CN116354883B - 一类用于极性检测的化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类用于极性检测的比率荧光探针及其制备方法与应用，属于分析化学技术领域，所述的比率荧光探针具有通式I的结构：或本发明通过氨基缩合反应生成含氮原子杂环，提高氮原子孤对电子与π体系的共轭程度，从而使探针分子同时产生n→π*与π→π*分子跃迁，进而构建可灵敏响应极性变化的比率荧光探针。本发明所构建的比率荧光探针暗毒性低，极性检测范围广，不易受探针浓度及仪器、环境因素干扰等问题，且探针衍生物在引入特异性靶向基团后，可以对特定细胞器或肿瘤部位实现精准定位。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一类用于极性检测的化合物及其应用。
背景技术
极性是一个复杂的物理参数，是指溶剂的整体溶剂化能力。在化学、化工领域，溶剂极性是推动化学反应进程的关键参数。在生命科学领域，细胞极性是细胞正常运行和调节过程中的重要参数，是细胞生理状态的基本特征。不同状态下的细胞内的极性变化可以反映生理和病理过程的活动。据报道，细胞异常的极性变化与糖尿病、抑郁症和癌症等疾病有关(Angew.Chem.Int.Ed.,52(2013)8124-8128；J.Photochem.Photobiol.B Biol.,75(2004)51-56)。细胞器是细胞内的特殊亚基，通常分别由它们自己的脂质双层包围。主要的真核细胞器包括细胞核、线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体等。不同种类的细胞器在同一细胞中分工不同，极性也大相径庭(Chem.Sci.,11(2020)596-601)。各种细胞器的异常极性变化与许多疾病有关。因此，对活细胞中多个亚细胞器的极性变化进行监测，有助于更准确地了解不同的生理和病理过程。
荧光探针因其灵敏度好、特异性高、响应迅速、使用便捷而成为生物传感和生物成像中的强大工具。其中，极性响应型荧光探针常通过分子内电子给体(例如，氨基)、共轭连接区和电子受体组成，以利于荧光探针被光激发后产生分子内电荷转移(IntramolecularCharge Transfer，ICT)而更好地对微环境极性变化产生响应。当依据上述机理构建的荧光探针周围环境的极性发生变化时，探针分子的基态、激发态与溶剂之间产生偶极-偶极相互作用，荧光发射强度会产生显著的变化：探针分子的基态、激发态之间产生π→π*跃迁对应的荧光发射峰强度随溶剂极性增强而降低，而探针分子的基态、激发态之间产生n→π*跃迁对应的荧光发射强度随溶剂极性增强而升高。
基于此，需要构建实现对不同细胞器或生物组织的特异性定位与极性检测的荧光探针。
发明内容
本发明的目的在于提供一类可灵敏响应极性变化的用于极性检测的化合物及其利用其作为比率荧光探针在检测环境极性变化的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为:
一种用于极性检测的化合物，化合物为通式Ⅰ的结构如下：
通式Ⅰ中：
R1选自H、羟基、C1-C18烷基、C1-C18烷氧基、C1-C18烷基酰胺基、C1-C18烷基叠氮基、C2-C18炔基、C1-C18烷基氨基、C1-C18烷基磺酸基、C1-C18烷基羟基、C2-C18烷基羧基或卤素；
R2选自H、卤素、羟基、胺基、C1-C18烷氧基、C1-C18烷基巯基，C1-C18烷基二硫基、C1-C18烷基胺基、C1-C18烷基亚氨基，C1-C18烷基肼、C1-C18卤代烷基、C1-C18烷基叠氮基、O6-苯甲基鸟嘌呤、异氧氰根、异硫氰根、C2-C18炔基、四嗪基团、吗啉、三苯基膦或对甲苯磺酰胺、未取代或被下述基团取代的C1-C18烷基或芳香基，下述基团为羟基、醛基、磺酸基、磷酸基、羧酸酯基、磺酸酯基、磷酸酯基、酰胺基、磺酰氯或磺酰胺基；
L1为连接链、(CH2CH2O)m，此处m为0-20的整数；
L2为连接链、(CH2)n，此处n为1-20的整数；且，当R1＝H，m＝0，n＝2时，R2不选自羟基。
优选，通式Ⅰ中，所述的R1选自R1选自H、羟基、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基酰胺基、C1-C10烷基叠氮基、C2-C10炔基、C1-C10烷基氨基、C1-C10烷基磺酸基、C1-C10烷基羟基、C2-C18烷基羧基或卤素；
R2选自H、卤素、羟基、胺基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基巯基，C1-C10烷基二硫基、C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基亚氨基，C1-C10烷基肼、C1-C10卤代烷基、C1-C10烷基叠氮基、O6-苯甲基鸟嘌呤、异氧氰根、异硫氰根、C2-C10炔基、四嗪基团、吗啉、三苯基膦或对甲苯磺酰胺、未取代或被下述基团取代的C1-C10烷基或芳香基，下述基团为羟基、醛基、磺酸基、磷酸基、羧酸酯基、磺酸酯基、磷酸酯基、酰胺基、磺酰氯或磺酰胺基；
L1为(CH2CH2O)m；
L2为(CH2)n，此处m为0-20的整数，n为1-20的整数；且，当R1＝H，m＝0，n＝2时，R2不选自羟基。
进一步优选，通式Ⅰ中，所述的R1选自H、羟基、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基酰胺基、C1-C10烷基叠氮基、C2-C10炔基、C1-C10烷基氨基、C1-C10烷基磺酸基、C1-C10烷基羟基和C1-C10烷基羧基中的一种；
R2选自H、卤素、羟基、胺基、C1-C10烷基羟基、C1-C10烷氧基、O6-苯甲基鸟嘌呤、C1-C10卤代烷烃、异氧氰根、异硫氰根、C2-C10炔基、C1-C10烷基叠氮基、四嗪基团或吗啉、三苯基膦、对甲苯磺酰胺；
L1为(CH2CH2O)m，
L2为(CH2)n，此处m为0-20的整数，n为1-20的整数；且，当R1＝H，m＝0，n＝2时，R2不选自羟基。
再进一步优选，通式Ⅰ中，所述的R1选自H、羟基、烷基、烷氧基中的一种；
R2选自H、卤素、羟基、胺基、烷基羟基中的一种；
L1为(CH2CH2O)m，
L2为(CH2)n，此处m为0-20的整数，n为1-20的整数；且，当R1＝H，m＝0，n＝2时，R2不选自羟基。
一种所述的用于极性检测的化合物的应用，所述通式Ⅰ所示化合物在作为比率荧光探针中的应用。
一种用于极性检测的比率荧光探针，含权利要求1所述的化合物或其衍生物。
所述比率荧光探针在细胞微环境中对特定细胞器或特异部位的极性检测中的应用
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述的荧光探针为比例荧光探针，与传统的荧光发光型探针相比，由于其具有自参比特征，检测的准确度更高，且容易避免浓度、环境、激发光源等的影响；
(2)本发明所述的荧光探针极性检测范围广，可在△f＝0.124-0.316的范围内，对极性形成灵敏的Boltzmann函数响应；
(3)本发明所述的荧光探针暗毒性低，水溶性好，pH稳定性好，生物相容性好，可以作为优良的荧光探针应用于可应用于细胞、组织及活体内的荧光成像领域；
(4)本发明提出以所述的比例荧光探针所示化合物或衍生物，以萘环为荧光基团，再连接具有靶向功能的分子基团后，同时具有极性检测和特定部位、细胞器靶向的功能，通过将具有靶向功能的分子基团引入探针分子结构上，使探针分子除本身具备的极性检测的功能外，还可具备额外的定位靶向功能；
(5)本发明所述的探针分子结构单一且稳定，原料易得，易于制备和纯化，有利于工业化生产制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述中间体化合物N1的1H NMR图谱。
图2为本发明所述中间体化合物N2的1H NMR图谱。
图3为本发明所述中间体化合物N3的1H NMR图谱。
图4为本发明所述用于极性检测的比率荧光探针N-TAG的1H NMR图谱。
图5为本发明所述用于极性检测的比率荧光探针N-TAG的13C NMR图谱。
图6为本发明所述用于极性检测的比率荧光探针N-TAG的HRMS图谱。
图7为本发明所述用于极性检测的比率荧光探针N-TAG在水溶液中的吸收图谱。
图8为本发明所述用于极性检测的比率荧光探针N-TAG在乙腈溶液中的吸收图谱。
图9为本发明所述用于极性检测的比率荧光探针N-TAG的pH响应曲线。
图10为本发明所述用于极性检测的比率荧光探针N-TAG在不同溶剂中的吸收光谱和荧光发射光谱。
图11为本发明所述用于极性检测的比率荧光探针N-TAG在体积比不同的水和1,4-二氧六环两相混合溶剂中的吸收光谱。
图12为本发明所述用于极性检测的比率荧光探针N-TAG在体积比不同的水和1,4-二氧六环两相混合溶剂中的荧光发射光谱。
图13为本发明所述用于极性检测的比率荧光探针N-TAG荧光强度比I472/I560与溶液极性△f的Boltzmann函数拟合关系。
图14为本发明所述用于极性检测的不同浓度的比率荧光探针N-TAG在MCF-7细胞中孵育24h后的细胞暗毒性。
图15为本发明所述用于极性检测的比率荧光探针N-TAG(5μM)在各细胞器的定位情况。
图16为本发明所述用于极性检测比率荧光探针N-TAG(5μM)染色的MCF-7细胞产生溶酶体贮积前后的比例荧光强度变化情况。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
下面结合实例对本发明的内容作具体阐述。
本发明构建了受光激发后同时具有π→π*与n→π*的双分子跃迁荧光探针，该探针不易受外部环境、检测底物和光漂白等因素的影响，能够对微环境极性变化进行准确的比率型荧光响应。本发明合成的荧光探针暗毒性低，该荧光分子上可引入不同的衍生基团，并且可以通过连接具有细胞器或其他组织靶向功能的分子基团，进而实现荧光探针对特定部位的专一性荧光成像与极性检测。
所述可用于检测极性变化的荧光探针的名称为N-TAG，具体可为氯己烷基团为与Halo tag蛋白的结合位点，其结构式为如下：
所述用于检测极性变化的荧光探针N-TAG的制备方法，包括以下步骤：
(1)将苊溶解在冰醋酸中，向上述溶液中逐滴滴入含有醋酸铬的醋酸溶液，进行搅拌反应。滴加结束后，再加入聚乙二醇，将反应升温。反应一段时间后，将反应溶液于室温下静置后倒入水中，有黄色沉淀生成。反应溶液经减压抽滤后得到滤饼，滤饼经洗涤、重结晶、真空干燥后，得到淡黄色固体，即为中间体化合物N1；
(2)在无水甲苯中加入乙酸铵和乙酸来催化丙二腈和中间体化合物N1在加热回流状态下发生缩合反应。反应结束后，将反应溶液冷却至有固体析出。通过真空抽滤收集在溶液中析出的固体，将洗涤后的固体通过真空干燥得到橙黄色固体，即为中间体化合物N2；
(3)向处于搅拌状态的含有中间体化合物N2的N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(DMF-DMA)溶液中加入胍基乙酸催化反应的发生。反应结束后，将反应溶液的溶剂蒸干，剩余物通过柱层析方法进行分离，并提纯目标化合物。经真空干燥后的紫红色固体，即为中间体化合物N3；
(4)向处于搅拌状态的含有中间体化合物N3的无水二氯甲烷溶液中滴加2-(2-(6-氯己氧基)乙氧基)乙胺，持续搅拌反应。反应结束后，将反应溶液的溶剂蒸干。蒸干后的剩余物通过柱层析方法进行分离，并提纯目标化合物。经真空干燥后的橙红色固体，即为最终化合物N-TAG。
优选地，步骤(1)中所述苊与醋酸铬的摩尔比为1:5～6；
进一步优选地，步骤(1)中所述苊与醋酸铬的摩尔比为1:5.9。
优选地，步骤(2)所述中间体化合物N1与丙二腈的摩尔比为：1:1～1.5；
进一步优选地，步骤(2)所述中间体化合物N1与丙二腈的摩尔比为：1:1。
优选地，步骤(3)所述N2、乙酸胍与N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛的摩尔比为：1:0.1:1～2；
进一步优选地，步骤(3)所述N2、乙酸胍与N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛的摩尔比为：1:0.1:1.2。
优选地，步骤(4)所述中间体化合物N3与2-(2-(6-氯己氧基)乙氧基)乙胺的摩尔比为：1:1～3；
进一步优选地，步骤(4)所述中间体化合物N3与2-(2-(6-氯己氧基)乙氧基)乙胺的摩尔比为：1:2。
进一步，步骤(1)中所述滴加时间为2h；所述升温反应的反应温度为40℃，反应时间为2h；所述静置时间为6h；所述滤饼洗涤溶液为水；所述重结晶溶液为甲醇。
进一步，步骤(2)所述缩合反应加热温度为115℃，反应时间为2h；所述洗涤固体的溶液为乙醇、水和正己烷等溶液。
进一步，步骤(3)所述反应温度为100℃，反应时间为0.5h，所述柱层析洗脱液为二氯甲烷。
进一步，步骤(4)所述搅拌反应温度为30℃，反应时间为4h，所述柱层析洗脱液为甲醇/二氯(1/10，v/v)。
实施例1荧光探针N-TAG的制备方法
一种应用Halo tag蛋白靶向溶酶体的用于极性检测的比率荧光探针的制备方法：
(1)在圆底烧瓶中加入苊(10g，64.85mmol)和130mL的醋酸(质量分数90％)，并在磁力搅拌下，滴加含有醋酸铬(39g，384mmol)的醋酸溶液(65mL，质量分数60％，滴加时间2h)。滴加完毕后，再向圆底烧瓶中加入65mL聚乙二醇，40℃下反应2h。反应结束后，将反应溶液在室温下静置6h后倒入200mL水中，立即有黄色沉淀生成。将反应溶液减压抽滤后得到滤饼，并用蒸馏水润洗滤饼2～3次。将润洗后的滤饼用无水甲醇重结晶后真空干燥，得到淡黄色固体，中间体化合物N1(4.12g，产率38％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3),δ:8.09(d,J＝7.9Hz,1H),7.96(d,J＝6.8Hz,1H),7.82(d,J＝8.2Hz,1H),7.72(t,J＝7.4Hz,1H),7.66–7.55(m,1H),7.47(d,J＝6.4Hz,1H),3.82(s,2H).
(2)在无水甲苯中，通过乙酸铵(0.55g，7.1mmol)和乙酸(2.25mL，39.2mmol)催化丙二腈(2.36g，35.7mmol)和中间体化合物N1(6.00g，35.7mmol)在加热回流状态下进行缩合反应。反应2h后，将反应溶液冷却并伴有固体析出。将析出的固体产物过滤收集后，用乙醇、水和正己烷等溶剂先后进行润洗，并真空干燥得到橙黄色固体，即中间体化合物N2(7.96g，产率77％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3),δ:8.54(d,J＝7.4Hz,1H),8.12(d,J＝8.1Hz,1H),7.83(d,J＝8.3Hz,1H),7.76(t,J＝7.8Hz,1H),7.67–7.62(m,1H),7.51(d,J＝6.9Hz,1H),4.43(s,2H).
(3)通过滴加乙酸胍(0.029g，0.25mmol)，催化中间体化合物N2(0.540g，2.5mmol)与N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(DMF-DMA，0.357g，3.0mmol)的缩合反应。反应溶液在100℃条件下，持续搅拌0.5h。反应结束后，将反应溶剂蒸干，并将剩余物通过柱层析方法进行分离，提纯目标化合物。硅胶柱层析分离提纯所用洗脱液为二氯甲烷。纯化后的目标化合物经真空干燥后为紫红色固体，即中间体化合物N3(0.676g，产率接近100％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3),δ:8.65(d,J＝7.4Hz,1H),8.57(s,1H),7.96(d,J＝8.1Hz,1H),7.67–7.59(m,2H),7.52–7.47(m,1H),7.28(s,1H),3.46(s,6H).
(4)将中间化合物N3(0.09g，0.33mmol)溶于3.8mL无水CH2Cl2(2mL)中，用注射器缓慢加入2-(2-(6-氯己氧基)乙氧基)乙胺(0.15g，0.66mmol)。反应时，溶液从紫红色变成了鲜橙色。在30℃下反应4h后，真空浓缩混合物，然后用硅胶柱以甲醇/二氯(1/10，v/v)为洗脱剂提纯粗品得到的橙红色固体，即为最终化合物N-TAG(0.105g，产率70％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3),δ8.35(d,J＝7.2Hz,1H),8.03(d,J＝8.1Hz,1H),7.93(s,1H),7.78(d,J＝7.7Hz,1H),7.70(t,J＝7.7Hz,1H),7.60(q,J＝6.9Hz,2H),4.41–4.26(m,2H),4.00–3.87(m,2H),3.68–3.60(m,2H),3.58–3.50(m,2H),3.44(t,J＝6.7Hz,2H),3.37(t,J＝6.7Hz,2H),1.67–1.57(m,2H),1.49–1.40(m,2H),1.33–1.24(m,2H),1.21(dd,J＝15.1,8.2Hz,2H),0.89(s,H).
13C NMR(101MHz,CDCl3),δ155.55,152.29,136.48,135.32,132.65,131.61,130.81,130.46,128.57,128.35,124.89,124.54,117.44,116.13,115.61,93.27,71.28,70.82,69.90,67.74,52.64,44.94,32.41,29.44,26.59,25.30.
其高分辨质谱具体数据如下：高分辨质谱理论值C26H28ClN3O2[M+H]+450.1943，实际值450.1999。
实施例2荧光探针N-TAG的水溶性测试
将荧光探针N-TAG用无水DMSO配置成20mM的测试母液。首先，通过空白溶剂对紫外-可见吸收光谱仪进行校正，在含有3mL超纯水的石英皿中，逐次加入探针N-TAG母液配置不同浓度的探针N-TAG溶液，混合均匀后制得测试样本，并将含有测试样本的石英皿置于紫外-可见光谱仪测试仓中进行探针吸收光谱的扫描(参见图7)。
探针的水溶性、脂溶性适中，才能更好地穿过细胞膜进行细胞成像。选取水和乙腈作为溶剂分别探究探针水溶性与脂溶性，来判断探针的应用浓度范围，从而更高效地检测细胞病变。
如图7，在0-40μM浓度范围内，对不同浓度下荧光探针N-TAG在水中的吸光度进行拟合，其吸光度与浓度之间呈线性相关关系，符合朗伯比尔定律。而在在0-30μM浓度范围内，对不同浓度下荧光探针N-TAG在乙腈中的吸光度进行拟合，其吸光度与浓度之间呈线性相关关系，同样符合朗伯比尔定律(图8)。在细胞测试过程中，一般配制染料浓度为1-5μM。故探针有着非常优异的的溶解性，且满足于细胞测试所需求的浓度。
实施例3荧光探针N-TAG的pH干扰实验
首先，分别配制pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10的PBS溶液(0.01mmol)各2mL，用微量进样器量取0.5μL的上述实施例2配置的N-TAG母液(20mM)，加入到配置好的不同pH体系中，用荧光光谱仪测定其荧光强度(参见图9)。
溶酶体是酸性细胞器，pH范围为4.0-5.5，这种酸性的环境条件是为了维持溶酶体中水解酶的活性。
如图9可见，在pH＝4.0-5.5的范围内，探针N-TAG的荧光发射峰强度基本保持不变。这说明探针N-TAG在实际应用时能够遁免酸性环境的干扰，可用于溶酶体内的极性检测。
实施例4荧光探针N-TAG在不同溶剂中的吸收和发射光谱测试
将荧光探针N-TAG用无水DMSO配置成20mM的测试母液。通过空白溶剂对紫外-可见吸收光谱仪进行校正，再将相同体积的探针N-TAG母液(20mM)分别与不同溶剂(按照极性由小到大依次为：甲苯、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、正己醇、二甲基亚砜、甲醇和水)混合至石英皿中，混合均匀后制得测试样本(30μM，3mL)，并将含有测试样本的石英皿置于紫外-可见分光光度计测试仓中进行探针吸收光谱的扫描，后通过荧光光谱仪对上述测试样本进行激发，获得探针的荧光发射光谱(参见图10)。
检测结果如图10所示：当测试溶剂为具有高极化率的甲醇和水时，荧光探针N-TAG的最大吸收峰处于短波长波段(约420nm)，其荧光发射峰处于短波长波段(约470nm)；而当测试溶剂为具有较低极化率的甲苯、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、正己醇和二甲基亚砜时，荧光探针N-TAG的最大吸收峰处于长波长波段(约480nm)，荧光发射峰处于长波长波段(约550nm)；即荧光探针N-TAG的吸收和发射波长同时具有极性敏感性。
实施例5荧光探针N-TAG在不同极性的混合溶剂中的吸收和发射光谱测试
将荧光探针N-TAG用无水DMSO配置成20mM的测试母液。首先通过空白溶剂对紫外-可见分光光度计进行校正，再将相同体积的探针母液(20mM)分别经水和1,4-二氧六环两种溶剂分别稀释至不同浓度作为极性不同测试体系，极性不同测试体系加入至石英皿中(3mL)，混合均匀后制得测试样本，并将含有测试样本的石英皿置于紫外-可见分光光度计测试仓中进行探针吸收光谱的扫描，后通过荧光光谱仪对上述测试样本进行激发，获得探针的荧光发射光谱(参见图11和图12)。
检测结果如图11、图12所示。从图中可以看出，随着极性的增大，探针N-TAG吸收峰从480nm(△f＝0.124～0.253)蓝移到415nm(△f＝0.263～0.316)。与此同时，N-TAG的荧光发射峰也产生了从560nm(△f＝0.124～0.253)到472nm(△f＝0.263～0.316)的明显蓝移。通过对探针的荧光强度比值I476/I558与溶液极性大小进行Boltzmann拟合发现(图13)，探针I472/I560的值在△f＝0.124～0.316范围内随着极性的升高而增加。因此，探针N-TAG作为比率荧光探针能够对溶剂极性变化进行灵敏检测。
所用仪器为紫外-可见分光光度计，型号：Perkin Elmer Lambda 35UV/VIS；荧光分光光度计，型号：F-4600日立高新技术公司。
实施例6荧光探针N-TAG的细胞毒性测试
人源乳腺癌细胞(MCF-7)购买于江苏省凯基生物技术股份有限公司。MCF-7细胞的培养介质为添加10％胎牛血清(FBS，PANS)和1％青霉素-链霉素双抗溶液(Gibco)的Dulbecco’s modified Eagle’s(DMEM，Gibco)完全培养基。MCF-7培养条件为在含有5％二氧化碳和95％空气的培养箱中贴壁培养。
细胞传代时，将含有细胞的完全培养基加到96孔板(Costar)中(100μL/孔)，为保证数据的有效性，每孔细胞接种密度需要达到1×105个/mL。细胞贴壁24h后，弃去原有培养基，用磷酸缓冲盐溶液(PBS，0.01M，pH＝7.4)清洗96孔板(100μL/孔)。随后，包含6个复孔的实验组细胞分别用含有0、0.25、0.5、1、2.、5、8和10μM探针的DMEM完全培养基孵育。细胞孵育24h后，移除每个复孔里的原有培养基，用PBS溶液清洗后，将MTT加入到96孔板中(10μL/孔，5mg/mL)，并将96孔板置于培养箱中继续培养4h。培养结束后，小心地移除溶液，将沉积在细胞底部的甲瓒用DMSO溶解(100μL/孔)。细胞活性计算公式如下所示：
其中，OD490 nm和OD570 nm为探针孵育组或对照组甲瓒吸收光谱在490nm和570nm波长处的吸光度。从图14中可以看出，MCF-7仍都有较高的存活率，表明探针N-TAG具有较低的细胞毒性，可以用做细胞微环境极性的检测。
实施例7荧光探针N-TAG对溶酶体的定位
将探针N-TAG(5μM)孵育在可表达融合有Halo tag和LAMP1蛋白的MCF-7细胞中。15min后，弃掉培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次。随后使用溶酶体分离试剂盒(Inventbiotechnologies，LY-034)、线粒体分离提取试剂盒(ExKine，KTP4003)、细胞核提取试剂盒(Solarbio，SN0020-50T)、高尔基体提取试剂盒(Minute，GO-037)、内质网提取试剂盒(Sigma，ER0100)分别提取各细胞器，具体操作步骤要按照其说明书严格执行，提取出的细胞器再悬浮于不含钙和镁的PBS溶液中，通过测定其荧光强度，判断探针在各个细胞器中的分布情况。测定结果如图15所示，溶酶体中的荧光强度远高于其他细胞器，因此可以推断，本发明所合成的荧光探针N-TAG在连接溶酶体靶向蛋白后，可以实现在溶酶体部位的特异性累积，从而对溶酶体极性进行检测。
实施例8荧光探针在活细胞中的成像应用
细胞的培养密度为2×105个/mL。成像所用仪器为Olympus FV1000-IX81倒置显微镜，60倍油镜。
将适当密度的MCF-7别接种到两个灭菌的35mm成像培养皿中，在CO2培养箱(温度为37℃，5％ CO2)中培养，待细胞贴壁后，向A组加入实施例5制备的荧光探针N-TAG母液，使探针的最终浓度为5μM，弃掉培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，随后进行荧光成像；B组先用蔗糖(sucrose)溶液(80mM)孵育10分钟，然后再加入探针，探针的最终浓度为5μM，弃掉培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，随后进行荧光成像(激发波长：405nm；发射波段：493-550nm)。结果如图16所示，用蔗糖处理过的细胞的比例荧光强度比正常处理的细胞的比例荧光强度强，说明蔗糖处理后细胞内溶酶体贮积，引起溶酶体体积的增加和极性的升高。因此，本发明的探针的荧光比例能够对不同极性溶酶体作出响应。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实例作了详细介绍，但是应当认识到上述的描述不应当被认为是对本发明的限制。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种用于极性检测的化合物，其特征在于：化合物为
。
2.一种权利要求1所述的用于极性检测的化合物的应用，其特征在于，所述化合物在作为比率荧光探针中的应用。
3.一种用于极性检测的比率荧光探针，其特征在于：含权利要求1所述的化合物。
4.按权利要求3所述的用于极性检测的比率荧光探针的应用，其特征在于：所述比率荧光探针在细胞微环境中溶酶体、线粒体、细胞核、高尔基体和内质网的极性检测中的应用。
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Non-Patent Citations (2)
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