CN110498799B - 一种荧光探针及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

一种荧光探针及其制备方法和用途，所述荧光探针对粘度响应敏感并且特异，可用于蛋白的特异性荧光标记，还可用于蛋白的定量、检测或动力学研究以及细胞、组织和活体影像。

Description

一种荧光探针及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种荧光探针及其制备方法和用途。
背景技术
荧光特异性标记，是研究蛋白功能并定量的一种重要手段。和其它研究方法相比，荧光标记具有灵敏、原位、即时、可视等不可替代的优势。当前，蛋白的特异性荧光标记最常用的方法就是通过基因融合技术将荧光蛋白原位表达于目标蛋白上，从而实现对目标蛋白的特异性点亮，并能够在荧光显微镜下对细胞或组织内靶蛋白进行跟踪研究。荧光蛋白技术经过较长时间发展，技术相对成熟，然而依然存在不少缺陷，例如，荧光蛋白成熟折叠较慢、容易聚集；并且一旦表达，很难进行后期修饰；另外，大多荧光蛋白还存在光稳定性差等不足；这些在一定程度上限制了荧光蛋白的应用。
事实上，荧光蛋白生色团的分子结构相对单一，构建不同种类或者功能化的荧光蛋白，往往没有多少规律可循，只能借助于无规突变的方式进行海选。相比，有机小分子荧光染料的分子结构丰富的多，但是小分子荧光探针在蛋白特异性标记方面仍存在很多缺陷。最近，化学标签(chemical tag)技术的出现，有效地解决了小分子荧光探针蛋白特异性标记的问题。该技术将具有特异性识别功能的多肽或蛋白标签(tag)与靶蛋白融合，并利用该标签与底物高度特异性结合的特点，实现小分子荧光探针特异性的蛋白标记，因此，化学标签技术不仅继承了基因融合技术的优势，而且与荧光蛋白相比，它充分继承了有机染料探针的各方面的优势。目前，SNAP-tag(K.Johnsson et.al.WO 2004031405.)、CLIP-tag(K.Johnsson et.al.WO 2008012296.)、Halo-tag(Wood，Keith V et.al.WO 2004072232)等蛋白标签技术已经商业化，特别是SNAP-tag和CLIP-tag应用最为广泛，并得到了市场的一致认可。
虽然SNAP-tag和CLIP-tag等化学标签技术对所属蛋白的标记具有特异性。但事实上，标记过程中，无论游离的探针还是已标记的探针都存在同样的荧光发射。也就是说，不管标记上的还是没标记上的探针都在该体系内发射荧光。这种非特征性的荧光发射，显然是当前化学标签技术的严重缺陷。因此，从严格意义上，这种方法依然无法达到与荧光蛋白同等的特异性。将没有标记上的探针通过洗涤的方法加以去除，是当前解决以上问题的唯一有效方法。显然，在一些需要快速，或者无法洗涤的场合，该技术的应用将受到严重限制。
假若设计一种适用于SNAP-tag和CLIP-tag的荧光激活型蛋白特异标记的方法，它在未标记之前是暗的或发射非常弱的荧光，一旦它标记在蛋白上后，染料的荧光急剧增强。毫无疑问，这类设计的探针将有可能实现与荧光蛋白具有等同的特异性，不仅可以免除游离探针洗涤，大幅降低游离探针的背景干扰，而且势必拓宽SNAP-tag和CLIP-tag技术的应用。设计适用于该技术的荧光激活型蛋白特异标记的方法，必须考虑一个合适的荧光失/激活机制。FRET机制首先应用于这方面的设计，在配体上额外加入荧光淬灭基团，正常情况下小分子荧光被与之相连的基团淬灭；一旦配体与化学标签结合后淬灭基团离去，实现荧光激活(T.Komatsu.et.al.J.Am.Chem.Soc.2011,133,6745—6751.)。但是，淬灭基团的引入，大大增加了探针的分子体积，使标记速度大大下降，严重限制了探针在细胞、组织中蛋白的实时跟踪与检测，并且，荧光探针与淬灭基团之间必须具有较好的能级匹配，这样使得长波长，例如，红光发射染料的FRET设计非常困难。另外，一些荧光对极性敏感的染料也被用来设计激活型探针(T.K.Liu.et.al.ACS Chem.Biol.2014，9，2359—2365.)，染料处于细胞液等大极性溶剂中，探针没有荧光或者具有较弱荧光，当配体与蛋白结合，探针处于蛋白非极性口袋中，探针发射较强荧光。然而，一方面由于蛋白表面本身就存在一个极性较大的水化层，使探针的荧光增强幅度有限；另一方面，细胞或组织本身是个非常复杂的体系，各个细胞器的极性变化很大，这些都会导致极性敏感的探针在细胞或组织造影中具有很高的背景。最近，文献(T.Y.Wang et.al.Chem Sci.2016,7,301-307.)报导了具有粘度响应性的分子转子荧光探针，在蛋白配体与蛋白共价结合后，蛋白位阻的作用降低分子转子自由度，从而使得探针荧光激活。然而，该文献中探针分子荧光激活后的荧光亮度并不高，荧光量子产率非常低。因此，该文献报导的方法不能作为合格的荧光蛋白标签，用于靶蛋白的标记、跟踪、定位和定量。
发明内容
本发明人发现，通过将配体部分与粘度响应性荧光染料的电子供体部分相连，能够极大地提高配体与标签蛋白结合激活荧光后的荧光亮度，从而获得了一种全新结构的荧光探针，其具有粘度响应性，可用于蛋白的特异性标记，标记速度快、荧光激活亮度高、耐漂白能力强、适用范围广，能够有效用于靶蛋白的标记、跟踪、定位和定量。
鉴于此，本发明提供一种荧光探针，包括：配体部分A，任选的连接体部分C和荧光染料部分，所述荧光染料部分为粘度响应性荧光染料基团，包括电子供体部分D、共轭体系B和电子受体部分，所述配体部分A为能够与蛋白标签或融合蛋白标签的靶蛋白特异性识别并标记的基团，可选地，所述配体部分A为能够与蛋白标签或融合蛋白标签的靶蛋白特异性识别并共价标记的基团；其特征在于，所述配体部分A直接共价连接于荧光染料部分的电子供体部分D，或者，通过连接体部分C共价连接于荧光染料部分的电子供体部分D。
可选地，上述的荧光探针，其具有如式(I)所示的结构，
Figure BDA0001665872440000021
其中，
所述配体部分A来自于O6-烷基鸟嘌呤类化合物、烷基4-氯嘧啶类化合物或烷基胞嘧啶类化合物；
连接体部分C为任选存在的基团，选自亚烷基、改性亚烷基；
荧光染料部分具有如式(I-R)所示的结构，
Figure BDA0001665872440000022
其中，
电子供体部分-D-为-NX1-X2-，X1选自氢、烷基或改性烷基，X2选自亚烷基或改性亚烷基，X1，X2任选相互连接，与N原子一起形成脂杂环；
共轭体系B具有如式(I-1-1)～(I-1-7)所示的结构，
Figure BDA0001665872440000023
任选地，所述式(I-1-1)～(I-1-7)结构与X1、X2相互连接形成脂杂环；
电子受体部分具有如下式(I-2)所示的结构，
Figure BDA0001665872440000024
Figure BDA0001665872440000031
其中，
R1选自氢、卤原子、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基；
R2选自氢、氰基、羧基、酮基、酯基、酰胺基、硫代胺酰基、硫代酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基或改性烷基；
R3为氰基；
电子受体部分任选形成下式(I-2-a)、(I-2-b)、(I-2-c)环状结构：
Figure BDA0001665872440000032
其中，
Ra、Rb独立地选自氢、亲水性基团、烷基和改性烷基，Ra和Rb任选地相互连接形成脂环或脂杂环；
各个Rc独立地选自氢、卤原子、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基；各个Rd独立地选自氢、卤原子、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基或者为双键与芳香环、芳香杂环中的至少一种共轭连接而形成的基团；
各个Y1独立地选自-O-、-S-、-(S＝O)-和-(NRi)-，其中Ri选自氢、烷基或改性烷基；
各个Y2独立地选自＝O、＝S、＝S＝O和＝NRi，其中Ri选自氢、烷基或改性烷基；
各个Y3独立地选自＝O、＝S、＝S＝O和＝NRi，其中Ri选自氢、烷基或改性烷基；
或者，各个Y3独立地为＝C(Re)(CN)；
Re选自氰基、羧基、酮基、酯基、酰胺基、亚磷酸酯基、磷酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基或改性烷基；
当R2或Re为芳基或杂芳基时，环上的氢原子任选独立地被选自卤原子、氰基、硝基、亲水性基团、烷基或改性烷基中的取代基取代；任选地，所述取代基相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环；
其中，
所述“烷基”为C1-C30的直链或支链的烷基；优选地，为C1-C10直链或支链烷基；优选地，为C1-C7直链或支链烷基；优选地，为C1-C5直链或支链烷基；优选地，选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基，1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、异戊基、1-乙基丙基、新戊基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、异己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、3-乙基戊基或2,2,3-三甲基丁基；
所述“亚烷基”为C1-C30的直链或支链的亚烷基；优选地，为C1-C7直链或支链亚烷基；优选地，为C1-C5直链或支链亚烷基；
所述“改性烷基”为烷基的任意碳原子被选自卤原子、-O-、-OH、-CO-、-CS-、-NO2、-CN、-S-、-SO2-、-(S＝O)-、
Figure BDA0001665872440000033
苯基、亚苯基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、饱和或不饱和的单环或双环亚环烃基、联芳杂环、桥联脂杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1～30个碳原子，其碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳叁键置换；
所述“改性亚烷基”为亚烷基的任意碳原子被选自卤原子、-O-、-OH、-CO-、-NO2、-CN、-S-、-CS-、-SO2-、-(S＝O)-、
Figure BDA0001665872440000034
苯基、亚苯基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、饱和或不饱和的单环或双环亚环烃基、联芳杂环、桥联脂杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性亚烷基具有1～30个碳原子，其碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳叁键置换；
所述的碳原子被置换，是指碳原子或碳原子与其上的氢原子一起被相应的基团置换；
所述“脂环”为饱和或不饱和的4～10元单环或多环脂环；
所述“脂杂环”为环上含有选自N、O、S或Si中的至少一种杂原子的饱和或不饱和的4～10元单环或多环脂杂环，所述脂杂环上含有S原子时，其为-S-、-SO-或-SO2-；所述脂杂环任选被卤原子、硝基、烷基、芳基、亲水性基团和改性烷基取代；
所述“芳基或芳香环”为5～10元单环或稠合双环或多环芳香基团；
所述“杂芳基或芳香杂环”为环上含有选自N、O、S或Si中的至少一种杂原子的5～10元单环或稠合双环或多环杂芳香基团；
所述“卤原子”各自独立地选自F、Cl、Br、I；
所述“亲水性基团”为羟基、磺酸基、羧基、亚磷酸酯基、伯氨基、仲氨基或叔氨基；
所述“单环亚环烃基”为4～7元亚环烃基；
所述“双环亚环烃基”为5～10元双环亚环烃基；
所述“联芳杂环”为两个或两个以上芳香杂环共轭连接形成的基团；
所述“桥联脂杂环”为环上含有选自N、O、或S中的至少一种杂原子的5～20元桥联脂杂环；
所述“酮基”为R-(C＝O)R'基团；
所述“酯基”为R(C＝O)OR'基团；
所述“酰胺基”为RCONR'基团；
所述“硫代酰胺基”为R(C＝S)NR'基团；
所述“硫代酯基”为R(C＝S)OR'基团；
所述“磺酸基”为RSO3H基团；
所述“磺酸酯基”为RSO2OR'基团；
所述“砜基”为RSO2R'基团；
所述“亚砜基”RSOR'基团；
所述“伯胺基”为RNH2基团；
所述“仲胺基”为RNHR'基团；
所述“叔胺基”为RNR'R”基团；
所述“季铵盐基”R R'R”R”'N+基团；
各个R、R'、R”、R”'各自独立地为单键、烷基、亚烷基、改性烷基或改性亚烷基，所述改性烷基或改性亚烷基为C1-C10(优选为C1-C6)烷基或亚烷基的任意碳原子被选自-O-、-OH、-CO-、-CS-、-(S＝O)-中一种基团置换所得的基团；
可选地，所述改性烷基或改性亚烷基各自独立地为含有选自-OH、-O-、乙二醇单元(-(CH2CH2O)n-)、C1～C8烷基、C1～C8烷氧基、C1～C8酰基氧基、C1～C8卤代烷基、单糖基团、二糖基团、多糖基团、-O-CO-、-NH-CO-、-(-NH-CHR””-CO-)n-、-SO2-O-、-SO-、-SO2-NH-、-S-S-、-CH＝CH-、-C≡C-、卤原子、氰基、硝基、邻硝基苯基、苯甲酰甲基、磷酸酯基中至少一种基团的基团，其中，n为1～100，优选为1～50，更优选为1～30，更优选为1～10；R””为H或α氨基酸的残基；所述“磷酸酯基”具有如上所述定义；
所述“单糖单元”为不能再被简单地水解为更小的糖分子的糖类单元；
所述“二糖单元”为两个单糖失水而成的糖类单元；
所述“多糖单元”为十个以上单糖失水而成的糖类单元；
可选地，所述C1～C8烷基为甲基、乙基、丙基、异丙基，所述C1～C8烷氧基为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基，所述C1～C8酰基氧基为乙酰氧基、乙基、丙基、异丙基，所述C1～C8卤代烷基为三氟甲基、氯甲基、溴甲基；
可选地，所述脂杂环选自氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉、硫代吗啉；
可选地，所述芳香杂环选自、
Figure BDA0001665872440000041
可选地，所述芳香环选自
Figure BDA0001665872440000042
可选地，上述的荧光探针，其特征在于：
所述蛋白标签为提纯品、未提纯品或存在于细胞或组织的原位状态；
可选地，所述蛋白标签为O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(SNAP-tag)或其突变体、烷基胞嘧啶转移酶(CLIP-tag)或其突变体；
可选地，所述O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的突变体选自SNAP F33G或SNAPV164E；
可选地，所述蛋白标签为O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(SNAP-tag)或其突变体；
可选地，适用于SNAP-tag的配体部分A来自于O6-烷基鸟嘌呤类化合物或烷基4-氯嘧啶类化合物；可选地，适用于CLIP-tag的配体部分A来自于烷基胞嘧啶类化合物；
可选地，所述配体部分A-选自下式结构：
Figure BDA0001665872440000051
可选地，所述连接体部分C选自具有1～30个碳原子的饱和直链或支链的烷基，该烷基链上的一个或多个碳原子被-O-或-(C＝O)-置换；所述的碳原子被-O-或-(C＝O)-置换，是指碳原子或碳原子与其上的氢原子一起被-O-或-(C＝O)-置换；
可选地，X1为任选被一个或多个选自羟基、氰基、卤原子、羧基、季铵基团的基团取代的C1-30直链或支链烷基，X2为任选被一个或多个选自羟基、氰基、卤原子、羧基、季铵基团的基团取代的C1-30直链或支链亚烷基；或者X1、X2各自独立地为任选被一个或多个选自磺酸基、羧基的基团取代的含1-10个氧原子的C2-30醚链基团；或者，-NX1-X2形成选自下式(I-i-1)、(I-i-2)的任一基团：
Figure BDA0001665872440000052
可选地，X1为任选被1个或多个选自羟基、氰基、卤原子、羧基、季铵基团的基团取代的C1-10直链或支链烷基，X2为任选被1个或多个选自羟基、氰基、卤原子、羧基、季铵基团的基团取代的C1-10直链或支链烷基或亚烷基；
可选地，所述R2和Re独立地为选自以下结构的基团，或者，由以下结构自身或相互之间稠合形成的双环或多环稠芳香环或稠芳香杂环：优选为双环或三环稠芳香环或稠芳香杂环；
Figure BDA0001665872440000053
可选的，R2或Re的上述结构中CH上的H被卤原子、硝基、亲水性基团、烷基或改性烷基取代；可选地，R2或Re为选自上述结构中的含NH的基团，可选地，所述NH上的H被烷基或改性烷基取代；
或者，所述R2选自氢、氰基、羧基、酮基、酯基、酰胺基、硫代胺酰基、硫代酯基，并且，当选自酮基、酯基或酰胺基时，通过酮基、酯基或酰胺基中的羰基连接到式(I-2)、式(I-2-a)、式(I-2-b)、式(I-2-c)的烯基碳上，当选自硫代胺酰基、硫代酯基时，通过硫代胺酰基、硫代酯基中的硫羰基连接到式(I-2)、式(I-2-a)、式(I-2-b)、式(I-2-c)的烯基碳上；Re选自氰基、酮基、酯基、酰胺基，当选自酮基、酯基、酰胺基时，通过酮基、酯基、酰胺基中的羰基连接到式(I-2-a)或式(I-2-c)的烯基碳上；
可选地，所述电子受体部分为选自下式(I-2-1)～(I-2-22)中的一种：
Figure BDA0001665872440000054
Figure BDA0001665872440000061
可选地，上述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针选自下式化合物：
Figure BDA0001665872440000062
Figure BDA0001665872440000071
另一方面，还提供制备上述的荧光探针的方法，其特征在于，包括式(II)所示荧光染料与配体以及任选的连接体发生反应的步骤：
Figure BDA0001665872440000072
其中，D’反应后能够形成D-基团与连接基团或配体键合。
本发明还提供一种荧光激活型蛋白特异性标记方法，其特征在于，包括以下步骤：将上述的荧光探针与蛋白标签或者融合蛋白标签的靶蛋白接触，所述荧光探针的配体部分与蛋白标签发生标记反应，将荧光探针标记到蛋白标签上；可选地，所述将荧光探针标记到蛋白标签上为共价标记；
可选地，所述标记反应的反应介质选自纯蛋白溶液、细胞裂解液或蛋白标签或融合蛋白标签的靶蛋白所处在的原位介质；可选地，所述原位介质为细胞内介质、细胞器内介质、活体组织介质、血液或体液。
本发明还提供上述的荧光探针在蛋白荧光标记，蛋白的定量、检测或动力学研究，以及细胞、组织、活体影像中的用途。
本发明还提供一种探针试剂盒，其特征在于，包括上述的荧光探针。
可选地，所述探针试剂盒还包含生物相容性介质；可选地，所述生物相容性介质选自二甲基亚砜、缓冲剂、生理盐水中的至少一种；可选地，所述缓冲剂包括磷酸盐缓冲液。
本发明所述蛋白标签(tag)或者是融合该标签的靶蛋白部分可通过现有基因工程技术制备而来。
本发明所述的具有粘度响应性荧光染料是指染料分子的荧光强度对溶液粘度响应，随溶液的粘度增大，荧光强度增强。可选地，所述的具有粘度响应性荧光染料为：在25℃下，同等浓度和激发波长的条件下，染料最大荧光发射强度在甘油中的荧光强度与在甲醇中的荧光强度之比大于2，优选大于5，更优选大于10的有机染料分子。所述粘度响应性染料的浓度的范围在1×10-7M～1×10-5M。
根据具体情况，本领域工作人员可根据需要选择对应的标签与配体。
本领域技术人员可以利用具有相应配制的仪器设备对蛋白标签或者是融合蛋白标签的靶蛋白进行跟踪监测，根据需要，所用的仪器设备包括能测试或显示荧光的设备与设施，如荧光光谱仪、荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、酶标仪、流式细胞仪和活体成像仪等设备。
根据需要，操作者可以选择不同种类或发射/激发波长的染料。
根据一方面的实施方案，荧光探针荧光发射波长范围广。
根据一方面的实施方案，荧光探针的荧光强度随环境粘度的增大而增强，对粘度响应灵敏，具有粘度响应性。
根据一方面的实施方案，荧光探针可用于蛋白标签或融合蛋白标签的靶蛋白的特异性标记，荧光探针结合蛋白标签后荧光可以被激活，具有良好的荧光分子开关性质，而且荧光激活倍数高，荧光激活亮度高。
根据一方面的实施方案，荧光探针标记蛋白的速度非常快。
根据一方面的实施方案，荧光探针的荧光强度和蛋白标签浓度具有很好的线性关系，可用于目标蛋白的定量检测。
根据一方面的实施方案，荧光探针可以实现特异性标记细胞内蛋白标签，并且实现荧光特异性点亮，同时，探针荧光不受细胞内环境影响。
根据一方面的实施方案，荧光探针可以作为细胞亚细胞器标记的有力工具，例如对细胞核、线粒体、高尔基体、内质网、全细胞、细胞骨架、细胞外膜、溶酶体、细胞内膜等的标记。
根据一方面的实施方案，不同的荧光探针荧光基团的光谱不会相互干扰，本发明不同色系的荧光探针，可以对样本进行多色标记，可以同时进行正交标记成像。
根据一方面的实施方案，荧光探针的荧光不受动物内环境影响，可以应用于活体动物体内，例如特异性标记表达在肝脏部位的SNAP蛋白标签，并产生较强荧光信号。
根据一方面的实施方案，荧光探针可以用于跟踪、监测目标蛋白的降解过程。
根据一方面的实施方案，荧光探针实时监测哺乳动物细胞内生物大分子的组装与降解过程。
根据一方面的实施方案，荧光探针可以对组织、活体等不适宜清洗的样本进行快速造影成像。
根据一方面的实施方案，荧光探针的耐漂白性质优异，光稳定性更好。
根据一方面的实施方案，荧光探针未标记蛋白标签或融合蛋白标签的靶蛋白时几乎不产生检测信号，不干扰对样本的检测，可以实现复杂样本的快速定量检测，还可以跟踪标记反应过程的动力学过程。
附图说明
图1为不同探针与蛋白标签结合后不同波长的荧光被激活的荧光发射图；
图2～图6分别为探针1、探针5、探针13、探针16、探针28的荧光强度对不同SNAP蛋白标签浓度做的标准曲线；
图7为不同探针标记细胞荧光图谱，其中，(1)～(3)分别对应探针16、探针17、探针18，A组是表达蛋白标签的Hela细胞，B组是Hela-WT细胞(Hela原始细胞，未表达蛋白标签)；
图8为不同探针标记不同的细胞器，其中，A组～C组分别为探针16、探针17、探针18，(1)～(5)分别为细胞质基质、高尔基体、线粒体、染色体、细胞骨架；
图9为不同探针对相同细胞进行双色标记，其中，A为探针16标记的线粒体，B为探针9标记的细胞核，C为A和B的正交成像；
图10为探针16用于活体小鼠肝脏的标记，其中，A组为对照组，B组为样品组；
图11为探针16在哺乳动物细胞中的荧光随蛋白降解的变化；
图12为探针16、探针17、探针18标记SNAP蛋白和荧光蛋白IFP682在哺乳动物细胞中的光稳定性对比，其中A～C分别为探针16、探针17、探针18，D为IFP682；
图13为探针16、探针17、探针18和参比探针33标记SNAP蛋白在哺乳动物细胞中的光稳定性对比，其中A～C分别为探针16、探针17、探针18，D为参比探针33；
图14为探针2、探针5、探针11、探针13、探针16、探针28、探针30标记SNAP蛋白在哺乳动物细胞中的光稳定性，其中A～G分别为探针16、探针28、探针5、探针11、探针30、探针2、探针13。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于对本发明进行示例性说明，并不用于限制本发明。
实施例1
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针1：
Figure BDA0001665872440000091
化合物1：
参照文献(Hwan Myung Kim et al.ANAL CHEM.2014，86，308-311.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.13(s，1H)，7.83-7.89(m，2H)，7.25-7.34(m，1H)，7.13(d，1H)，6.73(d，1H)，3.68(t，2H，J＝5.6Hz)，3.53(t，2H，J＝5.6Hz)，3.08(s，3H)。
化合物2：
化合物1(0.461g，2mmol)和氰基乙酸叔丁酯(0.338g，2.4mmol)溶于50ml无水乙醇中，加入催化量无水氯化锌，Ar保护条件下油浴加热5h，反应结束，冷却至室温，旋转蒸发除掉部分溶剂，体系有大量固体析出，过滤，滤饼用冷乙醇洗两次，真空烘干，即得纯的黄色化合物2(0.41g，88％)。产率82％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.07(s，1H)，7.83-7.89(m，2H)，7.25-7.34(m，1H)，7.13(d，1H)，6.73(d，1H)，3.68(t，2H，J＝5.6Hz)，3.53(t，2H，J＝5.6Hz)，3.08(s，3H)，1.52(s，9H)。
化合物3：
参照文献(Antje Keppler et.al.Nat Biotechnology.2002,21,86-89.)公开的方法进行合成。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.82(s，1H)，7.39(m，4H)，6.27(s，2H)，5.45(s，2H)，3.71(s，2H)。
探针1:
化合物2(0.353g，1.0mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.146g，1.2mmol)于20ml的无水二氯甲烷中溶解，氩气保护条件下缓慢滴加入对硝基氯甲酸苯酯(0.242g，1.2mmol)的10ml无水二氯甲烷溶液，滴加完毕，室温搅拌1h，反应完毕，旋转蒸干溶剂，残余物溶于10ml无水N，N-二甲基甲酰胺中，加入化合物3(0.324g，1.2mmol)，加入无水三乙胺(0.16ml，1.2mmol)，Ar保护条件下室温搅拌30min，反应完毕，旋转蒸干溶剂，残余物过柱分离，即得纯的探10.32g，产率90％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.03(s,1H),8.55(t,J＝5.8Hz,1H),8.12(s,1H),7.83-7.89(m，2H)，7.79(s,1H),7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.25-7.34(m，3H)，7.13(d，1H)，6.73(d，1H)，6.27(s,2H),5.44(s,2H),4.89(t,J＝5.6Hz,1H),4.37(d,J＝5.8Hz,2H),3.65(t,J＝5.6Hz,2H),3.48(t,J＝5.6Hz,2H),3.09(s,3H),1.49(s,9H)。
实施例2
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针2
Figure BDA0001665872440000101
化合物4：
参照化合物2的合成方法，产率86％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：8.08(s，1H)，7.83-7.89(m，2H)，7.49(d，1H，J＝8.4Hz)，7.36-7.42(m，3H)，7.25-7.34(m，1H)，7.13(d，1H)，6.73(d，1H)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.11(s，3H)。
探针2：
参照探针1的合成方法，产率82％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.31(s,1H),8.52(t,J＝5.8Hz,1H)，8.31(s,1H),8.04(d,J＝7.8Hz,1H),7.89(d,J＝8.1Hz,1H),7.83-7.89(m，2H),7.79(s,1H),7.48(t,J＝7.6Hz,1H),7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.37(t,J＝7.5Hz,1H),7.25-7.34(m，3H)，7.13(d，1H)，6.73(d，1H)，6.27(s,2H),5.76(s,1H),5.44(s,2H),4.88(d,J＝4.8Hz,2H),4,37(d,J＝5.8Hz,2H),3.65(d,J＝4.7Hz,2H),3.45(s,2H),3.08(s,3H).
实施例3
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针3：
Figure BDA0001665872440000102
化合物5：
按照文献公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ＝7.84(d，1H，J＝6.0Hz)，7.40(d，2H，J＝8.0Hz)，7.31(d，2H，J＝8.0Hz)，6.14(d，1H，J＝6.0)，5.29(s，2H)，3.78(s，2H)。
探针3：
参照探针1的合成方法，产率62％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.03(s，1H)，7.86(d，1H)，7.79(dd,2H),7.74(t，1H)，7.62(d,1H),7.36(d，2H，J＝6.0Hz)，7.26(d，2H，J＝6.0Hz)，7.22(dd,1H),6.92(d,1H),6.85(bs，2H)，6.08(d，1H)，5.20(s，2H)，4.24(t，2H)，4.15(d，2H)，3.66(t，2H)，3.14(s，3H),1.54(s，9H)。
实施例4
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针4：
Figure BDA0001665872440000111
化合物6：
按照文献(Srikun D K et.al.JACS 2010，132，4455-4465.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.31(d，2H，J＝8.0Hz)，7.10(brs，2H)，6.10(s，1H)，5.25(s，2H)，3.68(s，2H)。
探针4：
参照探针1的合成方法，产率62％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.99(brs，1H)，8.01(s，1H)，7.83-7.89(m，2H)，7.72(t，1H)，7.39(d，2H)，7.25-7.34(m，3H)，7.13(d，1H)，6.73(d，1H)，5.26(s，2H)，4.36(d，2H)，3.55-3.59(m，4H)，3.08(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例5
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针5：
Figure BDA0001665872440000112
化合物7：
N-甲基-N-羟乙基苯胺(1.88g，12.5mmol)和NaHCO3(1.57g，18.7mmol)溶于48ml二氯甲烷和36ml水中，冷却至0℃，缓慢加入I2(3.0g，11.8mmol)，加毕，体系逐渐升至室温，搅拌30min，体系加300ml二氯甲烷40ml水稀释，分出有机相，有机相分别用水、硫代硫酸钠溶液、食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后旋转蒸干，残余物柱色谱分离，得纯化合物7(2.46g，92％)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.46(d，1H，J＝7.60Hz)，6.56(d，1H，J＝7.60Hz)，3.78(t，2H，J＝4.80Hz)，3.44(t，2H，J＝4.80Hz)，2.94(s，3H)。
化合物8：
化合物7(0.554g，2mmol)和5-醛基-2-噻吩硼酸(0.374g，2.4mmol)溶于10ml甲苯、10ml乙醇中，加入2ml 2N K2CO3溶液，氩气保护条件下85℃油浴加热5h，反应完毕，冷却至室温，加水10ml淬灭，分出有机相，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干过柱，得纯化合物0.339g，产率65％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.81(s，1H)，7.68(s，1H)，7.55(d，1H，J＝8.00Hz)，7.25(d，2H，J＝8.00Hz)，6.78(d，2H，J＝8.00Hz)，3.86(t，2H，J＝4.80Hz)，3.56(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)。
化合物9：
参照化合物2的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(s，1H)，7.68(d，1H)，7.55(d，1H)，7.25(d，2H，J＝8.00Hz)，6.78(d，2H，J＝8.00Hz)，3.86(t，2H，J＝4.80Hz)，3.56(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H),1.50(s，9H)。
探针5：
参照探针1的合成方法，产率54％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.01(s，1H)，7.81(s，1H)，7.68(s，1H)，7.55(d，1H，J＝8.00Hz)，7.40(m，4H)，7.25(d，2H，J＝8.00Hz)，6.78(d，2H，J＝8.00Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.86(t，2H，J＝4.80Hz)，3.56(t，2H，J＝4.80Hz)，3.06(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例6
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针6：
Figure BDA0001665872440000121
化合物10：
氰乙酸(1.0g，10mmol)加入25ml圆底烧瓶中，加入2-甲氧基乙胺，Ar保护条件下室温搅拌，反应完毕，加入10ml无水乙醚，超声分散，过滤，真空干燥得白色固体。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝6.5(s，1H)，3.48-3.52(m，4H)，3.38(s，3H)。
化合物11：
参照化合物2的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.31(s，1H)，8.22(bt，1H)，7.82(d，1H，J＝4.00Hz)，7.58(d，2H，J＝8.80Hz)，7.50(d，2H，J＝4.00Hz)，6.77(d，2H，J＝8.80Hz)，4.74(bt，1H)，3.57(t，2H，J＝5.20Hz)，3.41—3.48(m，4H)，3.38(t，2H，J＝5.20Hz)，3.27(s，3H)，3.01(s，3H)。
探针6：
参照探针1的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.31(s，1H)，8.22(bt，1H)，7.82(m，2H)，7.58(d，2H，J＝8.80Hz)，7.50(d，2H，J＝4.00Hz)，7.40(m，4H)，6.77(d，2H，J＝8.80Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.74(bt，1H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.57(t，2H，J＝5.20Hz)，3.41—3.48(m，4H)，3.38(t，2H，J＝5.20Hz)，3.27(s，3H)，3.01(s，3H)。
实施例7
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针7：
Figure BDA0001665872440000131
化合物12：
参照化合物2的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.81(s,1H),7.64-7.71(m,3H),7.55(d，1H)，7.30-7.38(m,2H),7.25(d，2H，J＝8.00Hz)，6.78(d，2H，J＝8.00Hz)，4.90(t,J＝5.2Hz,1H),3.66(t,J＝6.0Hz,2H),3.47(t,J＝6.0Hz,2H),3.10(s,3H)。
探针7：
参照探针1的合成方法，产率55％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.55(t,J＝5.8Hz,1H),8.37(s,1H),7.81(s,1H),7.64-7.71(m,3H),7.55(d，1H)，7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.30-7.38(m,4H),7.25(d，2H，J＝8.00Hz)，6.78(d，2H，J＝8.00Hz)，6.27(s,2H),5.44(s,2H),4.90(t,J＝5.2Hz,1H),4,37(d,J＝5.8Hz,2H),3.66(t,J＝6.0Hz,2H),3.47(t,J＝6.0Hz,2H),3.10(s,3H)。
实施例8
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针8：
Figure BDA0001665872440000132
探针8：
参照探针1的合成方法，产率73％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.03(s，1H)，7.86(d，1H)，7.74(t，3H)，7.68(d，1H)，7.55(d，1H)，7.36(d，2H，J＝6.0Hz)，7.26(d，2H，J＝6.0Hz)，7.25(d，2H，J＝8.00Hz)，6.85(bs，2H)，6.78(d，2H，J＝8.00Hz)，6.08(d，1H)，5.20(s，2H)，4.24(t，2H)，4.15(d，2H)，3.66(t，2H)，3.14(s，3H),1.54(s，9H)。
实施例9
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针9：
Figure BDA0001665872440000141
化合物13：
6-溴-1-苯并呋喃(0.4g，2mmol)溶于15mL N-甲基-N-羟乙基胺，加入铜粉(6.4mg，0.01mmol)，碘化亚铜(19mg，0.01mmol)，磷酸三钾(0.850g，4mmol)，Ar保护条件下80℃油浴加热过夜，反应完毕，冷却至室温，体系倒入50mL水中，二氯甲烷萃取3次×50mL，合并有机相，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离得黄色产物0.362g，产率87％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.02(s，1H)，7.66(d，1H，J＝8.4Hz)，7.44-7.48(m，1H)，7.41(m，1H)，7.29(m，1H)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.10(s，3H)。
化合物14：
化合物13(0.382g，2mmol)溶于50ml无水二氯甲烷中，加入1ml三乙胺，冰浴条件下缓慢滴加醋酸酐(0.3ml，3mmol)，滴加完毕，体系缓慢升至室温，搅拌3h，反应完毕，加水100ml，分出有机相，水相用二氯甲烷50ml二氯甲烷萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物无需进一步纯化，直接用于下一步。
上述残余物溶于50ml二氯甲烷中，加入二甲基甲酰胺5ml，冰浴条件下加入三氯氧磷2ml，Ar保护条件下搅拌0.5h，体系缓慢升至室温，继续搅拌5h，反应完毕，加入饱和碳酸钠溶液调pH＝10.0，室温条件下搅拌过夜，次日分出有机相，水相用二氯甲烷50ml萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤两次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得黄色固体0.235g，产率56％。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.92(s，1H)，7.81(s，1H)，7.68(d，J＝9.0Hz，1H)，6.92(d，J＝2.0Hz，1H)，6.82(d，J＝9.1，2.3Hz，1H)，3.61(t，J＝8.0Hz，3H)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.10(s，3H)。
化合物15:
参照化合物2的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，6.43(s，1H)，3.61(t，J＝8.0Hz，3H)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.11(s，3H)，1.48(s，9H)。
探针9：
参照探针1的合成方法，产率66％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.20(s，1H)，7.81(s，2H)，7.68(d，J＝9.0Hz，1H)，7.40(m，4H)，6.92(d，J＝2.0Hz，1H)，6.82(d，J＝9.1，2.3Hz，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.61(t，J＝8.0Hz，3H)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.11(s，3H)，1.51(s，9H)。
实施例10
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针10：
Figure BDA0001665872440000151
化合物16:
参照化合物2的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.45(s，1H)，8.09(d，J＝8.00Hz，2H)，8.07(s，1H)，7.94(d，J＝8.00Hz，2H)，7.51(m，1H)，7.41(m，1H)，6.45(s，1H)，3.61(t，3H，J＝8.0Hz)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.21(s，3H)。
探针10:
参照探针1的合成方法，产率71％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，8.45(s，1H)，8.09(d，J＝8.00Hz，2H)，8.07(s，1H)，7.94(d，J＝8.00Hz，2H)，7.81(s，1H)，7.51(m，1H)，7.41(m，5H)，6.45(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.61(t，3H，J＝8.0Hz)，3.34(t，J＝8.0Hz，3H)，3.21(s，3H)。
实施例11
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针11：
Figure BDA0001665872440000152
化合物17：
参照化合物2的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.09(d，1H，J＝8.00Hz)，7.94(d，1H，J＝8.00Hz)，7.81(s，1H)，7.68(d，J＝9.0Hz，1H)，7.51(m，1H)，7.41(m，1H)，6.92(d，J＝2.0Hz，1H)，6.82(d，J＝9.1，2.3Hz,1H)，6.45(s，1H)，3.61(t，2H，J＝8.0Hz)，3.34(t，2H，J＝8.0Hz)，3.21(s，3H)。
探针11：
参照探针1的合成方法，产率66％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.33(s，1H)，10.12(s，1H)，8.03(d，1H，J＝8.00Hz)，7.94(d，1H，J＝8.00Hz)，7.81(s，2H)，7.68(d，J＝9.0Hz，1H)，7.51(m，1H)，7.41(m，5H)，6.92(d，J＝2.0Hz，1H)，6.82(d，J＝9.1，2.3Hz,1H)，6.45(s，1H)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.62(t，2H，J＝8.0Hz)，3.36(t，J＝8.0Hz，2H)，3.21(s，3H)。
实施例12
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针12：
Figure BDA0001665872440000161
探针12：
参照探针1的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.22(s，1H)，8.02(s，1H)，7.93(d，1H，J＝5.6Hz)，7.75(s，1H)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，6.43(s，1H)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.62(t，J＝8.0Hz，3H)，3.35(t，J＝8.0Hz，3H)，3.21(s，3H)，1.48(s，9H)。
实施例13
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针13：
Figure BDA0001665872440000162
化合物18：
参照文献(Martinez M.et al.Org.Biomol.Chem.2012.10.3892-3898.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.24(dd，J1＝5.2Hz，J2＝1.2Hz，1H)，7.13(dd，1H，J1＝3.6Hz，J2＝1.2Hz)，7.03(dd，1H，J1＝5.2Hz，J2＝1.2Hz)，6.99(d，1H，J＝3.8Hz)，6.93(d，1H，J＝3.6Hz)。
化合物19：
参照化合物13的合成方法，产率78％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.25(dd，J1＝5.2Hz，J2＝1.2Hz，1H)，7.13(dd，1H，J1＝3.6Hz，J2＝1.2Hz)，7.03(dd，1H，J1＝5.2Hz，J2＝1.2Hz)，6.99(d，1H，J＝3.8Hz)，6.93(d，1H，J＝3.6Hz)，3.85(t，2H，J＝4.80Hz)，3.46(t，2H，J＝4.80Hz)，3.10(s，3H)。
化合物20：
参照化合物14的合成方法，产率65％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.75(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.27(s，3H)，3.13(s，3H)。
化合物21：
参照化合物2的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.00(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.13(s，3H)，1.50(s，9H)。
探针13：
参照探针1的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.52(s，1H)，10.01(s，1H)，8.00(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.81(s，1H)，7.40(m，4H)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，6.29(s，2H)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.27(s，3H)，3.13(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例14
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针14：
Figure BDA0001665872440000171
化合物22：
参照化合物2的合成方法，产率97％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，7.94(d，1H，J＝8.0Hz)，7.89(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.13(s，3H)。
探针14：
参照探针1的合成方法，产率48％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.82(s，1H)，10.21(s，1H)，8.04(d，1H，J＝8.0Hz)，7.94(d，1H，J＝8.0Hz)，7.89(s，1H)，7.81(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.53(t，1H，J＝8.0Hz)，7.45(t，1H，J＝8.0Hz)，7.40(m，4H)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，6.29(s，2H)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.13(s，3H)。
实施例15
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针15：
Figure BDA0001665872440000172
探针15：
参照探针1的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.00(s，1H)，7.93(d，1H，J＝5.6)，7.75(s，1H)，7.57(d，1H，J＝4.00Hz)，7.33(d，2H，J＝8.0Hz)，7.19(d，2H，J＝8.0Hz)，7.13(d，1H，J＝4.00Hz)，6.95(d，1H，J＝4.00Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.81(d，1H，J＝4.00Hz)，5.27(s，2H)，5.16(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.67(t，2H，J＝5.60Hz)，3.35(t，2H，J＝5.60Hz)，3.13(s，3H)，1.50(s，9H)。
实施例16
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针16：
Figure BDA0001665872440000181
化合物23：
参照文献(Kimin Lim et al.J.Phys.Chem.C.201,115,22640-22646.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.48(s,1H),7.41(d,1H,J＝8.1Hz),7.32(d,1H,J＝5.1Hz),7.30(d,1H,J＝7.8Hz),7.11(d,1H,J＝4.5Hz),1.46(s,6H)。
化合物24：
参照化合物13的合成方法，产率66％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.48(s,1H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.30(d,1H),7.11(d,1H)，3.85(t，2H)，3.46(t，2H)，3.10(s，3H)，1.46(s,6H)。
化合物25：
参照化合物14的合成方法，产率75％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.84(s，1H)，7.48(s,1H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.30(s,1H),3.85(t，2H)，3.46(t，2H)，3.10(s，3H)，1.46(s,6H)。
化合物26：
参照化合物2的合成方法，产率95％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.03(s，1H)，7.48(s,1H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.30(s,1H),3.85(t，2H)，3.46(t，2H)，3.10(s，3H)，1.50(s，9H)，1.46(s,6H)。
探针16：
参照探针1的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.03(s,1H),8.55(t,J＝5.8Hz,1H),8.12(s,1H),7.79(s,1H),7.48(s,1H),7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.31(s,1H),7.30(d,J＝7.9Hz,2H),6.27(s,2H),5.44(s,2H),4.89(t,J＝5.6Hz,1H),4.37(d,J＝5.8Hz,2H),3.65(t,J＝5.6Hz,2H),3.48(t,J＝5.6Hz,2H),3.09(s,3H),1.49(s,9H)。
实施例17
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针17：
Figure BDA0001665872440000182
化合物27：
参照化合物2的合成方法，产率89％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.37(s,1H),7.81(s,1H),7.64-7.71(m,2H),7.41(d,1H),7.35-7.38(m,2H),7.32(d,1H),6.24(s,1H),4.90(t,J＝5.2Hz,1H),3.66(t,J＝6.0Hz,2H),3.47(t,J＝6.0Hz,2H),3.10(s,3H),1.42(s,6H).
探针17：
参照探针1的合成方法，产率56％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.55(t,J＝5.8Hz,1H),8.37(s,1H),7.79(s,1H),7.81(s,1H),7.64-7.71(m,2H),7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.41(d,1H),7.35-7.38(m,4H),7.32(d,1H),6.27(s,2H),6.24(s,1H),5.44(s,2H),4.90(t,J＝5.2Hz,1H),4,37(d,J＝5.8Hz,2H),3.66(t,J＝6.0Hz,2H),3.47(t,J＝6.0Hz,2H),3.10(s,3H),1.42(s,6H).
实施例18
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针18：
Figure BDA0001665872440000191
化合物28：
参照化合物2的合成方法，产率95％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.33(s,1H),7.74(s,1H),7.64-7.71(m,2H),7.41(d,1H),7.35-7.38(m,2H),7.22(d,1H),6.24(s,1H),4.90(t,J＝5.2Hz,1H),3.66(t,J＝6.0Hz,2H),3.47(t,J＝6.0Hz,2H),3.10(s,3H),1.41(s,6H).
探针18：
参照探针1的合成方法，产率54％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.45(t,J＝5.8Hz,1H),8.20(s,1H),7.79(s,1H),7.73(s,1H),7.64-7.71(m,2H),7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.41(d,1H),7.35-7.38(m,4H),7.32(d,1H),6.27(s,2H),6.24(s,1H),5.44(s,2H),4.90(t,J＝5.2Hz,1H),4,37(d,J＝5.8Hz,2H),3.66(t,J＝6.0Hz,2H),3.47(t,J＝6.0Hz,2H),3.10(s,3H),1.41(s,6H).
实施例19
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针19：
Figure BDA0001665872440000192
化合物29：
参照化合物11的合成方法，产率87％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.03(s，1H)，7.48(s,1H),7.45(t,1H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.30(s,1H),3.85(t，2H)，3.48-3.52(m，4H)，3.46(t，2H)，3.27(s，3H)，3.10(s，3H)，1.46(s,6H)。
探针19：
参照探针1的合成方法，产率67％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.57(t,1H),8.55(s,1H),8.42(t,1H),8.03(s,1H),7.53(m,2H),7.16(t,2H),7.11(t,2H),6.99(s,2H),6.81(s,1H),6.64(d,1H),5.16(s,2H),4.48(t,2H),4.29(m,2H),4.23(d,2H),3.76(t,2H),3.30(s,3H),3.04(t,2H),2.75(s,3H),1.72(s,6H)。
实施例20
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针20：
Figure BDA0001665872440000201
化合物31：
参照文献(Gamba-Sánchez.et.al.Tetrahedron Lett.2015，56，4308-4311)的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝6.52(s，2H)，3.48-3.52(m，4H)，3.38(s，3H)。
化合物31：
参照化合物11的合成方法，产率73％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.03(s，1H)，7.48(s,1H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.30(s,1H),7.01(t,1H),3.85(t，2H)，3.48-3.52(m，4H)，3.46(t，2H)，3.27(s，3H)，3.10(s，3H)，1.46(s,6H)。
探针20：
参照探针1的合成方法，产率70％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.57(s,1H),8.03(s,1H),7.63(s,1H),7.53(d,2H),7.25(s,1H),7.16(t,2H),7.11(t,2H),6.99(s,2H),6.83(d,1H),6.81(d,1H),6.64(d,1H),5.16(s,2H),4.48(t,2H),4.29(m,2H),4.23(d,2H),3.76(t,2H),3.30(s,3H),2.75(s,1H),2.73(t,2H),2.0(s,1H),1.72(s,6H)。
实施例21
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针21：
Figure BDA0001665872440000202
化合物32：
参照文献(Gamba-Sánchez.et.al.Tetrahedron Lett.2015.56.4308-4311)的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝6.56(s，2H)，3.42(s，3H)。
化合物33：
参照化合物2的合成方法，产率65％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.03(s，1H)，7.48(s,1H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.30(s,1H),3.85(t，2H)，3.46(t，2H)，3.22(s，3H)，3.10(s，3H)，1.46(s,6H)。
探针21：
参照探针1的合成方法，产率33％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.03(s,1H),8.55(t,J＝5.8Hz,1H),8.12(s,1H),7.79(s,1H),7.48(s,1H),7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.31(s,1H),7.30(d,J＝7.9Hz,2H),6.27(s,2H),5.44(s,2H),4.89(t,J＝5.6Hz,1H),4.37(d,J＝5.8Hz,2H),3.65(t,J＝5.6Hz,2H),3.48(t,J＝5.6Hz,2H),3.21(s,3H)，3.09(s,3H)。
实施例22
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针22：
Figure BDA0001665872440000211
化合物34：
参照化合物2的合成方法，产率67％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝11.03(s，1H)，8.03(s，1H)，7.48(s,1H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.30(s,1H),3.85(t，2H)，3.46(t，2H)，3.10(s，3H)，1.46(s,6H)。
探针22：
参照探针1的合成方法，产率85％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.03(s,1H),11.22(s,1H)，8.55(t,J＝5.8Hz,1H),8.12(s,1H),7.79(s,1H),7.48(s,1H),7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.31(s,1H),7.30(d,J＝7.9Hz,2H),6.27(s,2H),5.44(s,2H),4.89(t,J＝5.6Hz,1H),4.37(d,J＝5.8Hz,2H),3.65(t,J＝5.6Hz,2H),3.48(t,J＝5.6Hz,2H),3.09(s,3H)。
实施例23
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针23：
Figure BDA0001665872440000212
化合物35：
参照化合物2的合成方法，产率55％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.03(s，1H)，7.48(s,1H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.30(s,1H),3.85(t，2H)，3.46(t，2H)，3.10(s，3H)，1.46(s,6H)。
探针23：
参照探针1的合成方法，产率58％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝13.58(s,1H),12.22(s,1H)，8.55(t,J＝5.8Hz,1H),8.12(s,1H),7.79(s,1H),7.48(s,1H),7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.31(s,1H),7.30(d,J＝7.9Hz,2H),6.27(s,2H),5.44(s,2H),4.89(t,J＝5.6Hz,1H),4.37(d,J＝5.8Hz,2H),3.65(t,J＝5.6Hz,2H),3.48(t,J＝5.6Hz,2H),3.09(s,3H)。
实施例24
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针24：
Figure BDA0001665872440000221
探针24：
参照探针1的合成方法，产率85％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.03(s，1H)，7.86(d，1H)，7.74(t，3H)，7.48(s,1H),7.41(d,1H),7.36(d，2H，J＝6.0Hz)，7.32(d,1H),7.30(s,1H),7.26(d，2H，J＝6.0Hz)，6.85(bs，2H)，6.08(d，1H)，5.20(s，2H)，4.24(t，2H)，4.15(d，2H)，3.66(t，2H)，3.14(s，3H),1.54(s，9H)，1.42(s，6H)。
实施例25
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针25：
Figure BDA0001665872440000222
探针25：
参照探针1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.93(d，1H，J＝7.2Hz)，7.89(s，1H)，7.79(s，1H)，7.74(d，1H，J＝4.0Hz)，7.55(d，1H，J＝4.0Hz),7.42(m，2H)，7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.31(d，2H，J＝8.0Hz)，7.18(m，3H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，6.06(d，1H，J＝5.6Hz)，5.27(s，2H)，5.15(s，2H)，4.45(d，2H，J＝5.6Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，4.12(s，2H)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.50(s，6H)。
实施例26
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针26：
Figure BDA0001665872440000223
探针26：
参照探针1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.18(m,1H),8.03(t,1H),8.01(m,1H),7.94(d,1H),7.74(s,2H),7.54(m,1H),7.53(m,3H),7.16(t,2H),7.11(t,2H),6.83(d,1H),6.81(d,1H),6.64(d,1H),6.19(d,1H)5.16(s,2H),4.48(t,2H),4.29(t,2H),4.23(d,2H),2.75(s,3H),1.72(s,6H)。
实施例27
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针27：
Figure BDA0001665872440000231
探针27：
参照探针1的合成方法，产率86％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.18(m,1H),8.03(t,1H),8.01(m,1H),7.94(d,1H),7.74(s,2H),7.54(m,1H),7.53(m,3H),7.48(s,1H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.30(s,1H),7.16(t,2H),7.11(t,2H),6.83(d,1H),6.81(d,1H),6.64(d,1H),6.19(d,1H)5.16(s,2H),4.48(t,2H),4.29(t,2H),4.23(d,2H),2.75(s,3H),1.72(s,6H)。
实施例28
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针28：
Figure BDA0001665872440000232
化合物36：
参照文献(Kimin Lim et al.J.Phys.Chem.C.201,115,22640-22646.)公开的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.51(s,1H),7.43(d,1H,J＝8.1Hz),7.31(d,1H,J＝5.1Hz),7.27(d,1H,J＝7.8Hz),7.18(d,1H,J＝4.5Hz),1.44(s,6H)。
化合物37：
参照化合物13的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.52(s,1H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.22(d,1H),7.11(d,1H)，3.85(t，2H)，3.46(t，2H)，3.10(s，3H)，1.45(s,6H)。
化合物38：
参照化合物14的合成方法，产率70％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.88(s，1H)，7.53(s,1H),7.40(d,1H),7.32(d,1H),7.30(s,1H),3.85(t，2H)，3.46(t，2H)，3.10(s，3H)，1.46(s,6H)。
化合物39：
参照化合物2的合成方法，产率95％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.03(s，1H)，7.51(s,1H),7.44(d,1H),7.32(d,1H),7.21(s,1H),3.85(t，2H)，3.46(t，2H)，3.10(s，3H)，1.50(s，9H)，1.45(s,6H)。
探针28：
参照探针1的合成方法，产率75％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.05(s,1H),8.55(t,J＝5.8Hz,1H),8.12(s,1H),7.79(s,1H),7.48(s,1H),7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.41(d,1H),7.32(d,1H),7.31(s,1H),7.30(d,J＝7.9Hz,2H),6.27(s,2H),5.44(s,2H),4.89(t,J＝5.6Hz,1H),4.37(d,J＝5.8Hz,2H),3.65(t,J＝5.6Hz,2H),3.48(t,J＝5.6Hz,2H),3.09(s,3H),1.49(s,9H)。
实施例29
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于CLIP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针29：
Figure BDA0001665872440000241
探针29：
参照探针1的合成方法，产率74％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.05(s，1H)，7.68(d，1H)，7.58(t，3H)，7.45(s,1H),7.43(d,1H),7.29(d，2H，J＝6.0Hz)，7.27(d,1H),7.24(s,1H),7.11(d，2H，J＝6.0Hz)，6.85(bs，2H)，6.08(d，1H)，5.20(s，2H)，4.24(t，2H)，4.15(d，2H)，3.66(t，2H)，3.15(s，3H),1.46(s，9H)。
实施例30
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针30：
Figure BDA0001665872440000242
化合物40：
参照文献(Eric A.Owens et.al.Dyes and Pigments,2015,113,27-37)的方法合成。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.76(d，1H)，7.60(s，1H)，7.03(d，1H)，2.34(s，3H)，1.42(s，6H)。
化合物41：
化合物40(0.474g，2mmol)溶于50ml二氧六环中，加入0.4g二氧化锡，80度油浴条件下搅拌3h，反应完毕，过滤，加水100ml，二氯甲烷萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离的产物0.45g，产率89％。NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.74(s，1H)，7.76(d，1H)，7.60(s，1H)，7.03(d，1H)，1.42(s，6H)。
化合物42：
参照化合物13的合成方法，产率58％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.74(s，1H)，7.76(d，1H)，7.60(s，1H)，7.03(d，1H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.42(s，6H)。
化合物43：
参照化合物2的合成方法，产率98％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.05(s，1H)，7.76(d，1H)，7.60(s，1H)，7.03(d，1H)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.45(s，9H)，1.42(s，6H)。
探针30：
参照探针1的合成方法，产率75％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.10(s,1H),8.55(t,J＝5.8Hz,1H),8.12(s,1H),7.79(s,1H),7.76(d，1H)，7.60(s，1H)，7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.30(d,J＝7.9Hz,2H),7.03(d，1H)，6.27(s,2H),5.44(s,2H),4.89(t,J＝5.6Hz,1H),4.37(d,J＝5.8Hz,2H),3.65(t,J＝5.6Hz,2H),3.48(t,J＝5.6Hz,2H),3.09(s,3H),1.49(s,9H)，1.42(s，6H)。
实施例31
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针31：
Figure BDA0001665872440000251
化合物44：
参照化合物2的合成方法，产率93％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.33(s,1H),7.74(s,1H),7.64-7.71(m,2H),7.41(d,1H),7.35-7.38(m,2H),7.22(d,1H),4.90(t,J＝5.2Hz,1H),3.66(t,J＝6.0Hz,2H),3.47(t,J＝6.0Hz,2H),3.10(s,3H),1.41(s,6H).
探针31：
参照探针1的合成方法，产率67％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.45(t,J＝5.8Hz,1H),8.20(s,1H),7.79(s,1H),7.73(s,1H),7.64-7.71(m,2H),7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.41(d,1H),7.35-7.38(m,4H),7.32(d,1H),6.27(s,2H),5.44(s,2H),4.90(t,J＝5.2Hz,1H),4,37(d,J＝5.8Hz,2H),3.66(t,J＝6.0Hz,2H),3.47(t,J＝6.0Hz,2H),3.10(s,3H),1.41(s,6H).
实施例32
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的荧光探针32：
Figure BDA0001665872440000252
探针32：
参照探针1的合成方法，产率87％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.03(s，1H)，7.86(d，1H)，7.74(t，3H)，7.48(s,1H),7.41(d,1H),7.36(d，2H，J＝6.0Hz)，7.32(d,1H),7.26(d，2H，J＝6.0Hz)，6.85(bs，2H)，6.08(d，1H)，5.20(s，2H)，4.24(t，2H)，4.15(d，2H)，3.66(t，2H)，3.14(s，3H),1.54(s，9H)，1.42(s，6H)。
实施例33
采用文献(T.Y.Wang et.al.Chem Sci.2016,7,301-307.)报道的方法制备得到参比探针BG-CCVJ和BG-Gly-CCVJ。
将探针1-32以及参比探针BG-CCVJ和BG-Gly-CCVJ分别溶于二甲基亚砜中，制得浓度均为1×10-2M的母液，分别加入甘油和甲醇中，混合均匀，配制终浓度为1×10-5M的溶液，根据探针不同，依次用各探针的最大激发波长在相同条件下检测其荧光发射图谱，结果如表1所示。
由表1可知，实施例探针荧光发射波长范围广，并且在甘油和甲醇中的荧光强度区别很大，对粘度变化响应灵敏，具有粘度响应性。
实施例34
将探针与对应的蛋白标签混合得混合样品，混合样品中探针终浓度为5μM，蛋白标签终浓度为10μM，将混合样品置于37℃孵育1小时，使用荧光分光光度计检测样品荧光强度变化，结果如表1所示。
由表1中游离探针量子产率可知：实施例的探针以及参比探针未与蛋白标签反应时荧光极低，接近PBS缓冲液本底荧光水平，说明在未与蛋白标签反应时，粘度响应性荧光探针的荧光未被激活，而由结合蛋白标签量子产率可知，实施例的探针同蛋白标签反应后可以在相应的激发发射通道检测到明显的荧光信号增强，荧光激活倍数达到几百倍到一千倍以上，并且具有较高的亮度，说明实施例的探针结合蛋白标签后荧光可以被激活，具有良好的荧光分子开关性质；而参比探针虽然也有荧光激活的性质，但是，激活后荧光量子产率很低，亮度非常低。
综上可知：实施例的探针结合蛋白标签后荧光可以被激活，具有良好的荧光分子开关性质。
表1不同探针荧光发射图谱检测结果
Figure BDA0001665872440000261
Figure BDA0001665872440000271
实施例35
将SNAP蛋白标签分别加入30uM的探针1、探针5、探针13、探针16、探针28的溶液中，制得SNAP蛋白标签终浓度为0.1uM、0.5uM、0.7uM、1.2uM、4.5uM、8.1uM、13.1uM、14.8uM的混合样品溶液，将混合样品溶液置于37℃反应1小时，使用荧光分光光度计检测样品激发发射光谱变化，根据发射光谱强度绘制SNAP蛋白标签浓度与荧光强度关系图，结果分别如图2～6所示。
从图2～6中可以看出，SNAP蛋白标签浓度在0.1uM～14.8uM的范围内与探针的荧光强度都具有较好的线性关系，因此，可以根据标准曲线对蛋白标签进行定量检测。
实施例36
Hela细胞为例检测化合物在哺乳动物细胞中的标记效果。将稳定表达蛋白标签的Hela细胞、Hela-WT细胞(Hela原始细胞，未表达蛋白标签)种植于于14mm玻璃底96孔细胞培养板中，稳定10小时。将探针16、探针17、探针18分别加入至培养基中并稀释至5μM。细胞置于37℃二氧化碳培养箱孵育2小时，使用Leica TPS-8共聚焦显微镜成像检测标记细胞荧光变化。图7B组结果显示加入上述探针后在Hela-WT细胞中未能检测到相应的荧光信号，说明探针荧光不受细胞内环境影响；而图7A组中表达蛋白标签的Hela细胞可以检测到强烈的荧光信号，荧光信号增强近700倍。
以上实验说明探针可以实现特异性标记细胞内蛋白标签，并且实现荧光特异性点亮，同时，探针荧光不受细胞内环境影响。
实施例37
为验证探针16、探针17、探针18可以应用于标记不同细胞器定位的目标蛋白，以Hela细胞为例检测了探针标记不同亚细胞蛋白标签的效果。Hela细胞5000细胞每孔种植于96孔玻璃底细胞培养板中，14小时后使用lipo2000试剂盒转染蛋白标签不同细胞器定位质粒；转染后24小时去除原有培养基，使用无酚红DMEM培养基清洗2次，使用含有0.2μM探针的无酚红培养基孵育细胞2小时，使用leica TCS-8共聚焦显微镜成像检测细胞标记效果。结果如图8显示，探针可以在免洗的情况下清晰展示多种亚细胞器结构，其中包括但不限于细胞质基质、高尔基体、线粒体、染色体、细胞骨架；
以上结果说明的探针可以作为细胞亚细胞器标记的有力工具。
实施例38
Hela细胞5000细胞每孔种植于96孔玻璃底细胞培养板中，14小时后使用lipo2000试剂盒共转染pcdna3.1-CLIP-histone(CLIP蛋白标签染色体定位质粒)、pcdna3.1-mito-SNAP(SNAP蛋白标签线粒体定位质粒)，每孔0.1μg；转染后24小时去除原有培养基，使用无酚红DMEM培养基2次，分别使用含有0.2μM的探针16和探针9的无酚红培养基孵育细胞2小时，使用leica TCS-8共聚焦显微镜成像检测细胞标记效果。结果如图9显示，探针16与探针9可以在同时在免洗的情况下分别清晰展示线粒体和染色体结构，且探针9标记的染色体荧光与探针16标记的线粒体荧光通道共定位系数低于0.1，说明两个荧光通道之间不会相互干扰。
以上实验说明不同探针荧光基团的光谱不会相互干扰，可以同时进行正交标记成像。
实施例39
首先，将表达SNAP蛋白标签的质粒pcdna3.1-SNAP(样品组)和未表达SNAP蛋白标签的对照质粒pcdna3.1-CAT(对照组)导入小鼠体内。此方法是将质粒溶解在很大体积的溶液中通过尾静脉注射迅速注射入小鼠体内，小鼠肝脏吸收质粒，进而表达目的蛋白。质粒注射后20小时，将溶于200ul PBS中的0.4μM探针16通过尾静脉注射方法注射到小鼠体内标记SNAP蛋白标签；6小时后解剖小鼠，通过柯达多光谱活体成像系统检测不同小鼠样品肝脏部位荧光差异。结果如图10显示，注射探针16的对照质粒pcdna3.1-CAT的小鼠肝脏荧光很低，而注射探针16的SNAP质粒pcdna3.1-SNAP的小鼠肝脏具有较强的荧光，信号强度是对照组荧光的20倍以上。
以上实验说明探针的荧光不受动物内环境影响，可以应用于活体动物体内，且可以特异性标记表达在肝脏部位的SNAP蛋白标签，并产生较强荧光信号。
实施例40：
为验证本发明探针的荧光激活与蛋白的存在具有相关性，以哺乳动物细胞SNAP蛋白为例，在Hela细胞中以AID降解系统为例检测了结合SNAP蛋白的探针在蛋白降解后的荧光变化。首先，Hela细胞20000/cm2种植于20mm玻璃底细胞培养皿中，14小时后通过invirtogen公司的lipofectmain2000转染试剂转染pcdna3.1-TIR1与pcdna3.1-SNAP-IAA17-H2B质粒。细胞转染后24小时，使用含有1μM探针16的无酚红DMEM培养基替换原有细胞培养基标记细胞，细胞样品置于37℃二氧化碳培养箱孵育1小时。标记完成后，使用LeicaSP8激光共聚焦显微镜成像检测细胞标记荧光信号，并加入吲哚乙酸(IAA)，诱导SNAP-IAA17-H2B蛋白降解，检测蛋白降解过程中细胞荧光变化情况。结果如图11所示，SNAP-IAA17-H2B蛋白定位于细胞核中(0min)，加入吲哚乙酸诱导蛋白降解，随着时间的增加，SNAP-IAA17-H2B蛋白荧光信号逐渐降低，加入吲哚乙酸140min时，荧光信号基本不可见，蛋白降解速度与文献报道结果一致。以上实验说明探针的荧光性质在哺乳动物细胞中的同样依赖于蛋白的存在，当蛋白存在时荧光被激活，当蛋白降解以后，荧光消失，可用于跟踪、监测目标蛋白的降解过程。
实施例41：
为验证本发明探针优异的耐光漂白性能，以哺乳动物细胞SNAP蛋白为例，在Hela细胞中检测探针16、探针17和探针18标记蛋白后在细胞内的光稳定性，同时表达荧光蛋白IFP682，并在同样条件下对比它们的光稳定性。将HeLa细胞按5000个/孔铺入96孔玻璃底培养板中，12小时后转染表达组蛋白定位的SNAP蛋白或荧光蛋白，培养36小时后使用leicaSP8共聚焦显微镜成像，使用输出功率为200μW的633nm激光进行拍摄。缩放设为2x，拍摄区域为93μm*93μm，扫描电压为600V，每秒拍摄一帧(0.833s/帧)。图12为蛋白的荧光强度随漂白时间的变化图，其中A～C分别为探针16、探针17、探针18，D为荧光蛋白IFP682。由图可知，探针16、探针17和探针18标记蛋白后的耐漂白能力均要明显优于文献报道的荧光蛋白IFP682。
对比实施例42：
以分子转子作为粘度响应性荧光染料，构建适用于SNAP蛋白标签的荧光激活型共价标记的参比荧光探针33(参照CN107641121A中的方法制备)：
Figure BDA0001665872440000291
参照专利(CN107641121A)公开的方法合成，产率45％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.42(s，1H)，10.01(s，1H)，7.89(s，1H)，7.18(s，1H)，7.81(s，1H)，7.4(m，4H)，6.96(d，2H，J＝5.6Hz)，6.29(s，2H)，5.46(s，2H)，4.40(d，2H，J＝4.8Hz)，3.85(t，2H，J＝5.6Hz)，3.60(t，2H，J＝5.6Hz)，3.10(s，3H)，1.50(m，15H)。
为验证本发明探针探针16、探针17和探针18优异的耐光漂白性能，以哺乳动物细胞SNAP蛋白为例，在Hela细胞中检测探针16、探针17和探针18和参比探针33标记蛋白后在细胞内的光稳定性，并在同样条件下对比它们的光稳定性。将HeLa细胞按5000个/孔铺入96孔玻璃底培养板中，12小时后转染表达组蛋白定位的SNAP蛋白，培养36小时后使用leicaSP8共聚焦显微镜成像，使用输出功率为200μW的633nm激光进行拍摄。缩放设为2x，拍摄区域为93μm*93μm，扫描电压为600V，每秒拍摄一帧(0.833s/帧)。图13为蛋白的荧光强度随漂白时间的变化图，其中A～C分别为探针16、探针17、探针18，D为参比探针33。由图可知，探针16、探针17和探针18标记蛋白后的耐漂白能力均要明显优于专利报道的参比探针33。
以上实验说明本发明探针荧光的耐漂白性质优异，其光稳定性明显优于已公开的参比探针33的光稳定性。
实施例43：
为验证式(I-1-1)～(I-1-7)中共轭体系B连接不同的电子受体所构成的探针均具有优异的耐光漂白性能，以探针2、探针5、探针11、探针13、探针16、探针28、探针30为例，以哺乳动物细胞SNAP蛋白为例，在Hela细胞中检测标记蛋白后在细胞内的光稳定性。将HeLa细胞按5000个/孔铺入96孔玻璃底培养板中，12小时后转染表达组蛋白定位的SNAP蛋白或荧光蛋白，培养36小时后使用leica SP8共聚焦显微镜成像，使用输出功率为200μW的633nm激光进行拍摄。缩放设为2x，拍摄区域为93μm*93μm，扫描电压为600V，每秒拍摄一帧(0.833s/帧)。图14为蛋白的荧光强度随漂白时间的变化图，其中A～G分别为探针16、探针28、探针5、探针11、探针30、探针2、探针13，由图14可知，探针标记蛋白后均拥有很强的耐漂白能力。
以上实验说明本发明探针荧光的耐漂白性质优异。

Claims (14)

1.一种荧光探针，其特征在于，具有如式(I)所示的结构，包括配体部分A，连接体部分C和荧光染料部分，所述荧光染料部分为粘度响应性荧光染料基团，包括电子供体部分D、共轭体系B和电子受体部分；
Figure FDA0003608203200000011
其中，
所述配体部分A选自下式结构：
Figure FDA0003608203200000012
连接体部分C为改性亚烷基，所述改性亚烷基为烷基的任意碳原子被选自-O-、或-CO-中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性亚烷基具有1～30个碳原子；
荧光染料部分具有如式(I-R)所示的结构，
Figure FDA0003608203200000013
其中，
电子供体部分-D-为-NX1-X2-，X1选自氢或烷基，X2选自亚烷基；
共轭体系B具有如式(I-1-1)～(I-1-7)所示的结构，
Figure FDA0003608203200000014
电子受体部分具有如下式(I-2)所示的结构，
Figure FDA0003608203200000015
其中，
R1选自氢；
R2选自氢、氰基、羧基、酯基、酰胺基、硫代酰胺基、硫代酯基、杂芳基；
R3为氰基；
或者，电子受体部分任选形成下式(I-2-c)环状结构：
Figure FDA0003608203200000021
其中，
Rc为氢；
Rd为氢；
各个Y1选自-O-、-S-；
各个Y2选自＝O、＝S；
各个Y3选自＝O、＝S；
其中，
所述“杂芳基”为环上含有选自N、O、或S中的至少一种杂原子的5～10元单环或稠合双环杂芳香基团；
所述“酯基”为R(C＝O)OR'基团；
所述“酰胺基”为RCONR'基团；
所述“硫代酰胺基”为R(C＝S)NR'基团；
所述“硫代酯基”为R(C＝S)OR'基团；
各个R为单键、各个R'各自独立地为烷基、或改性烷基，R'为改性烷基时，所述改性烷基为C1-C10烷基的任意碳原子被选自-O-、-CO-中一种基团置换所得的基团；所述的碳原子被置换，是指碳原子或碳原子与其上的氢原子一起被相应的基团置换；
所述“烷基”为C1-C10直链或支链烷基；
所述“亚烷基”为C1-C7直链或支链亚烷基。
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：所述“烷基”为C1-C7直链或支链烷基。
3.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：所述“烷基”为C1-C5直链或支链烷基。
4.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：所述“烷基”为选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基，1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、异戊基、1-乙基丙基、新戊基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、异己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、3-乙基戊基或2,2,3-三甲基丁基。
5.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：所述“亚烷基”为C1-C5直链或支链亚烷基。
6.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：所述杂芳基的芳香杂环选自、
Figure FDA0003608203200000022
Figure FDA0003608203200000023
7.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：所述电子受体部分为选自下式(I-2-1)～(I-2-11)、(I-2-13)、(I-2-15)和(I-2-18)中的一种：
Figure FDA0003608203200000024
Figure FDA0003608203200000031
8.根据权利要求1-7任一项所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针选自下式化合物：
Figure FDA0003608203200000032
Figure FDA0003608203200000041
9.一种荧光激活型蛋白特异性标记方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-7任一项所述的荧光探针与蛋白标签或者融合蛋白标签的靶蛋白接触，所述荧光探针的配体部分与蛋白标签发生标记反应，将荧光探针标记到蛋白标签上；所述将荧光探针标记到蛋白标签上为共价标记；所述方法为非用于疾病的治疗或诊断的方法。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述标记反应的反应介质选自纯蛋白溶液、细胞裂解液或蛋白标签或融合蛋白标签的靶蛋白所处在的原位介质。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述原位介质为细胞内介质、细胞器内介质、活体组织介质、血液或体液。
12.权利要求1-7中任一项所述荧光探针在蛋白荧光标记、蛋白的定量、检测或动力学研究，以及细胞、组织、活体影像中的用途；所述用途为非用于疾病的治疗或诊断方法的用途。
13.一种探针试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-7中任一项所述荧光探针。
14.根据权利要求13所述的探针试剂盒，其特征在于，所述探针试剂盒还包含生物相容性介质，所述生物相容性介质选自二甲基亚砜、缓冲剂、生理盐水中的至少一种，所述缓冲剂包括磷酸盐缓冲液。
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Application publication date: 20191126

Assignee: Changzhou fuluosen Medical Technology Co.,Ltd.

Assignor: Naying (Shanghai) Biotechnology Co.,Ltd.

Contract record no.: X2024980002428

Denomination of invention: A fluorescent probe and its preparation method and application

Granted publication date: 20220705

License type: Exclusive License

Record date: 20240304

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