CN112920157A - 一种苯偶连苯并吡喃衍生物及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种苯偶连苯并吡喃衍生物及其合成方法和应用；所述衍生物的中文名称为10‑(二乙氨基)‑3‑((二甲基氨基甲硫酰基)氧基)‑5,6‑二氢苯并[c]黄嘌呤‑12‑鎓，英文名称为10‑(diethylamino)‑3‑((dimethylcarbamothioyl)oxy)‑5,6‑dihydrobenzo[c]xanthen‑12‑onium，命名为DDO；本发明提供的一种苯偶连苯并吡喃衍生物在检测次氯酸中的应用，是在纯PBS溶液中，通过紫外可见分光光度计和荧光分光光度计定量检测次氯酸的含量。该检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确度高。该方法不仅在细胞水平实现了对次氯酸的检测，还在活体水平即在斑马鱼和小鼠中实现了对次氯酸的超快速响应。

Description

一种苯偶连苯并吡喃衍生物及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及苯偶连苯并吡喃和次氯酸检测，具体属于一种苯偶连苯并吡喃衍生物及其合成方法和次氯酸检测中的应用。
背景技术
众所周知，线粒体是细胞中产生活性氧的场所，线粒体作为真核细胞内重要而有趣的细胞器，在各种生理过程中起着关键作用。活性氧是氧代谢的副产物，并已被大量证明是重要的细胞内信号分子，与生理和病理过程密切相关。次氯酸在我们的日常生活中被广泛使用，例如家用漂白剂，公共供水的消毒剂和抗菌剂。在各种活性氧中，次氯酸作为生物体内活性氧的重要小分子之一，在生物免疫系统中起着重要作用。研究表明，当体内次氯酸浓度过高时，会造成生物组织不同程度的损伤，从而引发许多炎症相关疾病，包括动脉粥样硬化，人类红细胞损害，神经元变性，类风湿关节炎和癌症。因此，能够准确检测次氯酸的浓度大小对揭示其引发的生理和病理过程具有非常重要的意义。
针对以上存在的问题，设计选择性好、灵敏度高、响应速度快、具有低细胞毒性的荧光探针用于区分检测活细胞内次氯酸水平变化，已成为当前生物医学发展中具有挑战性的前沿课题之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苯偶连苯并吡喃衍生物及其合成方法，以及该衍生物在检测次氯酸中的应用；该检测方法简便、灵敏、快速，检测结果准确度高。
本发明提供的一种苯偶连苯并吡喃衍生物，其中文名称为10-(二乙氨基)-3-((二甲基氨基甲硫酰基)氧基)-5,6-二氢苯并[c]黄嘌呤-12-鎓，英文名称为10-(diethylamino)-3-((dimethylcarbamothioyl)oxy)-5,6-dihydrobenzo[c]xanthen-12-onium，命名为DDO结构式为：
Figure BDA0002930534560000011
本发明提供的一种苯偶连苯并吡喃衍生物的合成方法，步骤如下：
(1)按摩尔比1:1将4-二乙基氨基水杨醛和6-羟基-1-四氢萘酮溶于高氯酸和冰乙酸的混合体系中，回流1.5小时；冷却至室温后，将溶液倒入体积比为1:1的乙酸乙酯和石油醚的混合物中，过滤沉淀物并用无水乙醇洗涤，然后真空干燥，得到纯的深紫色固体化合物即10-(二乙氨基)-3-羟基-5,6-二氢苯并[c]黄嘌呤-12-鎓；
(2)按摩尔比1:1.2将10-(二乙氨基)-3-羟基-5,6-二氢苯并[c]黄嘌呤-12-鎓溶于二氯甲烷中，逐滴加入三乙胺，冰浴搅拌；随后，加入二甲基氨基甲硫酰氯室温搅拌10h；反应结束后，将溶剂通过旋转蒸发器旋干；混合物通过旋转蒸发仪除去溶剂得到粗产物；粗产物通过甲醇和二氯体积比为1:40柱色谱纯化，得到深紫色化合物，即10-(二乙氨基)-3-((二甲基氨基甲硫酰基)氧基)-5,6-二氢苯并[c]黄嘌呤-12-鎓。
所述苯偶连苯并吡喃衍生物DDO可用于对次氯酸的检测。
本发明提供的一种检测次氯酸的方法，步骤为：
(1)、配制pH＝7.4，10mM的PBS缓冲溶液，用次氯酸配制20mM的次氯酸水溶液，将苯偶连苯并吡喃衍生物DDO溶于DMSO配制成2mM的溶液；
(2)、取2mL的PBS溶液、10μL DDO的DMSO溶液先加到8个比色皿中，接下来，分别向比色皿加入次氯酸溶液的体积为0、1、2、4、6、8、10、12μL；然后分别测试它们的吸光度，随着次氯酸含量比例增加，对应在567nm处的吸光度值降低；
(2)、取2mL的PBS溶液、10μL DDO的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，用激发波长为567nm在荧光分光光度仪上检测，623nm处的有微弱的荧光强度，之后再加入1μL的次氯酸溶液，荧光强度增强；接下来分别测试在加入2、3、4、5、6、7、8、9μL……的次氯酸后体系荧光强度值的方法同上；随着次氯酸的加入，623nm处的荧光强度明显增强；
(4)、在8个比色皿中，各加入2mL的PBS溶液、10μL DDO的DMSO溶液，接下来，分别向比色皿加入次氯酸溶液的体积为2、4、6、8、10、13、16、19μL，次氯酸在该体系中浓度分别为20、40、60、80、100、130、160、190μM，然后在荧光光谱仪上测定623nm处的荧光强度值为181.5、224.7、289.4、328、372.1、415.7、480、541.8；以次氯酸浓度为横坐标，以荧光强度值为纵坐标绘制图，得到次氯酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：F＝162.53+1.955c，c的单位为10-6mol/L。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
1、本发明苯偶连苯并吡喃衍生物合成简单，成本低廉；
2、本发明检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现；
3、本发明苯偶连苯并吡喃衍生物DDO作为近红外荧光探针能实现对次氯酸的动态检测，显示了高的灵敏性和极好的选择性；
4、本发明检测信号明显，为近红外荧光信号；
5、本发明DDO不仅可在细胞水平实现对次氯酸的检测，还可在动物活体水平如斑马鱼和小鼠中实现对次氯酸的超快速响应。
附图说明
图1实施例1制备的DDO的核磁氢谱图
图2实施例1制备的DDO的核磁碳谱图
图3实施例1制备的DDO的质谱图
图4实施例2DDO与不同浓度次氯酸的混合溶液的紫外光谱图
图5实施例3DDO与不同浓度次氯酸的混合溶液的荧光发射图
图6实施例4DDO与各种分析物的荧光发射图
图7实施例5DDO与次氯酸的响应时间
图8实施例6测定次氯酸的工作曲线
图9实施例7DDO在Hela细胞中成像图
图10实施例8DDO在HL-7702细胞中成像图
图11实施例9DDO在Hela细胞中共定位图
图12实施例10DDO在Hela细胞中内源外源次氯酸成像图
图13实施例11DDO在斑马鱼中成像图
图14实施例12DDO在小鼠体内成像图
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1
DDO的制备和表征
(1)在100mL的圆底烧瓶中，将4-二乙氨基水杨醛(1.93g，10mmol)，6-羟基-1-四氢萘酮(1.62g，10mmol)和高氯酸(3mL)溶解在乙酸(20mL)中并将混合物回流1.5小时。冷却至室温后，将溶液倒入乙酸乙酯(15mL)和石油醚(15mL)的混合物中。过滤沉淀物并用乙醇洗涤，然后真空干燥，得到纯的深紫色固体化合物1(2.88g，产率：90％)。
(2)化合物1(0.960g，3mmol)溶于20mL二氯甲烷中，三乙胺(400μL)逐滴加入，冰浴搅拌15min。随后，加入二甲基氨基甲硫酰氯(0.442g，3.6mmol)室温搅拌10h。反应结束后，将溶剂通过旋转蒸发器旋干。用甲醇：二氯甲烷＝1:40过柱，得到深紫色固体DDO(0.280g，产率：23％)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.78(s,1H),8.27(s,1H),8.01(s,1H),7.53(s,1H),7.42–7.21(m,3H),3.71(s,4H),3.07(s,4H),1.24(s,12H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ185.68,161.92,158.91,158.35,156.12,149.25,143.77,132.55,127.28,124.26,123.75,123.08,121.52,119.59,119.06,96.14,46.03,43.35,39.94,39.23,26.53,24.80,12.83。
实施例2
配制纯PBS的体系溶液，配制20mM的次氯酸溶液，将DDO溶于DMSO配制成2mM的溶液；分别取2mL的PBS溶液、10μL DDO的DMSO溶液加到2mL的EP管中，向不同的EP管加入0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16μL……的次氯酸。将混合溶液转移到荧光比色皿中，在紫外可见光吸光光度计上检测混合液的吸光度变化。随着次氯酸加入浓度的不同，567nm处的吸光度逐渐降低。紫外吸收图见图4。
实施例3
配制纯PBS的体系溶液，配制20mM的次氯酸溶液，将DDO溶于DMSO配制成2mM的溶液；取2mL的PBS溶液、10μL DDO的DMSO溶液分别加到不同的EP管中，再向不同的EP管依次加入0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16μL……然后将混合溶液混匀后转移至荧光比色皿中，在激发波长为567nm下的荧光分光光度仪上检测，随着次氯酸浓度的增加，623nm处的荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图5。
实施例4
配制纯PBS的体系溶液，配制20mM的次氯酸溶液，将DDO溶于DMSO配制成2mM的溶液；取2mL的PBS溶液溶液、10μL DDO的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，然后取浓度为20mM的NO3 -溶液50μL于荧光比色皿中，在激发波长为567nm下的荧光分光光度仪上检测其荧光强度值。测试其他分析物(I-、S2-、S2O3 2-、Br-、Cl-、F-、NO2 -、CH3COO-、OH·、1O2、ONOO-、Cys、Glycine、GSH、H2O2、Hcy、Cystine、L-Glutamate、L-Lysine、L-Proline、SO4 2-、SNP、TBHP、HClO)在激发波长567nm下的荧光强度值时步骤同上。次氯酸使得检测体系在623nm处荧光强度明显增强，其它的分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。绘制不同分析物对应的623nm处荧光强度值的柱状图(见图6)
实施例5
配制纯PBS的体系溶液，配制20mM的次氯酸溶液，将DDO溶于DMSO配制成2mM的溶液；在荧光比色皿中，加入2mL的PBS溶液、10μL DDO的DMSO溶液，然后将荧光比色皿置于荧光分光光度仪上测其在567nm下的发射波长，紧接着加入50μL的次氯酸溶液继续在荧光分光光度仪上测其567nm下的发射波长。然后将此过程在623nm处的荧光强度值绘制成趋势图。(见图7)
实施例6
配制纯PBS的体系溶液，配制20mM的次氯酸溶液，将DDO溶于DMSO配制成2mM的溶液；在8个比色皿中，各加入2mL的PBS溶液、10μL DDO的DMSO溶液，接下来，分别向比色皿加入次氯酸溶液的体积为2、4、6、8、10、13、16、19μL，次氯酸在该体系中浓度分别为20、40、60、80、100、130、160、190μM，然后在荧光光谱仪上测定623nm处荧光强度的值为181.5、224.7、289.4、328、372.1、415.7、480、541.8。以次氯酸浓度为横坐标，以荧光强度值为纵坐标绘制图，得到次氯酸浓度的工作曲线(见图8)；线性回归方程为：F＝162.53+1.955c，c的单位为10-6mol/L；
实施例7
配制纯PBS的体系溶液，配制20mM的次氯酸溶液，将DDO溶于DMSO配制成2mM的溶液；把10μL DDO的DMSO溶液加入到2mL的PBS溶液中使得其浓度为10μM，备用；用PBS将细胞洗三次，将探针溶液加入Hela细胞的培养皿中，放到激光共聚焦显微镜下成像。随着时间的增加，体系在荧光成像仪下逐渐出现红色的荧光。见图9。
实施例8
配制纯PBS的体系溶液，配制20mM的次氯酸溶液，将DDO溶于DMSO配制成2mM的溶液；把10μL DDO的DMSO溶液加入到2mL的PBS溶液中使得其浓度为10μM，备用；用PBS将细胞洗三次，将探针溶液加入HL-7702细胞的培养皿中，放到激光共聚焦显微镜下成像。随着时间的增加，体系在荧光成像仪下逐渐出现红色的荧光。见图10。
实施例9
配制纯PBS的体系溶液，配制20mM的次氯酸溶液，将DDO溶于DMSO配制成2mM的溶液，将市售的线粒体绿染料配制成2mL 500μM的溶液；把10μL DDO的DMSO溶液加入到2mL的PBS溶液中使得其浓度为10μM，备用；用PBS将细胞洗三次，将500μM线粒体绿染料溶液加入HL-7702细胞的培养皿中，在37℃下，孵育20min。之后用PBS将细胞洗三次，再将10μM的DDO的DMSO溶液加入细胞培养皿中，在37℃下，孵育20min。之后用PBS洗三次，再加入2mL的PBS，放到激光共聚焦显微镜下成像。观察红色通道和绿色通道的共定位效果，见图11。
实施例10
配制纯PBS的体系溶液，配制20mM的次氯酸溶液，将DDO溶于DMSO配制成2mM的溶液；将市售的脂多糖配制成2mL 50μg/mL；把10μL DDO的DMSO溶液加入到2mL的PBS溶液中使得其浓度为10μM；把3μL的次氯酸溶液倒入2mL的PBS溶液中使得其浓度为30μM；备用；用PBS将细胞洗三次，将10μM探针溶液加入Hela细胞的培养皿中，在37℃下，孵育20min。之后用PBS将细胞洗三次，再加入外源的次氯酸，使其浓度为30μM，加入Hela细胞的培养皿中，在37℃下，孵育20min。之后用PBS洗三次，再加入2mL的PBS，放到激光共聚焦显微镜下成像。同时，我们可以通过浓度为50μg/mL脂多糖对细胞的刺激使次氯酸释放从而产生内源次氯酸。将10μM探针溶液加入Hela细胞的培养皿中，在37℃下，孵育20min。之后用PBS将细胞洗三次，再加入50μg/mL脂多糖，在37℃下，孵育15min。之后用PBS洗三次，再加入2mL的PBS，放到激光共聚焦显微镜下成像。见图12。
实施例11
配制纯PBS的体系溶液，配制20mM的次氯酸溶液，将DDO溶于DMSO配制成2mM的溶液；将市售的脂多糖配制成2mL50μg/mL；把10μL DDO的DMSO溶液加入到2mL的PBS溶液中使得其浓度为10μM；把3μL的次氯酸溶液倒入2mL的PBS溶液中使得其浓度为30μM；备用；用10μM的DDO溶液在29℃下，孵育三天大的斑马鱼20min，之后将斑马鱼麻醉，PBS冲洗之后，加入2-3滴PBS放到激光共聚焦显微镜下成像。接下来，用10μM的DDO溶液在29℃下，孵育三天大的斑马鱼20min，然后转移至浓度为30μM的外源次氯酸中继续孵育20min，之后将斑马鱼麻醉，PBS冲洗之后，加入2-3滴PBS放到激光共聚焦显微镜下成像。同时，我们可以通过浓度为50μg/mL脂多糖对斑马鱼的刺激使次氯酸释放从而产生内源次氯酸。用10μM的DDO溶液在29℃下，孵育三天大的斑马鱼20min，然后转移至浓度为50μg/mL脂多糖中继续孵育20min，之后将斑马鱼麻醉，PBS冲洗之后，加入2-3滴PBS放到激光共聚焦显微镜下成像。见图13。
实施例12
配制2mM的次氯酸水溶液，将DDO溶于DMSO配制成2mM的溶液；先将培养一周大的裸鼠麻醉，然后向裸鼠皮下注射30μM的DDO溶液，放入活体成像仪中成像；接下来再向原部位皮下注射40μM的次氯酸溶液，放入活体成像仪中成像。见图14。

Claims (6)

1.一种苯偶连苯并吡喃衍生物DDO，其特征在于，结构式为：
Figure FDA0002930534550000011
2.如权利要求1所述的一种苯偶连苯并吡喃衍生物DDO的合成方法，其特征在于，步骤如下：
(1)、按摩尔比1:1将4-二乙基氨基水杨醛和6-羟基-1-四氢萘酮溶于高氯酸和冰乙酸的混合体系中，回流1.5小时；冷却至室温后，将溶液倒入体积比为1:1的乙酸乙酯和石油醚的混合物中，过滤沉淀物并用无水乙醇洗涤，然后真空干燥，得到纯的深紫色固体化合物即10-(二乙氨基)-3-羟基-5,6-二氢苯并[c]黄嘌呤-12-鎓；
(2)、按摩尔比1:1.2将10-(二乙氨基)-3-羟基-5,6-二氢苯并[c]黄嘌呤-12-鎓溶于二氯甲烷中，逐滴加入三乙胺，冰浴搅拌；随后，加入二甲基氨基甲硫酰氯室温搅拌10h；反应结束后，将溶剂通过旋转蒸发器旋干；混合物通过旋转蒸发仪除去溶剂得到粗产物；粗产物通过甲醇和二氯体积比为1:40柱色谱纯化，得到深紫色化合物，即10-(二乙氨基)-3-((二甲基氨基甲硫酰基)氧基)-5,6-二氢苯并[c]黄嘌呤-12-鎓。
3.如权利要求1所述的一种苯偶连苯并吡喃衍生物DDO在制备次氯酸检测试剂中的应用。
4.一种检测次氯酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、配制pH＝7.4，10mM的PBS缓冲溶液，用次氯酸配制20mM的次氯酸水溶液，将苯偶连苯并吡喃衍生物DDO溶于DMSO配制成2mM的溶液；
(2)、取2mL的PBS溶液、10μL DDO的DMSO溶液先加到8个比色皿中，接下来，分别向比色皿加入次氯酸溶液的体积为0、1、2、4、6、8、10、12μL；然后分别测试它们的吸光度，随着次氯酸含量比例增加，对应在567nm处的吸光度值降低；
(2)、取2mL的PBS溶液、10μL DDO的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，用激发波长为567nm在荧光分光光度仪上检测，623nm处的有微弱的荧光强度，之后再加入1μL的次氯酸溶液，荧光强度增强；接下来分别测试在加入2、3、4、5、6、7、8、9μL……的次氯酸后体系荧光强度值的方法同上；随着次氯酸的加入，623nm处的荧光强度明显增强；
(4)、在8个比色皿中，各加入2mL的PBS溶液、10μL DDO的DMSO溶液，接下来，分别向比色皿加入次氯酸溶液的体积为2、4、6、8、10、13、16、19μL，次氯酸在该体系中浓度分别为20、40、60、80、100、130、160、190μM，然后在荧光光谱仪上测定623nm处的荧光强度值为181.5、224.7、289.4、328、372.1、415.7、480、541.8；以次氯酸浓度为横坐标，以荧光强度值为纵坐标绘制图，得到次氯酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：F＝162.53+1.955c，c的单位为10-6mol/L。
5.如权利要求1所述的苯偶连苯并吡喃衍生物DDO在制备细胞成像试剂中的应用。
6.如权利要求1所述的苯偶连苯并吡喃衍生物DDO在制备动物活体成像试剂中的应用。
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