观察探针CS-Py-BC是否能够靶向聚集于活细胞线粒体中，进行了探针与市售线粒体特异性染料MitoTracker Deep Red(MTDR)的共定位实验。将贴壁的HeLa细胞与MTDR(终浓度0.3μmol/L)在pH 7.4的条件下，于37℃、5％CO2的孵育箱中孵育30min后，用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)轻轻洗涤3次，除去多余的染料。然后加入探针CS-Py-BC(终浓度5μmol/L)继续共同孵育30min，在激光共聚焦显微镜下观察二者的共定位情况。考虑到探针CS-Py-BC的近红外荧光发射与市售MTDR的近红外红光发射范围有些重叠，为了获得具有合适信噪比的共定位图像，在此探针CS-Py-BC固定激发波长为488nm，选择假绿色荧光成像，收集绿色通道范围560-660nm；MTDR的固定激发波长为633nm，收集红色通道范围675-775nm。由图11可知，荧光探针CS-Py-BC呈典型的绿色棒状线粒体形态，且与MTDR能够很好地重叠，得到黄色重叠荧光，经软件处理荧光探针CS-Py-BC与MTDR的平均共定位系数(A)高达0.94。说明荧光探针CS-Py-BC与MTDR具有显著的共定位成像，能够靶向定位于线粒体中。为了进一步证实探针能够共价结合于线粒体中，然后在细胞中加入carbonyl cyanidem-chlorophenylhydrazone(CCCP)，快速降低线粒体膜电位，发现探针与MTDR的荧光重叠程度保持在0.90以上(图11)，说明即使随着膜电位的降低，探针CS-Py-BC依然牢固的聚集于线粒体中，这可能是由于探针分子中的氯化苄基团与线粒体膜蛋白的巯基共价键合，使探针进一步共价固定于线粒体内。
实施例8
将贴壁的HeLa细胞与实施例1中的荧光探针CS-Py-BC(终浓度5μmol/L)在pH 7.4的条件下，于37℃、5％CO2的孵育箱中孵育30min后，无需洗涤，在在激光共聚焦显微镜下探针的荧光成像。如图12所示，探针本身在细胞中发射较弱的荧光，然后加入制霉菌素(nystatin，终浓度5μg/mL)刺激细胞20min，可观察到细胞内荧光发射逐渐增强；同时，线粒体形态由典型的棒状转变为球状，说明制霉菌素会导致线粒体内粘度的升高以及线粒体形态的变化，而且探针CS-Py-BC能够高灵敏监测线粒体内粘度的变化。
实施例9
将贴壁的HeLa细胞与实施例1中的荧光探针CS-Py-BC(终浓度5μmol/L)分别在富含营养物质的正常培养基(Rich-nutrient)、Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS，诱导细胞发生自噬过程的饥饿培养基，即Starvation)和抑制自噬的培养基(HBSS加3-甲基腺嘌呤(3-MA)，即Starvation+3-MA)(3-甲基腺嘌呤是抑制细胞自噬的药物，终浓度：100μmol/L)中连续培养。分别于0min，30min，1h，2h和3h时在激光共聚焦显微镜下观察其荧光变化情况。如图13所示，HeLa细胞在(正常培养基，Rich-nutrient)条件和Starvation+3-MA(抑制自噬培养基)条件下，细胞的荧光发射基本保持不变；只有在Starvation(诱导自噬培养基)条件下细胞的红色荧光随时间的延长逐渐增强，说明在线粒体自噬过程中线粒体内粘度逐渐升高，同时表明本发明的荧光探针CS-Py-BC能够通过监测线粒体粘度的变化来有效的监测线粒体自噬过程。
实施例10
将贴壁的HeLa细胞与实施例1中的荧光探针CS-Py-BC(终浓度5μmol/L)在37℃、5％CO2的孵育箱中共同孵育30min，在共聚焦显微镜下观察到探针微弱的红色荧光(图14)。随后，在细胞中加入雷帕霉素(Rapamycin，一种线粒体自噬诱导剂，终浓度：5μg/mL)诱导线粒体发生自噬，可观察到细胞的红色荧光随时间延长逐渐增强，说明在细胞在线粒体自噬过程中线粒体内粘度逐渐升高；此外，在雷帕霉素和自噬抑制剂(氯喹，终浓度：10μmol/L)同时作用时，细胞的荧光发射基本保持不变；表明本发明的荧光探针CS-Py-BC能够通过监测线粒体内粘度的变化来有效的监测细胞的线粒体自噬过程。

Claims (9)

1.一种监测线粒体自噬的荧光粘度探针，其特征在于，结构式为：
Figure FDA0002740896790000011
2.一种如权利要求1所述的监测线粒体自噬的荧光粘度探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将化合物((Z)-3-(4-(二乙氨基)-2-甲氧基苯基)-2-(4-(吡啶-4-基)苯基)丙烯腈)和对二氯苄溶于无水甲醇中，加热回流反应；反应结束后冷却至室温，向体系中加入醋酸酐；过滤得到沉淀并在真空中干燥，产物无需纯化直接进行下一步反应；
步骤2：将步骤1得到的产物溶解于丙酮中，加入KPF6并加热回流反应，反应结束后体系冷却至室温，减压旋蒸，除去溶剂，制得粗品；
步骤3：将步骤2制得的粗品经硅胶柱色谱提纯，得到紫黑色固体，即荧光粘度探针CS-Py-BC。
3.如权利要求2所述的一种监测线粒体自噬的荧光粘度探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1中化合物((Z)-3-(4-(二乙氨基)-2-甲氧基苯基)-2-(4-(吡啶-4-基)苯基)丙烯腈)和对二氯苄的摩尔比为1:10。
4.如权利要求2所述的一种监测线粒体自噬的荧光粘度探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1中加热回流的反应时间为20～24h，反应温度为80℃。
5.如权利要求2所述的一种监测线粒体自噬的荧光粘度探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2中加热回流的反应时间为20～24h，反应温度为70℃。
6.如权利要求2所述的一种监测线粒体自噬的荧光粘度探针的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的硅胶柱色谱用体积配比为10:1的二氯甲烷/无水甲醇洗脱剂。
7.一种如权利要求6所述的监测线粒体自噬的荧光粘度探针在制备监测活细胞线粒体内粘度变化试剂中的应用。
8.一种如权利要求6所述的监测线粒体自噬的荧光粘度探针在制备监测线粒体自噬过程中线粒体粘度变化试剂中的应用。
9.一种如权利要求1～8任意一项所述的监测线粒体自噬的荧光粘度探针在HeLa细胞中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115073433A (zh) * 2022-06-14 2022-09-20 山西大学 具有聚集诱导发光特性的线粒体靶向近红外粘度荧光探针

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105838354A (zh) * 2016-04-26 2016-08-10 中国科学院化学研究所 Hqo作为监测活细胞中线粒体自噬过程荧光探针的应用
CN107922834A (zh) * 2015-04-13 2018-04-17 香港科技大学 用具有aie特性的荧光光稳定线粒体特异生物探针实时监测线粒体自噬过程
CN110229660A (zh) * 2019-06-21 2019-09-13 曲阜师范大学 一种羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针及其制备方法和应用
CN111116574A (zh) * 2019-12-25 2020-05-08 渤海大学 一种具有线粒体靶向功能的粘度荧光探针及其制备方法和应用
CN111777548A (zh) * 2020-08-03 2020-10-16 山西大学 一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针csp

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107922834A (zh) * 2015-04-13 2018-04-17 香港科技大学 用具有aie特性的荧光光稳定线粒体特异生物探针实时监测线粒体自噬过程
CN105838354A (zh) * 2016-04-26 2016-08-10 中国科学院化学研究所 Hqo作为监测活细胞中线粒体自噬过程荧光探针的应用
CN110229660A (zh) * 2019-06-21 2019-09-13 曲阜师范大学 一种羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针及其制备方法和应用
CN111116574A (zh) * 2019-12-25 2020-05-08 渤海大学 一种具有线粒体靶向功能的粘度荧光探针及其制备方法和应用
CN111777548A (zh) * 2020-08-03 2020-10-16 山西大学 一种线粒体-溶酶体迁移型膜电位荧光探针csp

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AO JIANG等: "Ratiometric two-photon fluorescent probe for in situ imaging of carboxylesterase (CE)-mediated mitochondrial acidification during medication", 《CHEM. COMMUN》 *
CHRIS WAI TUNG LEUNG等: "A Photostable AIE Luminogen for Specific Mitochondrial Imaging and Tracking", 《J. AM. CHEM. SOC.》 *
HAMIDREZA AKRAMI等: "Indolinone-based acetylcholinesterase inhibitors: Synthesis, biological activity and molecular modeling", 《EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》 *
RUIQING FENG等: "Construction of the FRET Pairs for the Visualization of Mitochondria Membrane Potential in Dual Emission Colors", 《ANAL. CHEM.》 *
WEN CHEN等: "Engineering Organelle-Specific Molecular Viscosimeters Using Aggregation-Induced Emission Luminogens for Live Cell Imaging", 《ANAL. CHEM.》 *
中国化学会: "《化学学科发展报告》", 31 March 2018, 中国科学技术出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115073433A (zh) * 2022-06-14 2022-09-20 山西大学 具有聚集诱导发光特性的线粒体靶向近红外粘度荧光探针

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