CN113237858B - 一种gsh传感器及gsh检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种GSH传感器及GSH检测方法,所述GSH传感器用于对GSH进行定量检测,所述GSH传感器包括含有Fe@C纳米酶和10‑乙酰基‑3,7‑二羟基吩嗪的Tris‑HCl缓冲溶液。本发明GSH传感器中包含的Fe@C纳米酶具有优异的氧化物酶活性,可催化荧光底物AR氧化生成AR‑ox,而GSH可以显著抑制Fe@C纳米酶的催化能力,利用其对GSH进行定量检测时,可以避免H2O2的参与,解决H2O2参与造成的传感器毒性和灵敏度低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体涉及一种GSH传感器及GSH检测方法。
背景技术
作为最重要的小分子硫醇之一,谷胱甘肽(GSH)在生物过程(例如氧化酶应激)中起着至关重要的作用,因此确定GSH的含量具有实际意义。
纳米酶由于制备成本低、稳定性高、易于储存、容易调节等优点,近年来被广泛应用于GSH传感器,但现有基于纳米酶开发的GSH传感器,多是基于具有类过氧化物酶活性的纳米酶构建,均需自身稳定性差且对生物样本具有破坏性的H2O2参与,增加了传感器的毒性,降低了传感器的灵敏度。
因此,现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于,针对现有技术的上述缺陷,提供一种GSH传感器及GSH检测方法,旨在解决现有GSH传感器由于H2O2的参与,具有毒性且灵敏度低的问题。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是:一种GSH传感器,其中,所述GSH传感器用于对GSH进行定量检测,所述GSH传感器包括含有Fe@C纳米酶和10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪的Tris-HCl缓冲溶液。
所述的GSH传感器,其中,所述GSH传感器中Fe@C纳米酶的制备方法包括:
将Fe(NO3)3·9H2O和PVP溶解于去离子水中,并将Fe(NO3)3·9H2O和PVP的混合溶液放置于循环水浴加热装置中,加热搅拌条件下得到前驱体;
对所述前驱体进行研磨后,将所述前驱体在惰性气体保护下进行煅烧处理,得到Fe@C纳米酶。
所述的GSH传感器,其中,所述加热温度为90℃~100℃。
所述的GSH传感器,其中,所述煅烧处理条件为:以1~3℃/min的升温速率升温至600~700℃并保温1~3h。
所述的GSH传感器,其中,所述惰性气体为氮气或氩气。
所述的GSH传感器,其中,所述GSH传感器的GSH浓度检测范围为0.2μM~7μM。
所述的GSH传感器,其中,所述GSH传感器中Tris-HCl缓冲溶液的pH值为2~9。
一种利用所述的GSH传感器的GSH检测方法,其中,包括:
将待测样品加入含有Fe@C纳米酶和10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪的Tris-HCl缓冲溶液中,并对加入待测样品后的Tris-HCl缓冲溶液进行孵育;
对孵育后的Tris-HCl缓冲溶液进行离心,取离心后的上清液进行荧光测试,得到上清液在585nm处的发射峰荧光强度;
根据上清液在585nm处的发射峰荧光强度以及预先确定的荧光强度-GSH浓度曲线图,确定待测样品中的GSH含量。
所述的GSH检测方法,其中,所述孵育温度为35~45℃,所述孵育时间为20~40min。
所述的GSH检测方法,其中,所述荧光测试时的激发波长为558nm。
有益效果:本发明GSH传感器中包含的Fe@C纳米酶可催化荧光底物AR氧化生成AR-ox,而GSH可以显著抑制Fe@C纳米酶的催化能力,利用其对GSH进行定量检测时,可以避免H2O2的参与,解决H2O2参与造成的传感器毒性和灵敏度低的问题。
附图说明
图1是本发明实施例提供的GSH传感器的检测原理图;
图2是本发明实施例1制备的Fe@C纳米酶的活性分析图;
图3是本发明实施例2得到的荧光强度-GSH浓度曲线图;
图4是本发明实施例3得到的不同氨基酸或金属离子对应的Fe@C纳米酶活度图。
具体实施方式
本发明提供一种GSH传感器及GSH检测方法,为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确,以下对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
作为最重要的小分子硫醇之一,谷胱甘肽(GSH)在生物过程(例如氧化酶应激)中起着至关重要的作用,因此确定GSH的含量具有实际意义。现有用于检测GSH含量的方法包括比色、荧光、高效液相色谱法、原子光谱法等,但现有GSH检测方法成本高,过程复杂。
基于纳米酶开发的GSH传感器由于具有制备成本低、稳定性高、易于储存、容易调节等优点,而受到人们广泛研究。但现有基于纳米酶开发的GSH传感器,多是基于具有类过氧化物酶活性的纳米酶构建,利用GSH对过氧化物纳米酶催化H2O2氧化显色底物反应的抑制作用,均需自身稳定性差且对生物样本具有破坏性的H2O2参与,增加了传感器的毒性,降低了传感器的灵敏度。
为了解决上述问题,本发明实施例提供了一种GSH传感器,所述GSH传感器用于对GSH进行定量检测,所述GSH传感器包括含有Fe@C纳米酶和10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪(AR)的Tris-HCl缓冲溶液。本实施例提供的GSH传感器的GSH检测原理图如图1所示,二维Fe@C纳米酶可催化荧光底物AR氧化生成AR-ox,但当向反应体系中加入GSH后,GSH对Fe@C纳米酶的活性具有抑制作用,使得Fe@C纳米酶无法催化荧光底物AR氧化生成AR-ox。因此,使用本发明实施例提供的GSH传感器对待测样品的GSH含量进行定量检测时,可以将待测样品置于含有Fe@C纳米酶和10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪的Tris-HCl缓冲溶液的传感器中,由于本实施例制备的Fe@C纳米酶可催化荧光底物AR氧化生成AR-ox,样品的荧光发射光谱在585nm处可以观察到较强的荧光信号,而GSH对Fe@C纳米酶的活性具有抑制作用,通过对待测样品的反应体系的上清液进行荧光测试,获取上清液在585nm处的发射峰荧光强度即可确定待测样品的GSH含量。
在一具体实施方式中,所述GSH传感器中使用的Fe@C纳米酶的制备方法包括:
S1、将Fe(NO3)3·9H2O和PVP溶解于去离子水中,并将Fe(NO3)3·9H2O和PVP的混合溶液放置于循环水浴加热装置中,加热搅拌条件下得到前驱体;
S2、对所述前驱体进行研磨后,将所述前驱体在惰性气体保护下进行煅烧处理,得到Fe@C纳米酶。
为了解决现有GSH传感器需要H2O2参与的问题,本实施例中以Fe(NO3)3·9H2O和PVP分别作为铁源和碳源,首先将Fe(NO3)3·9H2O和PVP溶解于去离子水中,然后将Fe(NO3)3·9H2O和PVP的混合溶液置于循环水浴加热装置中加热并不断搅拌,待混合溶液中水分蒸发后,停止加热并冷却至室温,得到前驱体。在一具体实施方式中,所述加热温度为90~100℃。
得到前驱体后,将前驱体转移至研钵并将前驱体充分研磨成粉末后,将前驱体粉末转移至管式炉中,在惰性气体保护下对前驱体粉末进行煅烧处理,前驱体经简单高温热解后得到Fe@C纳米酶。本实施例中以Fe(NO3)3·9H2O和PVP分别作为铁源和碳源,通过水浴加热和煅烧处理得到具有优异的氧化物酶活性的Fe@C纳米酶,制备的Fe@C纳米酶可催化荧光底物AR氧化生成AR-ox,而GSH可以显著抑制Fe@C纳米酶的催化能力,将其应用于GSH传感器可以避免H2O2的参与,解决H2O2参与造成的传感器毒性和灵敏度低的问题。
在一具体实施方式中,对前驱体进行煅烧处理时,在惰性气体保护下首先以1~3℃/min的升温速率升温至600~700℃,当达到预设温度后使前驱体粉末恒温反应1~3h,所述惰性气体为氮气或氩气,在此反应条件下制备出的Fe@C纳米酶具有良好的分散性,碳基质中的Fe纳米粒子的粒径较小且分布均匀,稳定性好,催化活性高。
在一具体实施方式中,所述GSH传感器的GSH浓度检测范围为0.2μM~7μM,检出限为0.103μM(3σ/slope),所述GSH传感器中使用的Tris-HCl缓冲溶液的制备方法为:将盐酸(HCl)及其对应的弱碱盐三羟甲基氨基甲烷(Tris)混合配置成pH值为2~9的缓冲溶液。在一具体实施例中,Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.4。
本发明还提供一种利用上述GSH传感器的GSH检测方法,所述方法包括:
M1、将待测样品加入含有Fe@C纳米酶和10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪的Tris-HCl缓冲溶液中,并对加入待测样品后的Tris-HCl缓冲溶液进行孵育;
M2、对孵育后的Tris-HCl缓冲溶液进行离心,取离心后的上清液进行荧光测试,得到上清液在585nm处的发射峰荧光强度;
M3、根据上清液在585nm处的发射峰荧光强度以及预先确定的荧光强度-GSH浓度曲线图,确定待测样品中的GSH含量。
具体地,利用上述所述的GSH传感器对待测样品中的GSH含量进行定量检测时,可以将待测样品加入含有Fe@C纳米酶和10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪(AR)的Tris-HCl缓冲溶液中,并将加入待测样品后的Tris-HCl缓冲溶液在35~45℃下孵育20~40min,然后对孵育后的Tris-HCl缓冲溶液进行离心,取离心后的上清液进行荧光测试,得到荧光发射光谱图,根据得到的荧光发射光谱图可以确定上清液在585nm处的发射峰荧光强度;最后根据上清液在585nm处的发射峰荧光强度以及预先确定的荧光强度-GSH浓度曲线图,即可确定待测样品中的GSH含量。
在一具体实施方式中,预先确定的荧光强度-GSH浓度曲线图如图2所示,其横坐标为GSH浓度,纵坐标为不同GSH浓度对应的585nm处的发射峰荧光强度,在确定荧光强度-GSH浓度曲线图时,可以将不同浓度GSH分别置于含有AR和Fe@C纳米酶的Tris-HCl缓冲溶液中,得到含有不同浓度GSH的混合溶液,然后将含有不同浓度GSH的混合溶液在35~45℃下孵育20~40min,并对孵育后的混合溶液进行离心,取离心后的上清液进行荧光测试,得到不同浓度GSH对应的585nm处的发射峰荧光强度,根据不同浓度GSH对应的585nm处的发射峰荧光强度即可确定荧光强度-GSH浓度曲线图。
进一步地,为了使GSH检测结果更精确,荧光测试时的激发波长为558nm,确定荧光强度-GSH浓度曲线图时使用的含有AR和Fe@C纳米酶的Tris-HCl缓冲溶液中各组分浓度和pH值与传感器中含有AR和Fe@C纳米酶的Tris-HCl缓冲溶液中各组分浓度和pH值相同,例如,若传感器中AR浓度为1μM,Fe@C纳米酶浓度为50mg/L,Tris-HCl缓冲溶液浓度为25mM,pH值为7.4,则确定荧光强度-GSH浓度曲线图时使用的含有AR和Fe@C纳米酶的Tris-HCl缓冲溶液中AR浓度为1μM,Fe@C纳米酶浓度为50mg/L,Tris-HCl缓冲溶液浓度为25mM,pH值为7.4。
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。
实施例1
(1)将3.0g Fe(NO3)3·9H2O和1.8g PVP溶解于去离子水中,并将Fe(NO3)3·9H2O和PVP的混合溶液放置于95℃的循环水浴加热装置中加热并不断搅拌,待混合溶液中水分蒸发后,停止加热并自然冷却至室温,得到前驱体;
(2)将前驱体转移至研钵中,充分研磨成粉末后,将粉末转移至管式炉中,在氩气保护下以2℃/min的升温速率升温至650℃,恒温反应2h,得到Fe@C纳米酶;
(3)将Fe@C纳米酶配置成含有Fe@C纳米酶和AR的Tris-HCl缓冲溶液;其中,[AR]=1μM,[Fe@C]=50mg/L,[Tris-HCl]=25mM,Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.4;
(4)将含有Fe@C纳米酶和AR的Tris-HCl缓冲溶液在40℃下孵育30min,并对孵育后的Tris-HCl缓冲溶液进行离心,取离心后的上清液进行荧光测试。
实施例2
(1)将实施例1制备的Fe@C纳米酶配置成含有Fe@C纳米酶和AR的Tris-HCl缓冲溶液,将不同浓度GSH分别加入含有Fe@C纳米酶和AR的Tris-HCl缓冲溶液,得到含有不同浓度GSH的混合溶液;其中,[AR]=1μM,[Fe@C]=50mg/L,[Tris-HCl]=25mM,Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.4;
(2)对含有不同浓度GSH的混合溶液在40℃下孵育30min,并对孵育后的混合溶液分别进行离心,取离心后的上清液进行荧光测试,得到荧光强度-GSH浓度曲线图。
实施例3
(1)将实施例1制备的Fe@C纳米酶配置成含有Fe@C纳米酶和AR的Tris-HCl缓冲溶液,将常见氨基酸(氨酸His、精氨酸Arg、赖氨酸Lys、甲硫氨酸Met、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、天冬酰胺Asn、甘氨酸Cly、半胱氨酸Cys)或常见金属离子(Pb2+、Zn2+、Ba2+、Al3+、Cu2+、Mg2 +)分别加入含有Fe@C纳米酶和AR的Tris-HCl缓冲溶液,得到含有不同氨基酸或金属离子的混合溶液;其中,[AR]=1μM,[Fe@C]=50mg/L,[Tris-HCl]=25mM,Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.4;
(2)对含有不同氨基酸或金属离子的混合溶液在40℃下孵育30min,并对孵育后的混合溶液分别进行离心,取离心后的上清液进行荧光测试,以确定不同氨基酸或金属离子对应的Fe@C纳米酶活度图。
图2为本发明实施例1制备的Fe@C纳米酶的活性分析图,从图2可以看出,当体系中Fe@C和AR分别单独存在时,在波长570-650nm内未显示任何吸收峰,表明该溶液中未发生氧化反应。当Fe@C和AR同时存在时,可以观察到585nm处出现很强的吸收峰,表明Fe@C的存在促进了底物AR的氧化,本实施例制备出的Fe@C具有氧化酶活性。
图3是本发明实施例2得到的荧光强度-GSH浓度曲线图,从图3可以看出,随着GSH浓度的增加,在发射峰585nm处荧光信号逐渐降低直至出现平台,荧光强度与GSH浓度在0.2μM~7μM的范围内呈现良好的线性关系(R2=0.9974),GSH的检出限可以达到0.103μM(3σ/slope)。
图4是本发明实施例3得到的不同氨基酸或金属离子对应的Fe@C纳米酶活度图,从图4可以看出,GSH对Fe@C纳米酶活性的影响较大,常见氨基酸(氨酸His、精氨酸Arg、赖氨酸Lys、甲硫氨酸Met、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、天冬酰胺Asn、甘氨酸Cly、半胱氨酸Cys)和常见金属离子(Pb2+、Zn2+、Ba2+、Al3+、Cu2+、Mg2+)对Fe@C纳米酶活性的影响较小,表明本实施例制备的Fe@C纳米酶对GSH具有良好的选择性,可以应用于GSH检测。
综上所述,本发明公开了一种GSH传感器及GSH检测方法,所述GSH传感器用于对GSH进行定量检测,所述GSH传感器包括含有Fe@C纳米酶和10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪的Tris-HCl缓冲溶液。本发明GSH传感器中包含的Fe@C纳米酶具有优异的氧化物酶活性,可催化荧光底物AR氧化生成AR-ox,而GSH可以显著抑制Fe@C纳米酶的催化能力,利用其对GSH进行定量检测时,可以避免H2O2的参与,解决H2O2参与造成的传感器毒性和灵敏度低的问题。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (9)
1.一种GSH传感器,其特征在于,所述GSH传感器用于对GSH进行定量检测,其中,GSH为谷胱甘肽,所述GSH传感器包括含有Fe@C纳米酶和10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪的Tris-HCl缓冲溶液;
所述GSH传感器中Fe@C纳米酶的制备方法包括:
将Fe(NO3)3·9H2O和PVP溶解于去离子水中,并将Fe(NO3)3·9H2O和PVP的混合溶液放置于循环水浴加热装置中,加热搅拌条件下得到前驱体;
对所述前驱体进行研磨后,将所述前驱体在惰性气体保护下进行煅烧处理,得到Fe@C纳米酶。
2.根据权利要求1所述的GSH传感器,其特征在于,所述加热温度为90℃~100℃。
3.根据权利要求1所述的GSH传感器,其特征在于,所述煅烧处理条件为:以1~3℃/min的升温速率升温至600~700℃并保温1~3h。
4.根据权利要求1所述的GSH传感器,其特征在于,所述惰性气体为氮气或氩气。
5.根据权利要求1所述的GSH传感器,其特征在于,所述GSH传感器的GSH浓度检测范围为0.2μM~7μM。
6.根据权利要求1所述的GSH传感器,其特征在于,所述GSH传感器中Tris-HCl缓冲溶液的pH值为2~9。
7.一种利用权利要求1~6任一项所述的GSH传感器的GSH检测方法,其特征在于,包括:
将待测样品加入含有Fe@C纳米酶和10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪的Tris-HCl缓冲溶液中,并对加入待测样品后的Tris-HCl缓冲溶液进行孵育;
对孵育后的Tris-HCl缓冲溶液进行离心,取离心后的上清液进行荧光测试,得到上清液在585nm处的发射峰荧光强度;
根据上清液在585nm处的发射峰荧光强度以及预先确定的荧光强度-GSH浓度曲线图,确定待测样品中的GSH含量。
8.根据权利要求7所述的GSH检测方法,其特征在于,所述孵育温度为35~45℃,所述孵育时间为20~40min。
9.根据权利要求7所述的GSH检测方法,其特征在于,所述荧光测试时的激发波长为558nm。
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