CN110950779B - 集细菌荧光成像与光动力杀菌于一体的光敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种集细菌荧光成像与光动力杀菌于一体的光敏剂及其制备方法和应用,光敏剂的名称为:(((((2,5‑双((Z)‑2‑(3,5‑二(三氟甲基)苯基)‑2‑氰基乙烯基)‑1,4‑亚苯基)双(苯胺基))双(4,1‑亚苯基))双(氧基))双(N,N,N‑三乙基丁‑1‑铵)溴化物,所述光敏剂的分子式为C72H74N6O2F12Br2,本发明的光敏剂具有聚集诱导发光特性和杀菌特性,不仅能进行细菌免洗的近红外荧光成像,而且在低功率白光照射下能产生活性氧,杀灭细菌。该光敏剂对金黄色葡萄球菌的荧光成像和光动力杀菌效果明显优于对大肠杆菌,因此,其对金黄色葡萄球菌的成像和杀灭具有选择性。
Description
技术领域
本发明属于荧光光敏剂的成像和光动力治疗技术领域,具体来说涉及一种集细菌荧光成像与光动力杀菌于一体的光敏剂及其制备方法和应用。
背景技术
细菌感染是困扰人类的一类高发性疾病,常规的方法是应用抗生素进行治疗,但是由于人类滥用抗生素,导致耐药性菌株不断出现,从而使抗生素的治疗效果迅速下降。随着耐药菌的广泛出现,细菌耐药问题日益严重。另一方面,抗生素的研发周期长、难度大、前期投入高,而且合成的药物毒副作用强,传统的抗生素已经不能满足人们的需要,人们亟需一种新型的抑菌治疗方法。光动力抗菌疗法是基于光动力反应的抗菌方法,由光敏剂、光、氧分子三者相互作用后,通过光动力反应产生活性氧(ROS),作用于病原菌的不同分子结构(如脂质、蛋白质、酶和DNA),对病原菌造成不可逆性损害,从而达到灭菌目的的治疗方法。
聚集诱导发光(aggregation-induced emission,AIE)现象是生色团聚集时发生的一种独特的光学现象。2001年,唐本忠院士课题组首先发现了该现象(Chem.Commun.2001, 1740)。他们发现1-甲基-1,2,3,4,5-五苯基噻咯(MPPS)在完全溶于溶液中时,基本没有荧光发射,而聚集态或固态表现出非常强的荧光发射,因此提出了“聚集诱导发光”的概念。 AIE分子在聚集态或固态条件下优异的发光性质,为彻底解决传统有机荧光材料的荧光自淬灭问题提供了一个全新的途径。此后,国内外众多研究者对于AIE现象进行了深入的研究探索,利用AIE分子构筑新型化学/生物荧光探针的研究已成为研究热点,并且取得一些颇有意义的研究成果。在荧光生物成像方面,利用AIE分子构筑的荧光标记材料不仅解决了传统荧光分子的聚集荧光淬灭问题,并且通过增加荧光分子负载浓度的方法,可以极大地提高荧光标记材料的荧光强度和抗光漂白能力。将AIE分子用于细菌的荧光成像和光动力学治疗,能够减小生物组织的背景干扰,提高荧光成像的信号强度和信噪比,增强活性氧产生,提高光动力治疗效果。因此,开发新型多功能荧光光敏剂,并将其用于细菌的荧光成像和光动力治疗技术具有广阔的应用前景。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种集细菌荧光成像与光动力杀菌于一体的光敏剂。
本发明的另一目的是提供上述光敏剂的合成方法。
本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。
一种集细菌荧光成像与光动力杀菌于一体的光敏剂,所述光敏剂(简称AIE-TEA)的名称为:(((((2,5-双((Z)-2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)-2-氰基乙烯基)-1,4-亚苯基)双(苯胺基))双(4,1-亚苯基))双(氧基))双(N,N,N-三乙基丁-1-铵)溴化物,所述光敏剂的分子式为C72H74N6O2F12Br2,光敏剂的结构式为:
在上述技术方案中,所述光敏剂在蓝光或紫外光激发下发出的光为600~800nm。
上述光敏剂的合成方法,包括以下步骤:
将化合物2、三乙胺和无水乙醇均匀混合,得到混合溶液,将所述混合溶液在氮气或惰性气体的保护下加热回流48~60小时,反应结束后,通过旋蒸除去无水乙醇,得到粗产物,对所述粗产物重结晶,得到产物为所述光敏剂,其中,所述化合物2的物质的量份数、三乙胺的物质的量份数与无水乙醇的体积份数的比为(0.029~0.031):(0.79~0.99): (0.5~1),所述物质的量份数的单位为mmol,所述体积份数的单位为mL,所述化合物2 为:
在上述技术方案中,通过正己烷和丙酮对所述粗产物重结晶:将粗产物放入丙酮中,再向丙酮中加入正己烷直至出现晶体,过滤得到所述光敏剂。
在上述技术方案中,所述化合物2由化合物1和1,4-二溴丁烷反应合成,化合物1的结构式为:
上述光敏剂在白光照射下具有选择性对金黄色葡萄球菌杀菌的应用。
在上述技术方案中,将细菌溶液与光敏剂溶液混合,得到细菌光敏剂混合物,再于37℃培养30分钟,在白光下照射15分钟,光照完成后,使用PBS缓冲液稀释1×104倍,得到细菌悬浮液,取细菌悬浮液置于固体LB培养基上,使用涂布器进行涂布,涂布完成后,将培养皿倒置在恒温培养箱中于37℃温育20个小时,其中:
当细菌光敏剂混合物中光敏剂的浓度为20~40μM时,且细菌溶液中的细菌为金黄色葡萄球菌时,细菌存活率为0~5%:
当细菌光敏剂混合物中光敏剂的浓度为20~40μM时,且细菌溶液中的细菌为大肠杆菌时,细菌存活率为30~50%。
在上述技术方案中,光敏剂溶液的制备方法为:将光敏剂加入至丙酮中得到光敏剂丙酮溶液,将光敏剂丙酮溶液滴加至磷酸缓冲溶液中,在室温20~25℃下搅拌至丙酮蒸发,得到光敏剂溶液。
在上述技术方案中,细菌溶液的制备方法为:将单菌落细菌转移到固体LB培养基里,在恒温振荡培养箱里培养,离心,移除上层清液,用PBS缓冲液将细菌的浓度稀释到108CFU/mL,得到细菌溶液。
在上述技术方案中,当所述白光的功率为4mW cm-2时,所述光敏剂的活性氧产生效率为83%。
上述光敏剂在对细菌荧光成像时具有选择性对金黄色葡萄球菌成像中的应用。
在上述技术方案中,将细菌溶液与光敏剂溶液混合,混合后在37℃下培养30分钟,得到光敏剂浓度为20μM的样品,将样品在荧光共聚焦显微镜下观察,激发波长为488 nm,荧光成像的波长收集范围为662~737nm,其中:
当所述细菌溶液中的细菌为金黄色葡萄球菌时,荧光共聚焦显微镜观察到金黄色葡萄球菌的表面发出深红或近红外荧光;
当所述细菌溶液中的细菌为大肠杆菌时,荧光共聚焦显微镜观察到大肠杆菌的表面无荧光。
上述光敏剂在丙醇水溶液聚集诱导发光中的应用,当丙酮水溶液中水的体积浓度≥ 70%时,所述光敏剂产生荧光,当丙酮水溶液中水的体积浓度为95%时,所述光敏剂的荧光强度为该光敏剂在纯丙酮中的荧光强度的41倍。
本发明的有益效果如下:
本发明的光敏剂具有聚集诱导发光特性和杀菌特性,不仅能进行细菌免洗的近红外荧光成像,而且在低功率(20mW cm-2)白光照射下能产生活性氧,杀灭细菌。在功率为4mWcm-2白光照射下,活性氧产生效率为83%。该光敏剂带有正电荷,能够通过静电相互作用在带负电的细菌表面聚集,同时由于AIE-TEA在低浓度时具有一定程度的水溶性,可以通过免洗简化实验步骤,进行细菌免洗荧光成像。同时,该光敏剂能够在低功率白光照射下释放活性氧,有效杀灭细菌,而且该低功率白光易获得,对生物体光学损害低。该光敏剂对金黄色葡萄球菌的荧光成像和光动力杀菌效果明显优于对大肠杆菌,因此,其对金黄色葡萄球菌的成像和杀灭具有选择性。
附图说明
图1为实施例1所得光敏剂的紫外-可见吸收光谱图和荧光光谱图;
图2为实施例1所得光敏剂在丙酮和不同浓度丙酮水溶液中的荧光光谱图;
图3的A为用低功率白光(4mW cm-2)照射溶液B后时间与吸光度的关系;
图3的B为获得溶液B的分解速率常数的曲线;
图4的A为光敏剂对金黄色葡萄球菌的荧光图像;
图4的B为光敏剂对大肠杆菌的荧光图像;
图4的C为光敏剂对金黄色葡萄球菌的明场图;
图4的D为光敏剂对大肠杆菌的明场图;
图5(a)为实施例1所得光敏剂对金黄色葡萄球菌的毒性柱状图;
图5(b)为实施例1所得光敏剂对大肠杆菌的毒性柱状图;
图6(a)为实施例1所得光敏剂对金黄色葡萄球菌的平板图像;
图6(b)为实施例1所得光敏剂对大肠杆菌的平板图像;
图7为金黄色葡萄球菌(A-F)和大肠杆菌(G-L)与PI培养后的激光共聚焦图像,标尺:5μm;
图8为金黄色葡萄球菌(A-E)和大肠杆菌(F-J)的扫描电镜图像,标尺:200nm。
具体实施方式
药品购买源:
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(大肠埃希氏菌)均购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心,具体如下:
分类命名(注明拉丁文名称):金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
保藏单位名称:中国普通微生物菌种保藏管理中心
地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
保藏日期:11/7/2012
保藏编号:1.12409
分类命名(注明拉丁文名称):大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
保藏单位名称:中国普通微生物菌种保藏管理中心
地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
保藏日期:3/28/2014
保藏编号:1.12883
下述实施例中所涉及测试仪器的型号和生产厂家:
CP214型电子天平用于药品的称取;
DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器用于反应的加热和搅拌;
SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵、YRE-2000E型旋转蒸发仪、DFY-5L/40低温恒温反应浴用于反应结束后除去溶剂;
101型电热鼓风干燥箱用于产物的干燥;
Bruker AV-400NMR核磁共振仪用于光敏剂核磁共振氢谱和碳谱数据的测定;
I/Xevo G2Q-Tof质谱仪用于光敏剂质谱数据的测定;
UV-3390型紫外光谱仪用于光敏剂的紫外-可见吸收光谱图和活性氧产生效率的测定;
Hitachi F-4500荧光光谱仪用于光敏剂在丙酮和不同浓度丙酮水溶液中的荧光光谱图;
PHS-3BW pH计用于测定LB培养基的pH值;
BS-1E数显恒温震荡培养箱用于细菌的培养;
H1650-W高速离心机用于离心除去细菌中的培养基;
尼康卓越A1激光共聚焦荧光显微镜用于细菌的成像实验和PI毒性实验;
250B数显恒温生化培养箱用于平板中细菌的培养;
JSM-6700F扫描电子显微镜用于观察细菌的形态。
在下述实施例中,化合物2由化合物1和1,4-二溴丁烷反应合成,具体参见参考文献:J.Zou,H.Lu,X.Zhao,W.Li,Y.Guan,Y.Zheng,L.Zhang and H.Gao,A multi-functionalfluorescent probe with aggregation-induced emission characteristics:Mitochondrial imaging,photodynamic therapy and visualizing therapeuticprocess in zebrafish model,Dyes Pigm.,2018,151,45.合成路线为:
对粗产物通过正己烷/丙酮重结晶的方法为:将粗产物放入丙酮中,再向丙酮中加入环己烷直至出现晶体为光敏剂,过滤即可。
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
一种集细菌荧光成像与光动力杀菌于一体的光敏剂,光敏剂(简称:AIE-TEA)的名称为:(((((2,5-双((Z)-2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)-2-氰基乙烯基)-1,4-亚苯基)双(苯胺基))双(4,1-亚苯基))双(氧基))双(N,N,N-三乙基丁-1-铵)溴化物,光敏剂的分子式为C72H74N6O2F12Br2,光敏剂的结构式为:
本发明的光敏剂在波峰为488nm的光源下发出红色荧光
实施例1
上述光敏剂的合成方法,包括以下步骤:
在圆底烧瓶中,将化合物2、三乙胺和无水乙醇均匀混合,得到混合溶液,将混合溶液在氮气的保护下加热回流48小时,反应结束后,通过旋蒸除去无水乙醇,得到粗产物,对粗产物通过正己烷/丙酮重结晶,得到产物AIE-TEA为光敏剂,其中,化合物2的物质的量份数、三乙胺的物质的量份数与无水乙醇的体积份数的比为0.029:0.79:0.5,物质的量份数的单位为mmol,体积份数的单位为mL,化合物2为:
实施例2
上述光敏剂的合成方法,包括以下步骤:
在圆底烧瓶中,将化合物2、三乙胺和无水乙醇均匀混合,得到混合溶液,将混合溶液在氮气的保护下加热回流52小时,反应结束后,通过旋蒸除去无水乙醇,得到粗产物,对粗产物通过正己烷/丙酮重结晶,得到产物AIE-TEA为光敏剂,其中,化合物2的物质的量份数、三乙胺的物质的量份数与无水乙醇的体积份数的比为0.03:0.89:0.75,物质的量份数的单位为mmol,体积份数的单位为mL,化合物2为:
实施例3
上述光敏剂的合成方法,包括以下步骤:
在圆底烧瓶中,将化合物2、三乙胺和无水乙醇均匀混合,得到混合溶液,将混合溶液在氮气的保护下加热回流60小时,反应结束后,通过旋蒸除去无水乙醇,得到粗产物,对粗产物通过正己烷/丙酮重结晶,得到产物AIE-TEA为光敏剂,其中,化合物2的物质的量份数、三乙胺的物质的量份数与无水乙醇的体积份数的比为0.031:0.99:1.0,物质的量份数的单位为mmol,体积份数的单位为mL,化合物2为:
上述实施例1~3合成方法的线路表示如下:
实施例1所得光敏剂的核磁共振及质谱数据如下:
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,TMS,ppm):δ8.16(s,2H),8.15(s,2H),7.84(s,4H), 7.59(s,2H),7.21-7.25(t,J=7.8Hz,4H),7.08-7.10(d,J=8.8Hz,4H),6.94-6.96(d,J=7.6Hz, 4H),6.86-6.91(m,6H),3.90(m,4H),3.19-3.27(m,16H),1.72(m,8H)1.15-1.19(t,J=7.2 Hz,18H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,TMS,ppm):δ155.33,148.32,145.45,143.01,140.81,136.19,132.76,131.75,131.42,131.09,130.75,129.85,128.01,126.92,126.50,124.76,122.31,122.04,121.72,116.44,116.04,111.56,67.32,56.07,52.49,25.87,18.40,7.60. HRMS(ESI):m/z:Calcd for C36H37F6N3O1:641.2841;[M-2Br]2+:Found:641.2886.
表征1、光敏剂的紫外-可见吸收光谱:
将实施例1所得光敏剂(荧光探针AIE-TEA)溶于丙酮水溶液中直至该丙酮水溶液中光敏剂的浓度为100μΜ,如图1所示,测得丙酮水溶液的紫外-可见吸收光谱的最大吸收在525nm左右,荧光发射在600-800nm范围内,其中,丙酮水溶液中丙酮与水的体积比为5:95。
表征2、丙酮和丙酮水溶液中水的不同浓度对光敏剂荧光强度的影响。
将实施例1所得光敏剂分别溶于丙酮水溶液和丙酮中,以使该丙酮水溶液和丙酮中的光敏剂的浓度均为100μΜ,图2为在525nm光激发下光敏剂的荧光强度,从图2中可以看出,光敏剂在纯丙酮中几乎没有荧光,当丙酮水溶液中水的体积浓度为70%时,光敏剂的荧光强度明显增强,并且荧光强度随着水含量的增加而逐渐增强。具体讨论如下:当丙酮水溶液中水的体积浓度低于70%时,光敏剂的荧光微弱,这时的丙酮水溶液是澄清的,没有聚集体产生;当水含量达到70%时,光敏剂开始聚集,荧光强度明显增强,当水含量为95%时,光敏剂的荧光强度比其在纯丙酮溶液中的荧光强度高41倍。由此可见,光敏剂具有典型的AIE性能(聚集诱导发光性能)。
表征3、活性氧产生效率的测定
将9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)作为指示剂,孟加拉玫瑰红(RB) 作为标准试剂,来测定聚集态的光敏剂在白光(4mW cm-2)照射下的活性氧产生效率(Φ)。具体操作如下:
ABDA的DMSO溶液的制备:将1mg ABDA用97μL二甲基亚砜(DMSO)溶解,得到ABDA的DMSO溶液(ABDA的DMSO溶液中ABDA浓度为2.5×104μM)。
RB水溶液的制备:将1mg孟加拉玫瑰红用9.9mL水溶解,得到RB母液(RB母液中孟加拉玫瑰红浓度为100μM),取100μL的RB母液加入到3.9mL水中,得到4mL 的RB水溶液(RB水溶液中孟加拉玫瑰红浓度为2.5μM)。取2mL RB水溶液,用UV-3390 型紫外光谱仪测试其在200-800nm处的紫外吸收光谱,计算其在400-800nm处的积分面积并记为ARB。
光敏剂的DMSO/水混合溶液的制备:将1mg实施例1所得光敏剂用1.38mL的DMSO溶解,得到光敏剂DMSO母液(光敏剂DMSO母液中光敏剂浓度为0.5mmol/L),取400μL光敏剂DMSO母液加到3600μL的水中,得到4mL的光敏剂的DMSO/水混合溶液(vDMSO/v水=10:90,光敏剂的DMSO/水混合溶液中光敏剂浓度为50μM)。取2mL 光敏剂的DMSO/水混合溶液,用UV-3390型紫外光谱仪测试其在200-800nm处的紫外吸收光谱,计算其在400-800nm处的积分面积并记为AAIE-TEA。
取4μL ABDA的DMSO溶液加入到2mL的RB水溶液中并记为溶液A,取4μL ABDA的DMSO溶液加入到2mL的光敏剂的DMSO/水混合溶液中并记为溶液B,溶液 A和溶液B中ABDA的最终浓度均为50μM。
用低功率白光(4mW cm-2)分别照射溶液A和溶液B,使用UV-3390型紫外光谱仪每隔2分钟测一次溶液A和溶液B的吸光度,随着光照时间的增长,溶液A和溶液B 在358nm、378nm、400nm处的吸光度均逐渐降低。其中,用低功率白光(4mW cm-2) 照射溶液B,使用UV-3390型紫外光谱仪每隔2分钟测一次的吸收光谱图如图3的A所示,由图可知,随着光照时间的增长,溶液B在358nm、378nm、400nm处的吸光度逐渐降低,进一步证实了光敏剂能够有效地产生活性氧。
活性氧的产生效率通过如下公式进行计算。
ΦAIE-TEA=ΦRB(KAIE-TEA·ARB)/KRB·AAIE-TEA
其中,KAIE-TEA为光敏剂的DMSO/水混合溶液光动力过程中的分解速率常数,KRB为RB水溶液光动力过程中的分解速率常数,分解速率常数是ln(A0/A)与光照时间的曲线的斜率(以时间为横坐标,以ln(A0/A)为纵坐标),其中:
针对KRB:A0为溶液A于400nm波长处的初始时间(时间=0s)的吸光度的值,A 为溶液A在不同光照时间下于400nm波长处的吸光度的值;
针对KAIE-TEA:A0为溶液B于400nm波长处的初始时间(时间=0s)的吸光度的值, A为溶液B在不同光照时间下于400nm波长处的吸光度的值,获得溶液B的分解速率常数的曲线如图3的B所示。经过计算,KAIE-TEA和KRB分别依次为0.00167和0.00141, AAIE-TEA和ARB分别依次为11.5495和11.4625。ФRB表示RB水溶液的活性氧产生效率,经查阅(查阅文献:YadanZheng,Hongguang Lu,Zhu Jiang,Yue Guan,Jialing Zou,Xian Wang,Ruoyu Cheng andHui Gao,Low-power white light triggered AIE polymer nanoparticles with highROS quantum yield for mitochondria-targeted and image-guided photodynamictherapy,J.Mater.Chem.B,2017,5,6277.),RB在水中的活性氧产生效率 (ΦRB)为0.75。
经过计算,在功率为4mW cm-2白光照射下,活性氧产生效率ΦAIE-TEA为83%。
表征4~7
将光敏剂加入至丙酮中得到光敏剂丙酮溶液,其中,光敏剂与丙酮的比为0.005mmol:1mL,将0.1mL光敏剂丙酮溶液缓慢滴加至1mL磷酸缓冲溶液中,然后在室温 20~25℃下搅拌至丙酮蒸发,得到浓度为500μM的光敏剂溶液,用于表征4~5。
将1mg光敏剂用DMSO溶解,光敏剂与DMSO的比为0.5μmol:1mL,得到浓度为500μM的光敏剂的DMSO溶液,用于表征6~7。
将5.0g酵母粉、10.0g蛋白胨和5.0g氯化钠加入到1L的蒸馏水中,用氢氧化钠水溶液调pH至7.2得到LB培养基。将LB培养基中加入12.5g琼脂,120摄氏度加热20min 溶解,倒入培养皿中,冷却到室温20~25℃,得到固体LB培养基。
将单菌落细菌转移到5mL的固体LB培养基里,在恒温振荡培养箱里于37℃培养 16小时(170rpm),然后将细菌以8000rpm的速度离心3分钟,移除上层清液,用PBS 缓冲液(1倍,pH 7.2-7.4)将细菌的浓度稀释到108CFU/mL,得到细菌溶液,用于下述表征。
表征4、光敏剂对细菌的荧光成像
细菌的共聚焦成像实验在Nikon A1型荧光共聚焦显微镜上进行。将金黄色葡萄球菌的细菌溶液和大肠杆菌的细菌溶液分别与将实施例1所得光敏剂的光敏剂溶液混合,混合后在37℃下培养30分钟,不用清洗,得到光敏剂浓度为20μM的样品,将样品直接在荧光共聚焦显微镜下观察。光敏剂的激发波长为488nm,在662-737nm范围收集图像。图4的A和图4的B分别为AIE-TEA对金黄色葡萄球菌(图4的A)和大肠杆菌(图4的B)的荧光图像,图4的C(金黄色葡萄球菌)和图4的D(大肠杆菌)分别为明场图。由图可知,图4的A中金黄色葡萄球菌表面发出深红/近红外荧光,图4的B中大肠杆菌表面没有荧光,说明AIE-TEA能聚集在金黄色葡萄球菌表面,而不能在大肠杆菌表面聚集,对金黄色葡萄球菌的成像具有选择性。
表征5、AIE-TEA对细菌毒性实验:
采用涂布平板法来观察AIE-TEA对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的毒性作用。
光照组:将细菌溶液与不同质量的实施例1光敏剂溶液混合,得到细菌光敏剂混合物,再于37℃培养30分钟,在白光(20mW cm-2)下照射15分钟,光照完成后,使用 PBS缓冲液(1倍,pH 7.2-7.4)稀释1×104倍,得到细菌悬浮液。取100μL细菌悬浮液置于固体LB培养基上,使用涂布器进行涂布,涂布完成后,将培养皿倒置在恒温培养箱中于37℃温育20个小时,测定细菌菌落总数。其中,细菌光敏剂混合物中光敏剂的浓度分别为0、10、20、30和40μM,当细菌光敏剂混合物中光敏剂的浓度为0μM时测得的细菌菌落总数记为C0,当细菌光敏剂混合物中光敏剂的浓度为10、20、30和40μM 时测得的细菌菌落总数记为C,细菌分别为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。
黑暗组:将细菌溶液与不同质量的实施例1光敏剂溶液混合,得到细菌光敏剂混合物,再于37℃培养30分钟,在黑暗中培养15分钟,培养后,使用PBS缓冲液(1倍, pH 7.2-7.4)稀释1×104倍,得到细菌悬浮液。取100μL细菌悬浮液置于固体LB培养基上,使用涂布器进行涂布,涂布完成后,将培养皿倒置在恒温培养箱中于37℃温育20 个小时,测定细菌菌落总数。其中,细菌光敏剂混合物中光敏剂的浓度分别为0、10、20、 30和40μM,当细菌光敏剂混合物中光敏剂的浓度为0μM时测得的细菌菌落总数记为 C0,当细菌光敏剂混合物中光敏剂的浓度为10、20、30和40μM时测得的细菌菌落总数记为C,细菌分别为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。
针对光照组和黑暗组,分别测定细菌光敏剂混合物中不同光敏剂浓度时的C,最后通过统计形成的细菌菌落总数(CFU)来计算细菌的存活率。细菌存活率通过以下公式计算:
CFU比率(%)=C/C0×100%
按照上述黑暗组和光照组,采用涂布平板法来观察AIE-TEA对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的毒性作用,测试如图5(a)、5(b)、6(a)和6(b)所示,在光照条件下,当细菌光敏剂混合物中光敏剂的浓度为20μM时,光敏剂能够杀灭绝大多数金黄色葡萄球菌,当光敏剂的浓度为30μM时,光敏剂能够杀灭100%的金黄色葡萄球菌,而在黑暗条件下,光敏剂的浓度为30μM时,光敏剂仅能杀死54%的金黄色葡萄球菌。
在光照条件下,光敏剂的浓度为30μM时,光敏剂仅杀灭57%的大肠杆菌,而在黑暗条件下,光敏剂的浓度为30μM时,光敏剂仅能杀死33%的大肠杆菌。由图5(a) 、图 5(b) 和图 6(a) 、图 6(b) 可知,在白光照射条件下,光敏剂对金黄色葡萄球菌的杀灭效果优于对大肠杆菌,具有选择性。因此,该光敏剂可以有效地用于细菌的光动力治疗。
表征6、光敏剂对细菌碘化丙啶(PI)毒性实验
评估AIE-TEA对细菌的毒性。将细菌溶液与实施例1所得光敏剂的DMSO 溶液混合,得到细菌光敏剂DMSO混合物,细菌光敏剂DMSO混合物中光敏剂的浓度为20μM,在37℃下培养30分钟,培养后分成2组:实验组和对照组,其中,实验组在白光(20mW cm-2)下照射15分钟,对照组在黑暗条件下培养15分钟。然后将对照组和实验组分别用PBS缓冲液(1倍,pH7.2-7.4)清洗3次,然后与PI(碘化丙啶)混合后得到PI混合物(PI混合物中PI的浓度为2μM),将PI混合物培养15分钟,培养结束后,将PI混合物用PBS缓冲液(1倍,pH 7.2-7.4)清洗3次,用共聚焦荧光显微镜进行实验,激发波长为543nm,在560-617nm范围收集图像,测定荧光图像和明场图像的结果具体如下:
1)当细菌溶液中的细菌为金黄色葡萄球菌时,实验组(20mW cm-2的白光照射下培养15分钟)的荧光图像如图7的 C所示,明场图像如图7的 F所示;
2)当细菌溶液中的细菌为金黄色葡萄球菌时,对照组(黑暗条件下培养15分钟)的荧光图像如图7的 B所示,明场图像如图7的 E所示;
3)当细菌溶液中的细菌为大肠杆菌时,实验组(20mW cm-2的白光照射下培养15 分钟)的荧光图像如图7的 I所示,明场图像如图7的 L所示;
4)当细菌溶液中的细菌为大肠杆菌时,对照组(黑暗条件下培养15分钟)的荧光图像如图7的 H所示,明场图像如图7的 K所示。
空白实验:将细菌溶液在白光(20mW cm-2)下照射15分钟,然后与PI混合,得到PI细菌混合物,将PI细菌混合物培养15分钟作为空白实验,其中,PI细菌混合物中 PI的浓度为2μM。将PI细菌混合物用PBS缓冲液(1倍,pH 7.2-7.4)清洗3次,用共聚焦荧光显微镜进行实验,激发波长为543nm,在560-617nm范围收集图像。测定荧光图像和明场图像的结果具体如下:
①当细菌溶液中的细菌为金黄色葡萄球菌时,空白实验所得(20mW cm-2的白光照射下培养15分钟)的荧光图像如图7的 A所示,明场图像如图7的 D所示;②当细菌溶液中的细菌为大肠杆菌时,空白实验所得(20mW cm-2的白光照射下培养15分钟)的荧光图像如图7的 G所示,明场图像如图7的 J所示;
由图7的 A~L可知,空白实验中的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的荧光图像几乎没有荧光,实验组中的金黄色葡萄球菌发出明亮的红色荧光,对照组中的金黄色葡萄球菌发出相对弱的红色荧光,而实验组和对照组中的大肠杆菌的荧光图像几乎都没有荧光发射。PI毒性实验结果说明本发明的光敏剂能在光照条件下能够有效杀灭金黄色葡萄球菌,而对大肠杆菌具有有限的损伤作用。
表征7、光敏剂对细菌扫描电镜实验
通过扫描电镜实验来观察细菌的形态。将细菌溶液分别与不同质量的光敏剂的DMSO溶液混合(采用实施例1制备所得光敏剂),得到细菌光敏剂DMSO混合物,细菌光敏剂DMSO混合物中光敏剂的浓度分别为10μM和30μM。将细菌光敏剂DMSO 混合物在37℃下培养30分钟,分成实验组和对照组,其中,实验组在白光(20mW cm-2) 下照射15分钟得到实验组样品,对照组在黑暗条件下培养15分钟得到对照组样品。
不加光敏剂的DMSO溶液的细菌溶液作为空白组,定义为空白组样品。
将实验组样品、对照组样品和空白组样品分别用戊二醛水溶液(戊二醛水溶液中戊二醛的体积百分比为2.5%)在室温20~25℃下固定4个小时,然后取3微升滴到硅片上,用梯度体积浓度的乙醇水溶液(30%、50%、70%、90%)和乙醇(100%)依次脱水(先乙醇水溶液再乙醇,每个体积浓度脱水45分钟),室温下放置24小时干燥后进行扫描电镜实验。
在光敏剂对细菌扫描电镜实验中,细菌采用金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。
1)当细菌溶液中的细菌为金黄色葡萄球菌时:
1-1)空白组样品扫描电镜图像如图8的 A所示;
1-2)细菌光敏剂DMSO混合物中光敏剂的浓度为10μM,对照组样品扫描电镜图像如图8的 B所示;
1-3)细菌光敏剂DMSO混合物中光敏剂的浓度为30μM,对照组样品扫描电镜图像如图8的 D所示;
1-4)细菌光敏剂DMSO混合物中光敏剂的浓度为10μM,实验组样品扫描电镜图像如图8的 C所示;
1-5)细菌光敏剂DMSO混合物中光敏剂的浓度为30μM,实验组样品扫描电镜图像如图8的 E所示;
2)当细菌溶液中的细菌为大肠杆菌时:
2-1)空白组样品扫描电镜图像如图8的 F所示;
2-2)细菌光敏剂DMSO混合物中光敏剂的浓度为10μM,对照组样品扫描电镜图像如图8的 G所示;
2-3)细菌光敏剂DMSO混合物中光敏剂的浓度为30μM,对照组样品扫描电镜图像如图8的 I所示;
2-4)细菌光敏剂DMSO混合物中光敏剂的浓度为10μM,实验组样品扫描电镜图像如图8的 H所示;
2-5)细菌光敏剂DMSO混合物中光敏剂的浓度为30μM,实验组样品扫描电镜图像如图8的 J所示;
由图8的 A~J可知,空白组样品的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都具有光滑的表面和清晰的边缘。对照组样品的金黄色葡萄球菌表面略微粗糙,实验组样品中与10μM的AIE-TEA 一起培养的金黄色葡萄球菌具有收缩和融合的形态,与30μM的AIE-TEA一起培养的金黄色葡萄球菌结构完全破裂。
而实验组样品和对照组样品中与10μM和30μM的AIE-TEA一起培养的大肠杆菌结构都表现出微小的变化。扫描电镜实验结果说明AIE-TEA能够在白光照射下对金黄色葡萄球菌造成明显的损伤,而对大肠杆菌具有有限的损伤作用。
以上对本发明做了示例性的描述,应该说明的是,在不脱离本发明的核心的情况下,任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (5)
2.根据权利要求1所述的光敏剂,其特征在于,所述光敏剂在蓝光或紫外光激发下发出的光为600~800nm。
4.根据权利要求3所述的合成方法,其特征在于,通过正己烷和丙酮对所述粗产物重结晶:将粗产物放入丙酮中,再向丙酮中加入正己烷直至出现晶体,过滤得到所述光敏剂。
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