CN110498758B - 用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物荧光分析技术领域，公开了一种用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针及其制备和应用，其中探针包括如下化学结构式所示的结构；式中，R1、R2独立的选自卤素原子、(CH2)nR3、(CH2)mOR4、NO2、CN、NH2、CONHNH2、COOR5或(CH2CH2O)pR6。本发明通过对探针关键的化学结构设计进行改进，将希夫碱结构作为识别基团，将半花菁结构作为荧光团，利用新的识别基团能够特异性的与谷胱甘肽反应，避免半胱氨酸和同型半胱氨酸的干扰，得到的关开型的近红外荧光探针，能够更加灵敏的对生物样品中的谷胱甘肽进行定量检测。
Figure DDA0002166749510000011

Description

用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针及其制备和应用
技术领域
本发明属于生物荧光分析技术领域，更具体地，涉及一种用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针及其制备和应用，该近红外荧光探针是种关开型近红外荧光探针，采用新的识别基团特异性识别谷胱甘肽，能够快速识别谷胱甘肽，可检测在水溶液、活细胞和小鼠中的谷胱甘肽。
背景技术
细胞内生物硫醇(Intracellular biothiols)主要包括还原型谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)等。它们在许多生物学过程中起着重要作用。值得注意的是，谷胱甘肽广泛分布于生物体内，可作为细胞内生物硫醇的生物标志物。据文献报道，谷胱甘肽(GSH)在生理过程中能提高机体的免疫力和抗衰老能力，是一种很好的生理抗氧化剂。然而，异常的谷胱甘肽水平与艾滋病、肝损伤、癌症、白细胞丢失等多种疾病有关。
目前，检测GSH的传统方法主要是基于电化学或吸光度的检测，依赖于HighPerformance Liquid Chromatography(HPLC)、Gas Chromatography and MassSpectrometry(GC-MS)等测试手段。但这些方法存在复杂的样品前处理过程，对细胞和组织伤害较大。对于检测生物体内GSH含量，不同文献报道GSH的浓度数值差了3个数量级。因此，为了更好地理解GSH在细胞过程和相关疾病的病理学中的作用，需要准确和可靠地测量生物样品中的GSH浓度。
由于荧光探针具有高选择性、特异性以及良好的生物相容性，越来越多的被用于生物系统中小分子的实时检测。目前已存在的用于GSH成像的探针的识别基团都是含有磺酸酯结构，它可以与生物系统中半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)三者结构中的巯基进行反应，产生荧光响应，因此在特异性方面存在不足，无法选择性识别谷胱甘肽，从而检测生物体内GSH的含量。
基于GSH重要的生物学意义，发展一种理想的关开型近红外荧光探针检测内源性的GSH是十分有必要的。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，尤其是现有技术中的探针在检测谷胱甘肽选择性以及灵敏性方面的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针及其制备和应用，其中通过对探针关键的化学结构设计进行改进，将希夫碱结构作为识别基团，将半花菁结构作为荧光团，利用新的识别基团能够特异性的与谷胱甘肽反应，避免半胱氨酸和同型半胱氨酸的干扰，得到的关开型的近红外荧光探针，能够更加灵敏的对生物样品中的谷胱甘肽进行定量检测。并且，本发明还通过对制备方法的整体流程工艺设计等进行控制，经过4步反应得到关开型近红外荧光探针HCG，制备工艺简单，操作步骤少，可操作性强。本发明中的探针尤其可用于对内源性谷胱甘肽的检测，实现例如对细胞内谷胱甘肽产生途径的探索等。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针，其特征在于，包括如下化学结构式所示的结构：
Figure BDA0002166749490000021
其中，R1、R2独立的选自卤素原子、(CH2)nR3、(CH2)mOR4、NO2、CN、NH2、CONHNH2、COOR5或(CH2CH2O)pR6；n、m、p均为满足0～18的整数，R3、R4、R5、R6选自H、金属离子、卤素原子、NO2、C1-18烷基、CN或CONHNH2。
作为本发明的进一步优选，所述R1为NH2、CN、NO2、CONHNH2中的任意一者，R2为NO2、NH2、CN、COOCH3中的任意一者。
按照本发明的另一方面，本发明提供了制备上述用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，该制备方法是将花菁类染料与苯胺类物质反应得到含有希夫碱结构的近红外荧光探针；其中，苯胺类物质具有如下式所示的化学结构式：
Figure BDA0002166749490000031
式中，R1、R2独立的选自卤素原子、(CH2)nR3、(CH2)mOR4、NO2、CN、NH2、CONHNH2、COOR5或(CH2CH2O)pR6；n、m、p均为满足0～18的整数，R3、R4、R5、R6选自H、金属离子、卤素原子、NO2、C1-18烷基、CN或CONHNH2。
按照本发明的再一方面，本发明提供了制备上述用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，该制备方法是以2,3,3-三甲基-3H-吲哚，环己酮为起始原料，将2,3,3-三甲基-3H-吲哚经甲基取代所得的产物与环己酮经与N，N-二甲基甲酰胺缩合所得的产物两者进行Aldol缩合反应得到花菁类染料，然后，再将该花菁类染料与苯胺类物质反应得到含有希夫碱结构的近红外荧光探针；其中，苯胺类物质具有如下式所示的化学结构式：
Figure BDA0002166749490000032
式中，R1、R2独立的选自卤素原子、(CH2)nR3、(CH2)mOR4、NO2、CN、NH2、CONHNH2、COOR5或(CH2CH2O)pR6；n、m、p均为满足0～18的整数，R3、R4、R5、R6选自H、金属离子、卤素原子、NO2、C1-18烷基、CN或CONHNH2。
作为本发明的进一步优选，所述苯胺类物质具体为2-硝基-苯二胺。
按照本发明的又一方面，本发明提供了上述用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针在制备用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针制品中的应用。
按照本发明的最后一方面，本发明提供了上述用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针在谷胱甘肽检测中的应用。
作为本发明的进一步优选，所述谷胱甘肽检测具体是在pH＝5-10的条件下对谷胱甘肽的检测；优选的，pH＝7.4。
作为本发明的进一步优选，所述谷胱甘肽检测具体是检测活细胞中外源性或者内源性的谷胱甘肽。
作为本发明的进一步优选，所述谷胱甘肽检测具体是检测小鼠中外源性或者内源性的谷胱甘肽。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明以希夫碱结构为识别基团、半花菁结构作为荧光团构建关开型近红外荧光探针，其荧光性质基于希夫碱结构结合质子发生红移。探针本身只有一个短波峰(450nm)，与谷胱甘肽反应后，希夫碱结合谷胱甘肽中的氢质子发生红移，表现为一个长的发射峰(653nm)，实现了关开型的性质；也就是说，该探针采用希夫碱(C＝N)作为识别基团使本身短波峰(450nm)，与谷胱甘肽反应后，希夫碱结合谷胱甘肽中的氢质子发生红移，表现为一个长的发射峰(653nm)，从而实现了关开型的性质，并可以选择性识别谷胱甘肽而不与半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)反应，在一定程度上避免上述干扰，同时由于具有近红外成像的性质，具有低的光子吸收，能提供高分辨率的荧光强度，在体外和体内产生有效的荧光信号，不受荧光干扰，可以在体内外获得有效的大分子成像，特别是在深部组织中，而且还能以较高的灵敏度和特异性对体内的大分子进行跟踪和监测，从而更好的对生物样品中的GSH进行实时追踪和定量。
在具体应用时，荧光探针尤其能够在生理条件pH＝7.4下特异性的与谷胱甘肽反应，可在活细胞中同时检测外源性与内源性的谷胱甘肽。本发明已经验证该探针可用于小鼠中谷胱甘肽生物分布的检测，可能为后续的临床诊断提供初步依据。
具体来说，本发明中的近红外荧光探针及其制备方法和应用方法，能够取得以下有益效果：
(1)本发明以希夫碱作为识别基团，解决了已有探针采用磺酸酯为识别基团存在的选择性较差的问题，缩短了识别谷胱甘肽的时间。
(2)本发明中的关开型的近红外荧光探针，还以半花菁结构为荧光团，提高的探针的灵敏性。因为近红外荧光探针相比于已存在的非近红外荧光探针存在以下几个优点：
√较低的检出限，灵敏度较高；
√受仪器，微环境等因素干扰较小，可以在体内外获得有效的大分子成像，特别是在深部组织中，而且还能以较高的灵敏度和特异性对体内的大分子进行跟踪和监测，能实现对被测物质的实时检测；
√可以通过荧光强度的变化对被测物质进行定量分析，不受探针本身荧光的干扰。
(3)此外，本发明采用以2,3,3-三甲基-3H-吲哚，环己酮为起始原料为起始原料经过4步反应得到关开型近红外荧光探针HCG，制备工艺简单，操作步骤少，可操作性强。
(4)生理条件pH＝7.4下，对探针荧光性质的检测发现，探针可以特异性的检测水溶液中的谷胱甘肽，表现出短波荧光强度(450nm)迅速发生红移产生出一个长的荧光波长(653nm)。符合关开型荧光探针的设计。通过荧光强度随时间或谷胱甘肽的浓度呈现良好的线性变化，计算其检出限为0.25μM,提高了探针的灵敏性，有望用于生物样品中谷胱甘肽的定量检测。
(5)基于本发明，能够实现HT-29，MCF-7，HepG 2三种细胞中外源性及内源性的谷胱甘肽的检测，发现N-乙基马来酰亚胺(NEM)可以作为细胞内谷胱甘肽的清除剂，其清除机理一方面为：NEM刺激细胞产生更多的氧化物质，升高细胞的ROS的水平，从而减少谷胱甘肽的来源。另一方面是通过直接与谷胱甘肽反应降低谷胱甘肽的水平。
(6)可用于小鼠中外源性及内源性谷胱甘肽的荧光检测，发现小鼠中肝脏的内源性谷胱甘肽含量大于其他器官，同时进一步验证了肝脏中的谷胱甘肽含量在所有器官中最高。因此所述的关开型近红外荧光探针可能为谷胱甘肽并发症的临床诊断提供初步依据。
综上，本发明的荧光探针采用的识别基团为希夫碱结构，它能够特异性的与谷胱甘肽反应，尤其不受其它结构相似小分子的影响如半胱氨酸和同型半胱氨酸，大大提高了选择性；而以半花菁结构作为为荧光团，通过C-C单键作为连接基团将两部分相连，构成了检测谷胱甘肽的关开型近红外荧光探针，提高了探针的灵敏性(检出限0.25μM)。本发明中的探针及基于该探针的探针制品，可以在生理条件pH＝7.4下对谷胱甘肽进行检测，也可检测活细胞中外源性、内源性的谷胱甘肽(例如，可在正常BALB/c小鼠中检测谷胱甘肽)，实现例如对细胞内谷胱甘肽产生途径的探索等。该探针在生理条件(pH＝7.4)下能够选择性地与谷胱甘肽快速响应(响应时间30s)，在HT-29，MCF-7，HepG 2三种细胞内能够同时检测内源性以及外源性的谷胱甘肽。
附图说明
图1中的a是10μM探针HCG以及10μM探针HCG与500μM GSH在DMSO/HEPES缓冲液中的紫外吸收光谱；图1中的b是10μM探针HCG以及10μM探针HCG与500μM GSH在DMSO/HEPES缓冲液中的荧光吸收光谱；图1中的c是10μM探针HCG与不同浓度的GSH(0,10,20,40,60,80,100,200,500,1000μM)在DMSO/HEPES缓冲液中的荧光吸收光谱；图1中的d是10μM探针HCG与不同浓度的GSH的线性关系图。
图2中的a是HCG对不同氨基酸的选择性，其中HCG终浓度为10μM，待测物的终浓度均为500μM；图2中的b是10μM探针HCG与500μM GSH的时间曲线。
图3是HCG在HT-29细胞内对内外源性GSH的荧光响应；其中，图3中的a对应探针10μM HCG与不同浓度GSH(0,200,500,1000μM)的流式细胞术分析；图3中的b对应流式细胞术荧光数值归一化结果；图3中的c是探针10μM HCG与不同浓度GSH(0,200,500,1000μM)在HT-29细胞共聚焦成像图。
图4是10μM探针HCG与500μM GSH的高效液相色谱图；其中，图4中的a是探针HCG保留时间图；图4中的b是GSH保留时间图；图4中的c是反应产物保留时间图。
图5中的a是探针HCG在BALB/c小鼠检测GSH的活体成像图；图5中的b对应活体成像荧光值归一化结果；图5中的c是小鼠离体器官成像图；图5中的d对应离体器官荧光值归一化结果。
图6是实施例1中用于快速识别谷胱甘肽的关开型近红外荧光探针的制备方法流程示意图。
图7是HCG在MCF-7和HepG2细胞内对内外源性GSH的荧光响应；其中，图7中的a是探针10μM HCG与不同浓度GSH(0,200,500,1000μM)在MCF-7细胞共聚焦成像图，图7中的b是探针10μM HCG与不同浓度GSH(0,200μM)在HepG2细胞共聚焦成像图。
图8是HCG在pH＝5-10条件下对谷胱甘肽的荧光响应关系图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明中可用于活细胞以及小鼠中谷胱甘肽检测的关开型近红外荧光探针，其包括如下化学结构式所示的结构：
Figure BDA0002166749490000081
该通式中，R1、R2为卤素原子(F,Cl,Br,I)、(CH2)nR3、(CH2)mOR4、NO2、CN、NH2、CONHNH2、COOR5或(CH2CH2O)pR6；
其中，n、m、p均为满足0-18中的整数，R3、R4、R5、R6为H、M(金属离子，如Na、K、Ca、Fe、Cu)、卤素原子(F、Cl、Br、I)、NO2、C1-18烷基、CN、CONHNH2。
上述探针的制备方法，总体来说，可以以2,3,3-三甲基-3H-吲哚，环己酮为起始原料，经过甲基取代、与N，N-二甲基甲酰胺缩合，然后两者经过Aldol缩合反应得到花菁类染料，最后花菁类染料与苯胺类物质反应得到含有希夫碱结构的近红外荧光探针。上述制备方法中的任意一个反应，溶剂可以选自：乙腈，甲醇，N，N-二甲基甲酰胺，水，乙酸乙酯，石油醚；反应温度在25℃-100℃区间内可任意选择。
当然，也可以直接以市售的花菁类染料为原料，将它与苯胺类物质直接反应得到含有希夫碱结构的近红外荧光探针。
本发明中关开型近红外荧光探针可用于活细胞以及活体(如小鼠)中谷胱甘肽检测。
以R1为NH2、R2为NO2为例，上述通式结构的名称为4-((E)-((E)-2-氯-3-(2-((E)-1,3,3-三甲基吲哚-2-亚基)亚乙基)环己-1-烯-1-基)亚甲基)氨基)-2-硝基苯胺。下面就以R1为NH2、R2为NO2为例，对本发明进行详细介绍。
实施例1
本发明中可用于活细胞以及活体(如小鼠)中谷胱甘肽检测的关开型近红外荧光探针HCG，其合成路线如下反应式所示：
Figure BDA0002166749490000091
可以以2,3,3-三甲基-3H-吲哚，环己酮为起始原料为起始原料，经过4步反应得到关开型近红外荧光探针HCG；制备工艺简单，操作步骤少，可操作性强。具体反应步骤可以如下：
[1]在乙腈中加入2，3，3-三甲基3H吲哚(1g，6.28mmol)和甲基碘(1.2g，8.45mmol)溶液，在100℃的油浴中回流12h。用薄层色谱法(TLC)对反应进行监测。反应完成后，混合物冷却到室温。溶剂在减压下蒸发，粗产物沉淀过滤得到粉红固体，再用CH3CN和乙醚混合溶液(V：V＝1：2)反复洗涤得到粉红固体。产率：84％。1H-NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.91(dd,J＝5.6,3.0Hz,1H),7.85-7.79(m,1H),7.65-7.57(m,2H),3.97(s,3H),3.37(s,6H),2.77(s,3H).13C-NMR(100MHz,d6-DMSO)δ196.5(s),142.6(s),142.1(s),129.8(s),129.3(s),123.8(s),115.6(s),54.4(s),35.2(s),22.2(s),14.7(s).
[2]将8mL二甲基甲酰胺和8mL二氯甲烷在冰浴下混合。将三氯氧磷(6.14g，40mmol)溶于3mL的二氯甲烷中。然后将混合液滴加到前一溶液中。加入环己酮(1g，10.0mmol)，反应颜色变黄后加热回流3h，冷却后倒入40克冰中，搅拌过夜。混合物用乙酸乙酯萃取，用饱和氯化钠洗涤，用无水Na2SO4干燥，然后在减压下除去溶剂，得到粗产物，再用硅胶柱层析，以汽油醚/乙酸乙酯(1：10-1：5，v/v)为洗脱剂。产率：67％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ2.51(t,J＝6.2Hz,4H),1.79-1.72(m,2H)。在该反应步骤中，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)是作为反应物参与反应。
[3]第[1]步产物(1.7g，9.77mmol)和第[2]步产物(0.85g，4.94mmol)溶于乙酸酐(20mL)。在混合物中加入乙酸钠(0.81g，9.77mmol)，在70℃下，在N2气氛下加热0.5h。冷却后，以甲醇/二氯甲烷(100：0-90：10，v/v)为洗脱剂，减压除去溶剂，得到粗产物，用硅胶柱层析进一步纯化。产物即花菁类染料Cy7，产率：67％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.34(d,J＝14.2Hz,2H),7.39(dd,J＝12.1,4.3Hz,4H),7.27-7.17(m,4H),6.19(d,J＝14.1Hz,2H),3.74(s,6H),2.73(t,J＝6.1Hz,4H),2.00-1.91(m,2H),1.71(s,12H).13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ172.9(s),150.7(s),144.4(s),142.7(s),140.9(s),128.8(s),127.6(s),125.4(s),122.1(s),110.9(s),101.5(s),49.2(s),32.7(s),28.1(s),26.7(s),20.7(s).
[4]Cy7(300mg，1.037mmol)和2-硝基苯-1，4-二胺(190mg，1.244mmol)溶于5mL无水DMSO中。然后在反应混合物中加入N，N-二异丙基乙胺(100μmol).反应温度为60℃，在氮气气氛下反应24h。然后在减压下除去溶剂，得到粗产物，用乙酸乙酯：石油硅胶柱层析法从10：1进一步纯化为3：1(v/v)，最终得到黑色固体HCG(即，关开型近红外荧光探针HCG)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.91(s,1H),8.02(d,J＝2.4Hz,1H),7.65(d,J＝12.7Hz,1H),7.41(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.26-7.18(m,2H),6.95-6.83(m,2H),6.70(d,J＝7.8Hz,1H),6.13(s,2H),5.47(d,J＝12.7Hz,1H),3.22(s,3H),2.77(t,J＝6.1Hz,2H),2.67-2.60(m,2H),1.91–1.83(m,2H),1.69(s,6H).13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ160.8(s),158.5(s),144.8(s),142.8(s),142.8(s),141.9(s),139.1(s),132.2(s),130.8(s),128.9(s),127.8(s),124.5(s),121.7(s),120.3(s),119.3(s),117.1(s),106.3(s),92.9(s),46.1(s),29.3(s),28.3(s),26.7(s),26.6(s),21.4(s).
实施例2
关于关开型近红外荧光探针HCG对谷胱甘肽(GSH)的荧光响应：
固定HCG的终浓度为10μM,GSH的终浓度为(0,10,20,40,60,80,100,200,500,1000μM)，37℃下反应15min,测定其浓度曲线，结果表明：荧光强度值随时间或GSH浓度增加而增大，并具有良好的线性关系，计算得出其检出限0.25μM，说明该关开型近红外荧光探针可以在生理条件pH＝7.4下对GSH进行定量检测。同时发现探针本身只有一个短波峰(450nm)，与谷胱甘肽反应后，表现为一个长的发射峰(653nm)(如图1中的a至d所示)，说明探针具有关开型的光学性质。
实施例3
关于关开型近红外荧光探针HCG对谷胱甘肽(GSH)的荧光响应的选择性：
将半光氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)、双氧水(H2O2)、谷胱甘肽(GSH)、甲醛(FA)、乙醛(Ethanal)、乙二醛(GO)、丙二醛(MDA)、NOC-18(NO供体)溶解在HEPES中，加入HCG储液以及DMSO，使HCG的终浓度为10μM,被检测物的浓度均为500μM，37℃反应15min测定其荧光性质并计算荧光强度值。结果表明：探针HCG对其他氨基酸均没有响应，尤其不受Cys和Hcy的干扰，对GSH选择性良好，解决了已有探针在选择性方面存在不足的问题(如图2中的a所示)。
实施例4
关于关开型近红外荧光探针HCG检测谷胱甘肽(GSH)的动力学测试：
用DMSO配置HCG的储备液(10mM)，取少量加入EP管中，用HEPES(10mM,pH＝7.4)缓冲溶液稀释,加入一定量的谷胱甘肽水溶液，再用DMSO及HEPES稀释，使HCG的终浓度为10μM,GSH的终浓度为500μM，于37℃水浴锅反应，每个30min取样，测定时间曲线，并计算荧光强度值。通过曲线得到关开型近红外荧光探针HCG检测谷胱甘肽(GSH)最短时间为30s，说明关开型近红外荧光探针HCG对谷胱甘肽具有快速识别的功能(如图2中的b所示)。
实施例5
关于关开型近红外荧光探针HCG的细胞毒性分析：
将不同浓度的HCG(0-100μM)加入到已孵育好的HT-29细胞内，继续孵育24h,应用MTT法检测细胞的增殖情况。测试结果表明：HCG在0-100μM的浓度范围内细胞的存活率达到了90％以上，说明探针HCG未显示明显的细胞毒性，可以应用到生物系统中。
实施例6
关于关开型近红外荧光探针HCG对内外源性谷胱甘肽(GSH)的荧光响应：
在HT-29细胞内，先加入不同浓度的GSH孵育1h,然后用HEPES洗去GSH，加入10或20μM的HCG，继续孵育1h。采用激光共聚焦成像或流式细胞术对荧光强度进行分析。激光共聚焦所用的光源分别为640nm和720nm,收集红光通道的图像，结果表明，随GSH浓度的增大，红光显著增强。对流式数据进行分析，也发现了同一趋势，说明在HT-29细胞内，HCG可以对内外源性的GSH有很好的荧光响应(如图3中的a至c所示)。
实施例7
关于关开型近红外荧光探针HCG对谷胱甘肽(GSH)响应的高效液相色谱分析：
用DMSO配置HCG的储备液(10mM)，取少量加入EP管中，用HEPES(10mM,用DMSO配置HCG的储备液(10mM)，取少量加入EP管中，用HEPES(10mM,pH＝7.4)缓冲溶液稀释,加入一定量的谷胱甘肽水溶液，再用DMSO及HEPES稀释，使HCG的终浓度为10μM,GSH的终浓度为500μM，于37℃水浴锅反应，pH＝7.4)缓冲溶液稀释,加入一定量的谷胱甘肽水溶液，再用DMSO及HEPES稀释，使HCG的终浓度为10μM,GSH的终浓度为500μM，于37℃水浴锅反应，利用HPLC测量反应产物，HCG，GSH的保留时间。结果表明，关开型近红外荧光探针HCG可以对谷胱甘肽(GSH)发生快速响应(如图4中的a至c所示)。
实施例8
关于关开型近红外荧光探针HCG对小鼠中谷胱甘肽(GSH)的荧光响应：
将BALB/c小鼠分为两组。对照组小鼠预注射生理盐水5min，GSH组预先注射GSH(1mm)5min。所有小鼠均注射HCG(10μM，100μL 145，1：99 DMSO/生理盐水，v/v)。该探针在BALB/c小鼠体内孵育30min，用小动物成像系统获得BALB/c小鼠的荧光图像。结果表明，当探针HCG进入到小鼠体内时，体内器官均具有良好的荧光响应，特别是在肝脏中的荧光响应值最高。说明关开型近红外荧光探针HCG对小鼠中谷胱甘肽(GSH)具有良好识别作用(如图5中的a至d所示)。
可见，基于本发明，将用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针用于正常BALB/c小鼠上，通过活体成像以及对不同的器官进行荧光成像，检测到谷胱甘肽在小鼠各个器官的生物分布，说明该探针不仅可以用于基础研究，对谷胱甘肽引起的并发症的初步临床诊断方面也具有重大的应用前景。
实施例9
关于关开型近红外荧光探针HCG对MCF-7细胞内谷胱甘肽(GSH)的荧光响应：
在MCF-7细胞内，先加入不同浓度的GSH孵育1h,然后用HEPES洗去GSH，加入10或20μM的HCG，继续孵育1h。采用激光共聚焦成像或流式细胞术对荧光强度进行分析。激光共聚焦所用的光源分别为640nm和720nm,收集红光通道的图像，结果表明，随GSH浓度的增大，红光显著增强(如图7中的a所示)。
实施例10
关于关开型近红外荧光探针HCG对HepG2细胞内谷胱甘肽(GSH)的荧光响应：
在HepG2细胞内，先加入不同浓度的GSH孵育1h,然后用HEPES洗去GSH，加入10或20μM的HCG，继续孵育1h。采用激光共聚焦成像或流式细胞术对荧光强度进行分析。激光共聚焦所用的光源分别为640nm和720nm,收集红光通道的图像，结果表明，随GSH浓度的增大，红光显著增强(如图7中的b所示)。
实施例11
关于关开型近红外荧光探针HCG对谷胱甘肽(GSH)在不同pH值的荧光响应：
固定HCG的终浓度为10μM,GSH的终浓度为500μM)，37℃下反应15min,测定其在pH＝5-10下的荧光响应关系曲线，结果表明：荧光探针HCG在pH＝5-10条件下依然可以稳定地对谷胱甘肽有很好的荧光响应(如图8所示)。
上述实施例仅以R1为NH2、R2为NO2为例，R1、R2还可以是其他基团(例如，R1为NH2、CN、NO2、CONHNH2中的任意一者，R2为NO2、NH2、CN、COOCH3中的任意一者；R1、R2可以任意排列组合，得到多种R1、R2基团的组合方式，当然R1与R2也有可能是同一种基团)，只要它们同时保有希夫碱结构和半花菁结构即可，均能够实现相似的功能。
上述实施例中，v/v或V：V均代表体积比。
另外，除了上述实施例1中采用的以2,3,3-三甲基-3H-吲哚，环己酮为起始原料为起始原料先制备花菁类染料外，也可直接采用市售的花菁类染料作为原料，将它与苯胺类反应得到含有希夫碱结构的近红外荧光探针。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针，其特征在于，包括如下化学结构式所示的结构：
Figure FDA0002541732670000011
其中，R1为NH2，R2为NO2。
2.制备如权利要求1所述用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，该制备方法是将花菁类染料与苯胺类物质反应得到含有希夫碱结构的近红外荧光探针；其中，所述花菁类染料具有如下式所示的化学结构式：
Figure FDA0002541732670000012
苯胺类物质具有如下式所示的化学结构式：
Figure FDA0002541732670000013
式中，R1为NH2，R2为NO2。
3.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述花菁类染料的制备方法如下：以2,3,3-三甲基-3H-吲哚，环己酮为起始原料，将2,3,3-三甲基-3H-吲哚经甲基取代所得的产物与环己酮在三氯氧磷存在的条件下与N，N-二甲基甲酰胺缩合所得的产物两者进行Aldol缩合反应得到花菁类染料。
4.如权利要求1所述用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针在制备用于识别谷胱甘肽的近红外荧光探针制品中的应用。
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