CN109678763B - 一种近红外生物硫醇荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测材料技术领域，尤其是涉及一种近红外生物硫醇荧光探针及其制备方法和应用。所述近红外生物硫醇荧光探针包括如下结构式
Figure DDA0001894565020000011
所述近红外生物硫醇荧光探针的制备方法包括如下步骤：化合物A与2,4‑二硝基苯磺酰氯反应得到目标化合物；其中，化合物A的结构式为
Figure DDA0001894565020000012
本发明的化合物几乎没有荧光，当与生物硫醇反应后发出强烈的荧光，并且，荧光发射波长大于650nm在近红外光区，能够与机体组织自身荧光相区分，能够有效的穿透组织消除生物背景干扰。所述化合物可用于检测生物硫醇，操作简单，具有快速、灵敏的双响应，在生物分子检测和环境领域具有广阔的应用前景。

Description

一种近红外生物硫醇荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及检测材料技术领域，尤其是涉及一种近红外生物硫醇荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
生物硫醇在生理和病理方面中扮演重要的角色。在机体中，生物硫醇水平含量的变化与一些重大疾病有密切的联系，如阿尔兹海默病，帕金森病等，因此对其机体水平含量的检测有着重要的意义。
与传统检测方法相比，荧光探针法具有独特的检测优势，比如灵敏度高，操作简便和实时检测等。然而，当前所报道的荧光探针中，大部分荧光探针的荧光发射波长范围在紫外可见光区，与机体组织的吸收和机体自身产生的荧光光谱范围(400-600nm)发生重叠，极大影响了检测效果。如若荧光发射波长超过600nm将有效的穿透组织消除生物背景干扰，近红外光(＞650nm)可以满足该条件，因此，开发具有近红外的生物硫醇探针，对机体环境中生物硫醇的跟踪检测具有重大的研究意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种近红外生物硫醇荧光探针，其本身几乎没有荧光发射，当与生物硫醇反应后荧光发射波长在近红外光区，作为生物硫醇探针使用时，能够有效的穿透组织消除生物背景干扰，提高检测精准度。
本发明的第二目的在于提供一种近红外生物硫醇荧光探针的制备方法，该方法操作简单，条件温和，产率高。
本发明的第三目的在于提供一种近红外生物硫醇荧光探针的应用，该荧光探针可用于检测生物硫醇，操作简单，具有快速、灵敏的双响应，在生物分子检测和环境领域具有广阔的应用前景。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种近红外生物硫醇荧光探针，包括如下结构式：
Figure BDA0001894560000000021
本发明的荧光探针，其自身几乎没有荧光发射，当与生物硫醇反应后荧光发射波长在近红外光区，＞650nm。当其作为生物硫醇荧光探针时，能够与机体组织的吸收和机体自身荧光相区分，能够有效的穿透组织消除生物背景干扰，提高检测精准度。
本发明还提供了上述化合物的制备方法，包括如下步骤：
化合物A与2,4-二硝基苯磺酰氯反应得到目标化合物；其中，化合物A的结构式为
Figure BDA0001894560000000022
优选的，化合物A的制备方法包括：中间体I与4-(N,N-二乙基)水杨醛反应得到化合物A；
其中，中间体I的结构式为
Figure BDA0001894560000000031
优选的，在缚酸剂作用下，化合物A与2,4-二硝基苯磺酰氯反应得到目标化合物。更优选的，在冰浴条件下搅拌反应0.5-1h，室温条件下搅拌反应0.5-2h。更优选的，化合物A与2,4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1﹕(1-2)。
缚酸剂可采用三乙胺，优选三乙胺的摩尔用量为化合物A的1-5倍。
优选的，室温条件下反应后，分离纯化，得到目标化合物。进一步优选的，分离纯化的方法包括：反应结束后，洗涤反应液，收集有机相并除去溶剂得到残渣，柱层析分离得到目标化合物。
Figure BDA0001894560000000032
优选的，化合物A的制备方法包括：中间体I与4-(N,N-二乙基)水杨醛混合于溶剂中，在催化剂的催化作用下，加热回流反应，得到化合物A。
优选的，中间体I与4-(N,N-二乙基)水杨醛的摩尔比为1﹕(1-1.5)。催化剂的加入量为催化剂计量即可，如可按照中间体I的质量的5-10％加入。
优选的，催化剂包括哌啶和醋酸中的一种或两种。
优选的，溶剂包括无水乙醇和乙腈中的任一种。
优选的，加热回流反应后，分离纯化，得到化合物A。更优选的，分离纯化的方法包括：反应结束后，除去溶剂得到残渣，柱层析分离得到化合物A。
优选的，加热回流反应的时间为4-8h，优选4-6h。
Figure BDA0001894560000000041
优选的，中间体I的制备方法包括：异氟尔酮与丙二腈混合于溶剂中，在哌啶的催化作用下，加热回流反应，得到中间体I。
优选的，异氟尔酮与丙二腈的摩尔比为1﹕(2-5)，优选1﹕(2-3)。哌啶的加入量为催化剂计量即可，如可按照异氟尔酮质量的5-10％加入。
优选的，溶剂包括无水乙醇、甲苯和乙腈中的任一种。
优选的，加热回流反应的时间为6-18h，优选8-12h。
优选的，加热回流反应后，分离纯化，得到中间体I。更优选的，分离纯化的方法包括：反应结束后，冷却，过滤收集沉淀，采用乙醇对沉淀重结晶，得到中间体I。
Figure BDA0001894560000000042
本发明还提供了一种近红外生物硫醇荧光探针的应用，本发明的近红外生物硫醇荧光探针可作为生物硫醇的近红外探针，用于检测生物硫醇，包括半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)中的任一种。
本发明的荧光探针可检测纳摩级别的生物硫醇，并且可通过裸眼直接观察到颜色的变化，快速直接得到检测结果。本发明的化合物作为检测生物硫醇的近红外探针，具有简单、快速、灵敏的优势，在生物分子检测和环境领域具有广阔的应用前景。
优选的，将荧光探针配制成浓度为10-3-10-5mol/L的溶液对生物硫醇进行检测。更优选的，溶液的溶剂包括乙醇和PBS。优选为体积比为1﹕1的乙醇-PBS，pH＝7.4，10mM。将化合物预先溶解于DMSO中，配成高浓度母液，然后采用上述溶剂稀释至检测浓度，即可。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明合成了一种新型化合物，与生物硫醇反应后，其荧光发射波长在近红外光区；
(2)本发明提供了该新型化合物的制备方法，该制备方法操作简单，反应易于控制，分离纯化方法简单，总体收率较高；
(3)本发明的化合物作为近红外生物硫醇荧光探针，可检测纳摩级别的生物硫醇，并且可通过裸眼直接观察到颜色的变化，并且，作为探针使用时，能够有效的穿透组织消除生物背景干扰，提高检测精准度，在生物分子检测和环境领域具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的目标化合物的1H-NMR图谱；
图2为本发明实施例提供的目标化合物的13C-NMR图谱；
图3为本发明实施例提供的目标化合物的高分辨质谱图谱；
图4为本发明实施例提供的目标化合物作为探针随Cys浓度变化的紫外吸收光谱图；
图5为本发明实施例提供的目标化合物作为探针随Cys浓度变化的荧光光谱图；
图6为本发明实施例提供的目标化合物作为探针随Hcy浓度变化的紫外吸收光谱图；
图7为本发明实施例提供的目标化合物作为探针随Hcy浓度变化的荧光光谱图；
图8为本发明实施例提供的目标化合物作为探针随GSH浓度变化的紫外吸收光谱图；
图9为本发明实施例提供的目标化合物作为探针随GSH浓度变化的荧光光谱图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例采用的部分仪器信息如下：
核磁共振谱采用瑞士Bruker公司Avance III 400MHz核磁共振仪测定，氘代二甲亚砜作为溶剂；
荧光图谱采用日本日立公司F-4500荧光光谱仪测定；
紫外图谱采用日本岛津公司UV-2450测定；
高分辨质谱采用德国安捷伦1290/maXis impact质谱仪测定。
实施例1
本实施例的目标化合物B的合成路线如下所示：
Figure BDA0001894560000000071
具体包括如下步骤：
(1)将276mg异氟尔酮(2mmol)和330mg丙二腈(5mmol)滴加到30mL无水乙醇中，磁力搅拌下，滴加3滴哌啶，加热回流12h，冷却至室温，析出固体，抽滤收集滤饼，将滤饼用无水乙醇重结晶，得到淡黄色片状固体中间体I，收率为78％。
(2)取186mg的中间体I(1mmol)溶解到15mL无水乙醇中，加入193mg的4-(N,N-二乙基)水杨醛(1mmol)，磁力搅拌下，滴加3滴哌啶，加热回流4h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂得到残渣，将残渣进行柱层析，得到化合物A，收率59％。
(3)取182mg化合物A(0.5mmol)溶解到10mL二氯甲烷中，加入100μL三乙胺(0.72mmol)，磁力搅拌，冰浴条件下滴加含有133mg的2,4-二硝基苯磺酰氯(0.5mmol)的二氯甲烷溶液2mL，滴加完毕后，于冰浴条件下搅拌30min，移走冰浴，室温下搅拌1h；反应结束后，将反应液分别用饱和食盐水和水洗涤后，收集有机相并将有机相干燥除水，旋蒸除去溶剂得到残渣，将残渣进行柱层析，得到近红外目标化合物B，收率87％。
制备得到的目标化合物B的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.18(d,J＝2.3Hz,1H),8.62(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),8.28(d,J＝8.7Hz,1H),7.76(d,J＝9.1Hz,1H),7.05(d,J＝16.0Hz,1H),6.95(d,J＝16.0Hz,1H),6.76(dd,J＝9.1,2.4Hz,1H),6.69(s,1H),6.42(d,J＝2.4Hz,1H),3.37(q,J＝7.0Hz,4H),2.56(s,2H),2.26(s,2H),1.07(t,J＝7.0Hz,6H),0.97(s,6H).
13C NMR(101MHz,DMSO)δ156.26,151.96,150.03,149.11,148.55,134.08,131.64,129.94,129.22,127.96,126.96,122.03,121.21,115.42,114.60,113.75,112.14,105.14,75.29,44.56,42.62,38.59,31.98,27.82,12.76.
C29H29N5NaO7S+(M+Na+)m/z 614.1680，found 614.1666。
1H-NMR图谱、13C-NMR图谱和高分辨质谱图谱表征分别如图1、图2和图3所示。
实施例2
本实施例的目标化合物B的合成路线同实施例1。
具体包括如下步骤：
(1)将276mg异氟尔酮(2mmol)和330mg丙二腈(5mmol)滴加到20mL乙腈中，磁力搅拌下，滴加3滴哌啶，加热回流8h，冷却至室温，析出固体，抽滤收集滤饼，将滤饼用无水乙醇重结晶，得到淡黄色片状固体中间体I，收率为89％。
(2)取186mg的中间体I(1mmol)溶解到15mL乙腈中，加入193mg的4-(N,N-二乙基)水杨醛(1mmol)，磁力搅拌下，滴加3滴哌啶，加热回流6h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂得到残渣，将残渣进行柱层析，得到化合物A，收率43％。
(3)取182mg化合物A(0.5mmol)溶解到10mL二氯甲烷中，加入138μL三乙胺(1mmol)，磁力搅拌，冰浴条件下滴加含有200mg的2,4-二硝基苯磺酰氯(0.75mmol)的二氯甲烷溶液2mL，滴加完毕后，于冰浴条件下搅拌30min，移走冰浴，室温下搅拌1h；反应结束后，将反应液分别用饱和食盐水和水洗涤后，收集有机相并将有机相干燥除水，旋蒸除去溶剂得到残渣，将残渣进行柱层析，得到近红外目标化合物B，收率89％。
制备得到的目标化合物B的1H-NMR图谱、13C-NMR图谱和高分辨质谱图谱与实施例1一致。
实施例3
本实施例以实施例1制备得到的目标化合物B作为探针用于检测不同浓度的生物硫醇。
将实施例1制备得到的目标化合物B溶解于二甲基亚砜中，配制成浓度为10mM的储备液。取储备液3μL置于5mL的离心管中，加入不同浓度的Cys，然后用乙醇-PBS(v:v＝1：1，pH＝7.4，10mM)调整至总体积至3mL，混合均匀后室温放置10min，得到系列加入不同浓度Cys的待测液。其中，加入不同浓度的Cys待测液中，Cys的浓度分别为：0μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM。
采用紫外分光光度计测定紫外吸收光谱，结果如图4所示。从图4中可知，随着Cys的浓度的增加，最大吸收发生明显的红移。
实施例4
本实施例参考实施例3中待测液的配制方法，采用荧光分光光度计测定不同浓度Cys待测液的荧光光谱图，激发波长为565nm，测试结果如图5所示。从图5可知，未加入Cys时，目标化合物B在565nm波长激发下，在665nm无荧光发射，但是加入Cys后，665nm处荧光强度显著增加，并随Cys浓度增加而荧光强度增强。说明了本发明的目标化合物B可以作为探针对Cys进行检测。
实施例5
本实施例参考实施例3的检测方法，区别仅在于：将Cys替换为Hcy。目标化合物B作为探针随Hcy浓度变化的紫外吸收光谱图如图6所示。其中，Hcy的浓度分别为：0μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM。
实施例6
本实施例参考实施例4的检测方法，区别仅在于：将Cys替换为Hcy。目标化合物B作为探针随Hcy浓度变化的荧光光谱图如图7所示。其中，Hcy的浓度分别为：0μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM。
实施例7
本实施例参考实施例3的检测方法，区别仅在于：将Cys替换为GSH。目标化合物B作为探针随GSH浓度变化的紫外吸收光谱图如图8所示。其中，GSH的浓度分别为：0μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM。
实施例8
本实施例参考实施例4的检测方法，区别仅在于：将Cys替换为GSH。目标化合物B作为探针随GSH浓度变化的荧光光谱图如图9所示。其中，GSH的浓度分别为：0μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM。
实施例9
将实施例1制备得到的目标化合物B溶解于二甲基亚砜中，配制成浓度为10mM的储备液。取储备液3μL置于5mL的离心管中，加入不同当量的Cys，然后用乙醇-PBS(v:v＝1：1，pH＝7.4，10mM)调整至总体积至3mL，配制两份，分别加入0当量和5当量的Cys，混合均匀室温孵育10min。0当量的样品颜色没有任何变化，加入5当量的Cys的样品由粉红色变成蓝色。在紫外灯下(365nm)，0当量的样品几乎没有荧光发射，加入5当量的样品发出强烈的红的荧光。Hcy和GSH结果与Cys相同。
结果表明，目标化合物B作为探针检测生物硫醇具有紫外和荧光双响应，并且可以通过裸眼观测颜色变化来分析生物硫醇。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (23)

1.一种化合物，其特征在于，结构式如下：
Figure 470634DEST_PATH_IMAGE001
。
2.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：化合物A与2,4-二硝基苯磺酰氯反应得到目标化合物；
其中，所述化合物A的结构式为
Figure 250371DEST_PATH_IMAGE002
。
3.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于，在缚酸剂作用下，所述化合物A与2,4-二硝基苯磺酰氯反应得到所述目标化合物。
4.根据权利要求3所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述缚酸剂为三乙胺。
5.根据权利要求4所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述三乙胺的摩尔用量为所述化合物A的1-5倍。
6.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物A与2,4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1﹕（1-2）。
7.根据权利要求3-6任一项所述的化合物的制备方法，其特征在于，在冰浴条件下搅拌反应0.5-1h，室温条件下搅拌反应0.5-2h，得到所述目标化合物。
8.根据权利要求7所述的化合物的制备方法，其特征在于，反应结束后，洗涤反应液，收集有机相并除去溶剂得到残渣，柱层析分离得到目标化合物。
9.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物A的制备方法包括：中间体I与4-（N,N-二乙基）水杨醛混合于溶剂中，在催化剂的催化作用下，加热回流反应，得到所述化合物A；
其中，所述中间体I的结构式为
Figure 583264DEST_PATH_IMAGE003
。
10.根据权利要求9所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述催化剂为哌啶和醋酸中的一种或两种。
11.根据权利要求9所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述加热回流反应的时间为4-8h。
12.根据权利要求9所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述中间体I与所述4-（N,N-二乙基）水杨醛的摩尔比为1﹕（1-1.5）。
13.根据权利要求12所述的化合物的制备方法，其特征在于，制备化合物A时采用的所述溶剂为无水乙醇和乙腈中的任一种。
14.根据权利要求12所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物A的制备方法中，反应结束后，除去溶剂得到残渣，柱层析分离得到化合物A。
15.根据权利要求9所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述中间体I的制备方法包括：异氟尔酮与丙二腈混合于溶剂中，在哌啶的催化作用下，加热回流反应，得到所述中间体I。
16.根据权利要求15所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述中间体I的制备方法中，所述加热回流反应的时间为6-18h。
17.根据权利要求15所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述异氟尔酮与所述丙二腈的摩尔比为1﹕（2-5）。
18.根据权利要求17所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述异氟尔酮与所述丙二腈的摩尔比为1﹕（2-3）。
19.根据权利要求17所述的化合物的制备方法，其特征在于，制备中间体I时采用的所述溶剂为无水乙醇、甲苯和乙腈中的任一种。
20.根据权利要求17所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述中间体I的制备方法中，反应结束后，冷却，过滤收集沉淀，采用乙醇对沉淀重结晶，得到所述中间体I。
21.权利要求1所述的化合物在制备用于检测硫醇的荧光探针中的应用。
22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述硫醇为生物硫醇。
23.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述生物硫醇为半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽中的任一种。
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