CN108947935B - 一种吖嗪联肼类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有羟基苯，氮氮双键，二苯基及吗啉环的吖嗪联肼类化合物。本发明还公开了上述吖嗪联肼类化合物的制备方法，包括以下步骤：将二苯基肼衍生物与芳基水杨醛在溶剂中加热20～150℃反应1～24h，反应产物经分离提纯后即得到吖嗪联肼类化合物。本发明同时公开了上述化合物的应用，用于特异性识别革兰氏阳性菌及示踪革兰氏阳性菌。本发明的吖嗪联肼类化合物，具有显著的聚集诱导发光(AIE)性质，溶解性，具有显著的细胞或细菌荧光染色能力，具有很好的应用前景。

Description

一种吖嗪联肼类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分析检测材料技术领域，特别涉及一种吖嗪联肼类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
随着国家经济和科学技术的快速发展以及人民生活水平的不断提高，个人身体健康的实时监测、疾病的预防和治疗逐渐成为人们更加关注的民生问题。相对于传统的体外化学检验的延迟性和放射线在线检测的危害性，荧光在线显像技术以其高效、绿色、实时性强的优势渐渐走入人们的视野，被广泛应用于细胞免疫学、微生物学、分子生物学、遗传学、神经生物学、病理学、肿瘤学、临床检验学、医学、植物学等方面的科研和民生等领域。
荧光显像技术的关键技术就是荧光物质作为标记探针(或染色剂)的选择。理想的探针分子通过物理或化学作用，特异性吸附在特定的细胞、组织和细菌上，在低能量光学辐照下实现二维或三维的成像，通过与荧光颜色、强度和分布情况来判断细胞或组织的健康情况。与普通的化学染色相比，荧光染色的灵敏度要高出100-1000倍，而且通过适当的功能修饰即可实现对活体的在线分析。目前的荧光探针(染料)是以人工合成的芳香环类化合物为主，较大的π电子离域范围可以实现探针分子对光辐射能量的高效吸收，进而通过弛豫、辐射跃迁得到长波长荧光，这个吸收光和发射光间的能量差值被称作斯托克斯位移。斯托克斯位移越小，说明它的吸收光和发射光的能量越接近，非辐射跃迁的比例较小，材料的量子产率可能较高，但化合物通常表现为严重的自吸收现象，干扰成像效果；当斯托克斯位移大时，分子的自吸收现象明显削弱，但是非辐射跃迁比例变大，所得的探针材料往往对光的利用率不高。
革兰氏阳性菌，一种致病菌，能够产生外毒素使人致病，常见的革兰氏阳性菌有葡萄球菌，粪球肠菌，肺炎双球菌，破伤风杆菌等。在治疗上，大多数革兰氏阳性菌都对青霉素敏感，而大多数革兰氏阴性菌则对青霉素不敏感，所以首先区分病原菌是革兰氏阳性菌还是阴性菌，在选择抗生素及之后的治疗方案方面意义重大。目前最常见的区分方法是革兰氏染色法，这种方法只能用于区分革兰氏阳性菌和阴性菌，操作步骤繁琐且处理后细菌也已失活。而现在的临床医疗研究需求不仅仅限于此，在能够区分两类细菌的同时更需要进行对细菌侵染人体细胞或组织的实时跟踪研究以及后续对药物效果的评估研究等。
吖嗪联肼类化合物，是对包含有一个或几个氮的共轭不饱和六元杂环或杂原子化合物的总称，它既包括常见的吡啶、嘧啶、三嗪和噻嗪类结构，也包含逐渐受到关注的芳基共轭型的腙、肼、酰胺类结构。由于分子结构独特的共轭特性及氮原子丰富的杂化形式和电子空间分布，使部分吖嗪联肼类化合物具有显著的荧光特性，其在荧光探针领域的应用逐步活跃起来。联肼结构主要是通过“＝N-N＝”形式将两侧的基团链接起来，使整个分子保持了良好共轭性，相对于类似的偶氮“-N＝N-”结构，联肼的电子离域能力有了很大提高，很适宜构筑高效率的荧光结构。遗憾的是，常规联肼结构中快速的分子内自由转动效应(孤对电子体积小，易于发生顺反异构)和聚集态下的过高的非辐射跃迁比例，导致其荧光量子产率下降严重，很难应用于常规的水系条件下的检测和荧光分析，如，细胞内亚结构的研究、细菌的特异性识别、水系中金属离子的监测等。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种吖嗪联肼类化合物，具有显著的聚集诱导发光(AIE)性质，溶解性，具有显著的细胞或细菌荧光染色能力。
本发明的另一目的在于提供上述吖嗪联肼类化合物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述吖嗪联肼类化合物的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种吖嗪联肼类化合物，具有以下结构：
Figure GDA0003527659560000021
其中，Ar表示芳香基团或其衍生结构，取代基R1,R2分别选自亚烷基、亚烷氧基、酯基中的一种。
优选的，所述的吖嗪联肼类化合物，具有如下任意一项结构式：
Figure GDA0003527659560000031
其中，A1-A4分别为氢、烷基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巯基、卤素取代基、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧基或其衍生基团、咔唑基或苯胺基中的一种。
优选的，所述的吖嗪联肼类化合物，具有如下任意一项结构式：
Figure GDA0003527659560000032
Figure GDA0003527659560000041
其中，B1-B8为氢、烷基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巯基、卤素取代基、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧基或其衍生基团、咔唑基或苯胺基中的一种。
所述烷基和烷氧基均为原子数为1～12的烷基和烷氧基。
优选的，所述的吖嗪联肼类化合物，具有如下任意一项结构式：
Figure GDA0003527659560000051
所述吖嗪联肼类化合物的制备方法，包括以下步骤：
将二苯基肼衍生物与芳基水杨醛在溶剂中加热20～150℃反应1～24h，反应产物经分离提纯后即得到吖嗪联肼类化合物。
优选的，所述分离提纯为分离提纯。
优选的，所述溶剂为甲醇、乙醇、乙酸、四氢呋喃、甲苯、苯、氯仿、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺和N-甲基吡咯烷酮中的一种或两种以上的混合。
所述吖嗪联肼类化合物的应用，用于特异性识别细胞中的溶酶体，以及特异性识别革兰氏阳性菌和示踪革兰氏阳性菌。
所述特异性识别细胞中的溶酶体，具体为：
在细胞培养皿中加入所述的吖嗪联肼类化合物，在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下观察；
所述特异性识别革兰氏阳性菌，具体为：
在细菌培养基中加入所述的吖嗪联肼类化合物，在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下观察；
所述示踪革兰氏阳性菌，具体为：
将所述的吖嗪联肼类化合物与革兰氏阳性菌共培养后再加入海拉细胞中，在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下观察革兰氏阳性菌侵染海拉细胞过程。
本发明的原理为：通过邻位羟基与肼中的N原子孤对电子形成分子内氢键，通过激发态下的分子内质子转移(ESIPT)，实现荧光光谱的有效红移；利用聚集态下分子内氢键和二苯基内旋转受限使该结构具有显著聚集诱导发光性质；通过引入柔性烷基链增加化合物的溶解性；通过引入吗啉环使分子达到靶向识别的目的；通过刚柔结合的分子设计使该类分子具有显著的细胞或细菌荧光染色能力。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明的化合物选择联肼结构作为共轭桥联基元，一方面利用单双键交替的形式保持探针分子的共轭程度，另一方面N原子的孤对电子具有较小的空间位阻，使其能够在一定程度上自由转动从调节空间体积，保证其能容易直接透过细胞膜，对细胞内亚结构进行选择；
(2)本发明的化合物在外围的共轭结构中引入二苯基的取代芳香结构，使分子结构上具有更大的自由度，能够根据细胞亚结构空间要求调整探针结构的构象；
(3)本发明的化合物在二苯基上引入柔性烷基链结构，使分子具有较好的溶解性；
(4)本发明的化合物在二苯基上接入柔性烷基链后又接入了吗啉环，利用吗啉环能够特异性识别细胞中的溶酶体，又可以特异性的和革兰氏阳性菌结合，可以用于监测细菌分裂或细菌侵入细胞等过程及药物效果评估的应用。
(5)本发明的化合物在联肼两端引入酚羟基结构，与N的孤对电子形成 ESIPT态(激发态下分子内的质子转移)，有效的增加斯托克斯位移，防止分子的自吸收现象；二苯基的自由转动引入RIR(分子内受限旋转)机制，强化了此类分子的AIE性能；酚羟基的水溶性也能够显著调节分子的脂水分配系数，从而增加探针直接透过细胞的几率；
(6)本发明的化合物由于分子独特的刚性结构导致荧光探针在细胞内的荧光情况与固体相似，便于在复杂体系内实现指认和定量分析。
附图说明
图1(A)为M1-DPAN在H2O/THF(99:1,v/v)的溶液中的归一化的紫外吸收光谱和荧光发射光谱；图1(B)为M1-DPAN在不同水和THF比例下的荧光发射光谱，插入图为M1-DPAN在365nm紫外灯照射下分别在THF和 H2O/THF(99:1,v/v)溶液中的荧光照片。
图2(A)为检测M1-DPAN光稳定性谱图；图2(B)为检测M1-DPAN对金黄色葡萄菌的抗菌活性谱图；图2(C)为M1-DPAN与Hela细胞共染后的细胞活性谱图。
图3为明场和荧光下的细菌染色照片，其中(A)(E)是铜绿假单胞菌，(B) (F)是大肠杆菌，(C)(G)是酿酒酵母菌，(D)(H)是白色念珠菌，(I)(M) 是金黄色葡萄球菌，(J)(N)是枯草芽孢杆菌，(K)(O)是粪球肠菌，(L)(P) 是枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和酿酒酵母菌的混合菌种。
图4为明场和荧光下不同时间金黄色葡萄球菌染色照片，其中(A)(E)是 0小时，(B)(F)是2小时，(C)(G)是4小时，(D)(H)是8小时，(I) (M)是12小时，(J)(N)是24小时,以及(K)(O)是侵染Hela细胞12 小时，(L)(P)是侵染Hela细胞12小时后的立体图像。
图5为将革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌混合后与化合物通式(I)共染后在激光扫描共聚焦显微镜下显示的荧光照片。
图6(A)为M2-DPAN在H2O/THF(99:1,v/v)的溶液中的归一化的紫外吸收光谱和荧光发射光谱；图6(B)为M2-DPAN在不同水和THF比例下的荧光发射光谱，插入图为M2-DPAN在365nm紫外灯照射下分别在THF和 H2O/THF(99:1,v/v)溶液中的荧光照片。
图7为明场和荧光下的细菌染色图片，其中(A)(H)是金黄色葡萄球菌， (B)(I)是枯草芽孢杆菌，(C)(J)是粪球肠菌,(D)(K)铜绿假单胞菌， (E)(L)是大肠杆菌，(F)(M)是酿酒酵母菌，(G)(N)是白色念珠菌；
图8(A)为6M-DPAS在THF和H2O/THF(99:1,v/v)的溶液中的归一化的紫外吸收光谱；图8(B)为6M-DPAS在THF和H2O/THF(99:1,v/v)的溶液中的荧光发射光谱。
图9为明场和荧光下的细胞染色图片，其中(A)是海拉细胞的明场图片， (B)是6M-DPAS探针在海拉细胞中的荧光图片，(C)是LTR探针在海拉细胞中的荧光图片，(D)是(B)和(C)叠加后的荧光图片。
图10(A)为4M-DPAN在THF和H2O/THF(99:1,v/v)的溶液中的归一化的紫外吸收光谱；图10(B)为4M-DPAN在不同水和THF比例下的荧光发射光谱。
图11为明场和荧光下金黄色葡萄球菌染色图片，其中(A)是金黄色葡萄球菌的明场图片，(B)是4M-DPAN探针在金黄色葡萄球菌中的荧光照片。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
按照如下合成路线，具体合成以下化合物：
Figure GDA0003527659560000081
(1)化合物2的合成
在回流条件下将化合物1(1.1g,2mmol)和过量水合肼的混合物搅拌4 小时。在反应完成后，旋蒸除去溶剂和剩下的水合肼，得到透明油状化合物2，产率为100％(1.2g)。
(2)化合物M1-DPAN的合成
化合物2(0.57g,1mmol)和化合物3(0.258g,1.5mmol)在回流条件下搅拌4小时。在反应完成后，用层析硅胶柱进行分离，所用洗脱剂为甲醇：丙酮：二氯甲烷＝1:16:30，得到黄色固态化合物M1-DPAN，产率为20.8％(0.13g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3),δ(TMS,ppm):12.68(s,1H),8.88(s,1H),8.28(d, J＝8.3Hz,1H),7.73(d,J＝8.1Hz,1H),7.71–7.66(m,2H),7.53–7.50(m,1H), 7.46–7.42(m,1H),7.33–7.29(m,3H),7.06–6.99(m,2H),6.94–6.87(m,2H),4.08(t, J＝6.5Hz,2H),4.01(t,J＝6.4Hz,2H),3.77(br,8H),2.51(br,8H),2.42(br,4H), 1.90–1.78(m,4H),1.63–1.53(m,8H),1.46-1.40(m,4H)；
13C NMR(125MHz,CDCl3),δ(TMS,ppm):167.12,163.39,161.32,159.74, 158.31,135.55,130.91,130.84,130.39,128.37,127.67,127.41,127.31,125.31, 124.95,123.79,118.69,114.33,114.22,111.33,67.95,66.65,58.97,53.61,53.43, 29.20,29.11,27.26,27.19,26.04,25.95；HRMS(MALDI-TOF):m/z[M-Cl]+计算值为C44H56N4O5:721.4329；实际测量值为:721.4329。
图1(A)为M1-DPAN在H2O/THF(99:1,v/v)的溶液中的归一化的紫外吸收光谱和荧光发射光谱；图1(B)为M1-DPAN在不同水和THF比例下的荧光发射光谱，插入图为M1-DPAN在365nm紫外灯照射下分别在THF和 H2O/THF(99:1,v/v)溶液中的荧光照片。[M1-DPAN]＝10μM；λex＝391nm。由图中可以看出，无论是在溶液态下还是在聚集态下，最大发射峰位置都是在525 nm左右，具有大的Stokes位移(134nm)的强发光，源于激发态分子内质子转移过程(ESIPT)过程，而且由于分子内氢键被保护且其自由运动受到抑制，因此它可以发射强的酮式发光。M1-DPAN随着水(不良溶剂)含量的不断增加，其荧光强度也不断增加，加之该分子在H2O/THF(体积比99:1)溶液中和固态下的量子产率分别为1.3％和10.6％，清楚地证实了其AIE性质。
图2(A)为检测M1-DPAN光稳定性谱图。[M1-DPAN]＝10μM.M1-DPAN 在405nm激发下30次扫描后发现，M1-DPAN的荧光发射强度仍保持在80％以上，这和商业化的染料(Lysotracker DND 99)的结果相似，说明M1-DPAN有优良的光稳定性；图2(B)为检测M1-DPAN对金黄色葡萄菌的抗菌活性谱图；图2(C)为M1-DPAN与Hela细胞共染后的细胞活性谱图。由图中可以看出，没有明显的对金黄色葡萄球菌和Hela细胞的细胞毒性，证实着M1-DPAN优异的生物适应性。以上可预示着M1-DPAN作为探针用于细胞显像等。
实施例2：实施例1中化合物用于革兰氏阳性细菌荧光染色
(1)细菌培养
a.金黄色葡萄球菌单菌落(革兰氏阳性)接种在5mL的NB培养基中，在37℃培养12h。之后菌落以7100转离心1分钟，同时用磷酸盐缓冲液(PBS,10 mM,pH＝7.4)冲洗三次，上清液弃去，留下的金黄色葡萄球菌悬浮在PBS中，然后在600nm下稀释到1.0个光密度(OD600＝1.0)。以同样的方法培育并得到枯草芽孢杆菌(革兰氏阳性)，粪球肠菌(革兰氏阳性)，铜绿假单胞菌(革兰氏阴性)，大肠杆菌(革兰氏阴性)，酿酒酵母菌(真菌)和白色念珠菌(真菌)。
b.混合菌种(酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌)在PBS缓冲溶液中与5μM浓度的M1-DPAN在37℃下共染20分钟，之后以7100转离心1 分钟，得到的染色后混合菌种置于10μL PBS缓冲溶液中，并保存在冰柜中用于激光扫描共聚焦显微镜检测。
c.金黄色葡萄球菌溶液(OD600＝1.0)在PBS缓冲溶液中与5μM浓度的 M1-DPAN在37℃下共染20分钟，并用PBS冲洗两次。之后菌落以7100转离心1分钟，上清液弃去，留下的金黄色葡萄球菌悬浮在100μL PBS缓冲溶液中，同时加入900μL DMEM(10％FBS)。
(2)细菌的荧光染色
100μL的七种不同的细菌液(OD600＝1.0)分别加入到400μL实施例1制备的M1-DPAN，溶解在PBS溶液中以达到终浓度为5μM，并在37℃下共染20 分钟。然后用激光扫描共聚焦显微镜技术进行荧光成像实验，在405nm激发下检测标本。结果如图3中(A-K,M-O)所示。
3μL染色后混合菌种固定在干净的玻片上，用激光扫描共聚焦显微镜技术进行荧光成像实验，在488nm激发下检测标本。结果如图3中(L)(P)所示。
图3为明场和荧光下的细菌染色照片，其中(A)(E)是铜绿假单胞菌，(B) (F)是大肠杆菌，(C)(G)是酿酒酵母菌，(D)(H)是白色念珠菌，(I)(M) 是金黄色葡萄球菌，(J)(N)是枯草芽孢杆菌，(K)(O)是粪球肠菌，(L)(P) 是枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和酵母菌的混合菌种。([M1-DPAN]＝5μM)。比例尺度等于5μm。由图中可以看出，在激光扫描共聚焦显微镜下，所示三种不同菌种，包括真菌，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中，只有属于革兰氏阳性菌菌种在激发下发出绿色的荧光，背景噪音的影响可以忽略。此外，将三种不同菌种的细菌混合在一起，在激光扫描共聚焦显微镜下发现只有革兰氏阳性菌能发出绿色荧光。因此M1-DPAN探针可特异性用于直接染色革兰氏阳性菌，以此区分于真菌和革兰氏阴性菌。
(3)荧光染色随时间变化实验
染色后的金黄色葡萄球菌加到Hela细胞中在37℃培养8小时，然后用激光扫描共聚焦显微镜技术进行荧光成像实验，在405nm激发下检测标本。同时用Zeiss LSM 710研究在金黄色葡萄球菌内的荧光定位。结果如图4中(K)(L) (O)(P)所示。
将金黄色葡萄球菌在PBS缓冲溶液中与M1-DPAN共染20分钟，然后混合溶液分别置于NB培养基培养不同时间，后用激光扫描共聚焦显微镜技术进行荧光成像实验得到不同染色时间下的荧光强度的变化。结果如图4中(A-J)(M) (N)所示。
图4为明场和荧光下不同时间金黄色葡萄球菌染色照片，其中(A)(E)是 0小时，(B)(F)是2小时，(C)(G)是4小时，(D)(H)是8小时，(I) (M)是12小时，(J)(N)是24小时,以及(K)(O)是侵染Hela细胞12 小时，(L)(P)是侵染Hela细胞12小时后的立体图像。由图中可以发现随着时间的迁移，金黄色葡萄球菌的荧光强度在不断下降，最后在染色24小时后完全消失，表明M1-DPAN可以在活体内或体外示踪细菌的分裂过程。用染色后的金黄色葡萄球菌侵染Hela细胞，在侵染12小时候仍可以清晰的观察到强的荧光发射，同时也用Z-stack成像研究金黄色葡萄球菌在Hela细胞内的定位，发现在细胞质中观察到明亮的绿色荧光，说明了金黄色葡萄球菌成功的侵染了Hela 细胞，并且能够通过检测M1-DPAN的荧光信号监测侵染行为。
图5为将革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌混合后与化合物通式(I)共染后在激光扫描共聚焦显微镜下显示的荧光照片。
实施例3：
按照如下合成路线，具体合成如下化合物：
Figure GDA0003527659560000111
(1)化合物M2-DPAN的合成
化合物2(0.57g,1mmol)和化合物4(0.258g,1.5mmol)在回流条件下搅拌4小时。在反应完成后，用层析硅胶柱进行分离，所用洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1:15，得到黄色固态化合物M2-DPAN，产率为15.3％(0.096g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3),δ(TMS,ppm):13.08(s,1H),9.72(s,1H),8.18(d, J＝8.5Hz,1H),7.76(t,J＝8.1Hz,2H),7.73–7.68(m,2H),7.57–7.51(m,1H), 7.38–7.33(m,1H),7.32–7.28(m,2H),7.09(d,J＝9.0Hz,1H),7.03–6.99(m,2H), 6.94–6.88(m,2H),4.06–3.98(m,4H),3.74(dd,J＝9.1,4.5Hz,8H),2.47(br,8H), 2.42–2.30(m,4H),1.89–1.75(m,5H),1.63–1.47(m,8H),1.46–1.35(m,4H).
13C NMR(125MHz,CDCl3),δ(TMS,ppm):167.32,161.38,160.98,159.78, 159.62,134.01,132.71,130.90,130.69,130.32,129.06,128.00,127.68,123.46, 120.07,119.26,114.26,114.24,108.74,68.00,67.88,66.91,59.07,59.04,53.75, 53.75,29.23,29.12,27.31,27.24,26.39,26.05,25.98；HRMS(MALDI-TOF,M+): m/z[M-Cl]+计算值为C44H56N4O5:721.4329；实际测量值为:721.4369。
图6(A)为M2-DPAN在H2O/THF(99:1,v/v)的溶液中的归一化的紫外吸收光谱和荧光发射光谱；图6(B)为M2-DPAN在不同水和THF比例下的荧光发射光谱，插入图为M2-DPAN在365nm紫外灯照射下分别在THF和 H2O/THF(99:1,v/v)溶液中的荧光照片。[M2-DPAN]＝10μM；λex＝393nm。由图中可以看出，无论是在溶液态下还是在聚集态下，最大发射峰位置都是在533 nm左右，具有大的Stokes位移(140nm)的强发光，源于激发态分子内质子转移过程(ESIPT)过程，而且由于分子内氢键被保护且其自由运动受到抑制，因此它可以发射强的酮式发光。M2-DPAN随着水(不良溶剂)含量的不断增加，其荧光强度也不断增加，加之该分子在H2O/THF(体积比99:1)溶液中和固态下的量子产率分别为0.6％和1.4％，清楚地证实了其AIE性质。
(3)细菌的荧光染色
100μL的七种不同的细菌液(OD600＝1.0)分别加入到400μL实施例3(1) 制备的M2-DPAN，溶解在PBS溶液中以达到总浓度为5μM，并在37℃下共染20分钟。然后用激光扫描共聚焦显微镜技术进行荧光成像实验，在405nm 激发下检测标本。结果如图7中(A-N)所示。
图7为明场和荧光下的细菌染色图片，其中(A)(H)是金黄色葡萄球菌， (B)(I)是枯草芽孢杆菌，(C)(J)是粪球肠菌,(D)(K)铜绿假单胞菌， (E)(L)是大肠杆菌，(F)(M)是酵母菌，(G)(N)是白色念珠菌。([M2-DPAN] ＝5μM)。比例尺度等于5μm。由图中可以看出，在激光扫描共聚焦显微镜下，所示三种不同菌种，包括真菌，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中，只有属于革兰氏阳性菌菌种在激发下发出绿色的荧光，背景噪音的影响可以忽略。因此M2-DPAN探针也可特异性用于直接染色革兰氏阳性菌，以此区分于真菌和革兰氏阴性菌。
实施例4：
按照如下合成路线，具体合成如下化合物:
Figure GDA0003527659560000131
(1)化合物6M-DPAS的合成：
化合物2(0.57g,1mmol)和化合物5(0.183g,1.5mmol)在回流条件下搅拌4小时。在反应完成后，用层析硅胶柱进行分离，所用洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1:15，得到棕色固态化合物6M-DPAS，产率为50.8％(0.3886g)。1H NMR(500MHz,CDCl3),δ(TMS,ppm):11.58(s,1H),8.74(s,1H),7.79(d, 2H),7.54–6.38(m,10H),3.94–3.60(m,16H),2.48–2.38(m,12H),1.73– 1.25(m,12H).HRMS(MALDI-TOF,M+):m/z[M-Cl]+计算值为 C44H56N4O5:670.9854；实际测量值为:670.8806。
图8(A)为6M-DPAS在THF和H2O/THF(99:1,v/v)的溶液中的归一化的紫外吸收光谱；图8(B)为6M-DPAS在THF和H2O/THF(99:1,v/v)的溶液中的荧光发射光谱。[6M-DPAS]＝10μM；λex＝358nm。由途中可以看出，无论是在溶液态还是聚集态下，最大发射峰位置都是在544nm左右，具有大的Stokes位移(186nm)的强发光，源于激发态分子内质子转移过程(ESIPT)过程，而且由于分子内氢键被保护且其自由运动受到抑制，因此它可以发射强的酮式发光。
(2)细胞的荧光染色
将6M-DPAS(10μM)和商业化的溶酶体染料LTR(100nM)混合后对海拉细胞进行染色实验。然后用荧光显微镜技术进行荧光成像实验，在 330-385nm(6M-DPAS)和540-580nm(LTR)激发下检测标本。结果如图 9中(A-D)所示
图9为明场和荧光下的细胞染色图片。其中(A)是Hela细胞的明场图片，(B)是6M-DPAS探针在海拉细胞中的荧光图片，(C)是LTR探针 Hela细胞中的荧光图片，(D)是(B)和(C)叠加后的荧光图片。比例尺度等于20μm。由图中可以看出，在荧光显微镜下，6M-DPAS探针在Hela 细胞中发出黄色的荧光，LTR探针在Hela细胞的溶酶体中发出红色的荧光重叠后的图像几乎没有观察到单独的黄色或者红色的荧光图像，均为橙红色荧光囊泡结构，且重叠率达到95％。说明合成的6M-DPAS探针可以特异性靶向细胞中的溶酶体结构。
实施例5：
按照如下合成路线，具体合成如下化合物:
Figure GDA0003527659560000141
(1)化合物7的合成
在回流条件下将化合物6(0.993g,2mmol)和过量水合肼的混合物搅拌4 小时。在反应完成后，旋蒸除去溶剂和剩下的水合肼，得到透明油状化合物7，产率为100％(1.02g)。
(2)化合物4M-DPAN的合成
化合物7(0.51g,1mmol)和化合物3(0.258g,1.5mmol)在回流条件下搅拌4小时。在反应完成后，用层析硅胶柱进行分离，所用洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1:20，得到黄色固态化合物4M-DPAN。
1H NMR(500MHz,CDCl3),δ(TMS,ppm):12.67(s,1H),8.88(s,1H),8.28(s,, 1H),8.28(d,1H),7.70(m,3H),7.51(m,1H),7.44(m,1H),7.31(m,4H),7.03(m, 2H),6.90(m,2H),4.07(t,2H),4.01(t,2H),3.74(br,8H),2.44(br,12H),1.79(m, 8H)；
图10(A)为4M-DPAN在THF和H2O/THF(99:1,v/v)的溶液中的归一化的紫外吸收光谱；图10(B)为4M-DPAN在不同水和THF比例下的荧光发射光谱。[4M-DPAN]＝7.5μM；λex＝393nm。由途中可以看出，无论是在溶液态还是聚集态下，最大发射峰位置都是在527nm左右，具有大的Stokes位移 (169nm)的强发光，源于激发态分子内质子转移过程(ESIPT)过程，而且由于分子内氢键被保护且其自由运动受到抑制，因此它可以发射强的酮式发光。4M-DPAN随着水(不良溶剂)含量的不断增加，其荧光强度也不断增加，加之该分子在THF和H2O/THF(体积比99:1)溶液中的量子产率分别为1.4％和8.0％，清楚地证实了其AIE性质。
(3)细菌的荧光染色
将4M-DPAN探针和金黄色葡萄球菌混合20分钟。然后用激光扫描共聚焦显微镜技术进行荧光成像实验，在405nm激发下检测标本。结果如图11所示。
图11为明场和荧光下金黄色葡萄球菌染色图片。其中(A)是金黄色葡萄球菌的明场图片，(B)是4M-DPAN探针在金黄色葡萄球菌中的荧光照片。 ([4M-DPAN]＝5μM)。比例尺度等于10μm。由图中可以看出，在激光扫描共聚焦显微镜下，属于革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌和可以很好的和4M-DPAN 探针特异性结合，发出绿色的荧光。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种吖嗪联肼类化合物，其特征在于，具有以下结构中的一种：
Figure FDA0003486072210000011
2.权利要求1所述吖嗪联肼类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将二苯基肼衍生物与芳基水杨醛在溶剂中加热20～150℃反应1～24h，反应产物经分离提纯后即得到吖嗪联肼类化合物。
3.根据权利要求2所述的吖嗪联肼类化合物的制备方法，其特征在于，所述溶剂为甲醇、乙醇、乙酸、四氢呋喃、甲苯、苯、氯仿、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺和N-甲基吡咯烷酮中的一种或两种以上的混合。
4.权利要求1所述吖嗪联肼类化合物的应用，其特征在于，用于制备特异性识别细胞中的溶酶体、特异性识别革兰氏阳性菌和示踪革兰氏阳性菌的探针中的用途。
5.根据权利要求4所述的吖嗪联肼类化合物的应用，其特征在于，所述特异性识别细胞中的溶酶体，具体为：
在细胞培养皿中加入权利要求1所述的吖嗪联肼类化合物，在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下观察；
所述特异性识别革兰氏阳性菌，具体为：
在细菌培养基中加入权利要求1所述的吖嗪联肼类化合物，在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下观察；
所述示踪革兰氏阳性菌，具体为：
将权利要求1所述的吖嗪联肼类化合物与革兰氏阳性菌共培养后再加入海拉细胞中，在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下观察革兰氏阳性菌侵染海拉细胞过程。
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