CN113999219B

CN113999219B - 一种双位点荧光探针及其合成方法和应用

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Publication number: CN113999219B
Application number: CN202111421951.2A
Authority: CN
Inventors: 张萌; 李新峰; 张永斌; 钞建宾; 双少敏
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2021-11-26
Filing date: 2021-11-26
Publication date: 2023-03-07
Anticipated expiration: 2041-11-26
Also published as: CN113999219A

Abstract

本发明提供了一种双位点荧光探针及其合成方法和应用，所述的探针是7‑(二乙氨基)‑3‑[3‑(5‑甲氧基‑2‑(7‑硝基苯并恶二唑‑4‑氧基)‑苯基)‑3‑氧代‑1‑丙烯基]香豆素。其制备方法：将7‑(二乙氨基)‑3‑[3‑(2‑羟基‑5‑甲氧基苯基)‑3‑氧代‑1‑丙烯基]香豆素和NBD‑Cl溶于二氯甲烷中，加入三乙胺，室温反应；反应结束后，用二氯甲烷:石油醚＝60:1进行柱层析纯化；最后用无水乙醇洗涤，得到橘红色固体。该探针与Cys/Hcy和SO₂发生反应从而引起荧光信号的变化，可提供一种直接检测并区分Cys/Hcy和SO₂的便捷方法。该探针具有优异的选择性，其对Cys/Hcy和SO₂检测限分别为0.25μM、0.14μM和0.05μM，并表现出良好的响应速度。通过结合激光共聚焦扫描显微技术，该探针成功应用于细胞和斑马鱼中Cys/Hcy和SO₂的成像。

Description

一种双位点荧光探针及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及荧光探针，具体属于一种双位点荧光探针的合成，以及该探针应用于生物样品中Cys/Hcy和SO₂的检测。

背景技术

半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)在维持生物体内氧化还原稳态方面起着至关重要的作用。通常，细胞硫醇水平的变化与许多疾病有关，例如白细胞减少、牛皮癣、肝损伤、癌症和艾滋病等。其中，半胱氨酸属于合成蛋白质的20种天然氨基酸之一，是一种含巯基的非必需氨基酸，正常细胞内半胱氨酸浓度是30-200μM。半胱氨酸的浓度异常会引起生长缓慢、神经性病变、肝损伤、嗜睡、水肿等疾病，与硫化氢结合的半胱氨酸在缺氧条件下可调节神经血管。同型半胱氨酸是氨基酸半胱氨酸的异种，是蛋氨酸代谢过程中的重要中间产物，血清中同型半胱氨酸的正常浓度大约是5-12μM，同型半胱氨酸是人体内含硫氨基酸的重要代谢中间体，可能是动脉粥样硬化等心血管疾病的独立危险因素。同型半胱氨酸的水平异常会导致心血管疾病、精神障碍、阿尔兹海默症、妊娠并发症等。二氧化硫是一种重要的气态信号分子，以HSO₃ ^-/SO₃ ^2-动态平衡的形式存在于活细胞中，与心血管结构和功能的调节以及抗氧化作用密切相关。研究证实，二氧化硫具有调节血管、降压、抗炎等多种功能。因此，设计一种可以识别生物样品中Cys/Hcy和SO₂的荧光探针具有十分重要的意义。

目前国内外已经报道了几种仪器检测Cys/Hcy和SO₂的方法，例如高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法、质谱法(MS)、电化学分析法和表面增强拉曼光谱法等，这些传统的仪器检测方法虽然可以有效的检测，但大多存在工程复杂，用时长，消费高，不能实时监测等缺点，不适合高通量的常规临床研究项目。荧光探针又称为荧光传感器，是由荧光信号和分子识别所构建的功能性有机分子。随着荧光探针的发展，荧光探针在生物学方面有着重要的应用，且用于生物或环境中一些重要的阳离子、阴离子、中性小分子的荧光探针得到了很好的发展，由于荧光探针本身具有快速响应、灵敏度高、选择性好、低毒性、实时成像等优点，使得荧光探针广泛地应用于检测。因此，开发用于生物活性硫检测的探针具有重大的意义，也具有广阔的应用前景。香豆素衍生物具有良好的溶解性、光稳定性和较大的斯托克斯位移，因此，它们通常用作荧光团。本发明设计了一种香豆素衍生物荧光探针，该荧光探针用于Cys/Hcy和SO₂的检测，反应灵敏且具有高度选择性。该荧光探针还可用于生物样品中Cys/Hcy和SO₂的检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种双位点荧光探针及其制备方法。目的之二是提供探针的用途，即用于生物样品中Cys/Hcy和SO₂检测及成像。该探针应具有灵敏度高、选择性高、检出限低和光稳定性好等优点。

本发明提供的一种双位点荧光探针，其是7-(二乙氨基)-3-[3-(5-甲氧基-2-(7-硝基苯并恶二唑-4-氧基)-苯基)-3-氧代-1-丙烯基]香豆素，结构式为：

本发明提供的一种双位点荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)在反应容器中按摩尔比1:1-1.5加入7-(二乙氨基)-3-[3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]香豆素和NBD-Cl，加入二氯甲烷溶液溶解后，加入催化剂三乙胺，常温条件下搅拌10小时，溶液由红色变为黑色；

(2)TLC跟踪反应，确定反应结束后，旋干二氯甲烷，用二氯甲烷:石油醚＝50-60:1进行柱层析纯化；用无水乙醇洗涤，干燥，即得到橘红色固体产物。

进一步优选：步骤(1)中所述的7-(二乙氨基)-3-[3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]香豆素和NBD-Cl的按摩尔比1:1.5。步骤(2)中所述的二氯甲烷:石油醚＝60:1。

其合成路线如下：

本发明提供的一种定量荧光检测Cys/Hcy和SO₂的方法，其步骤为：

(1)用THF配制2mM的荧光探针储备液；

(2)将2.0mL PBS缓冲液/DMSO(8/2,v/v，pH 7.40)体系以及10.0μL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上进行检测。探针本身无荧光，随着Cys/Hcy的加入，540nm处的荧光逐渐增强；随着SO₃ ^2-的加入，590nm处的荧光逐渐增强；

(3)以Cys/Hcy的浓度为横坐标，以540nm处的荧光强度为纵坐标绘制图，得到Cys/Hcy浓度的工作曲线，线性回归方程分别为：F＝6.8096*[Cys]+165.8280、F＝12.1531*[Hcy]+235.1302,Cys/Hcy浓度的单位为10^-6mol/L；线性相关系数分别为R²＝0.9997、R²＝0.9945，线性响应范围为0μM-150μM，检出限(LOD)分别为0.25μM、0.14μM；

以SO₃ ^2-浓度为横坐标，以590nm处的荧光强度为纵坐标绘制图，得到SO₃ ^2-浓度的工作曲线，线性回归方程为：F＝34.1188*[SO₃ ^2-]+53.8964，SO₃ ^2-浓度的单位为10^-6mol/L；线性相关系数为R²＝0.9945，线性响应范围为5μM-35μM，检出限(LOD)为0.05μM。

经实验验证，常见阴离子、阳离子和氨基酸均不干扰体系对Cys/Hcy和SO₂的测定。

本发明的荧光探针通过结合荧光共聚焦显微镜成像技术，证明了可用于检测生物样品中如细胞以及斑马鱼内的Cys/Hcy和SO₂。

与现有荧光探针相比，本发明合成的荧光探针具有以下优点：1、本发明的荧光探针合成步骤简单，成本低廉且光稳定性好。2、检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现。3、探针对Cys/Hcy和SO₂的响应具有选择性好、灵敏度高、检出限低等优点。4、该探针可通过双位点对Cys/Hcy和SO₂进行检测和区分。5、该探针可用于生物样品中如细胞以及斑马鱼内Cys/Hcy和SO₂的检测。

附图说明

图1本发明荧光探针随Cys/Hcy和SO₂变化的荧光滴定图

图2本发明荧光探针对Cys/Hcy和SO₂响应的工作曲线

图3本发明荧光探针对常见阴离子、阳离子以及氨基酸的响应情况

图4本发明荧光探针对人肝癌细胞(HepG2)的成像图

图5本发明荧光探针对斑马鱼的成像图

具体实施方式

实施例1荧光探针的制备

(1)7-(二乙氨基)香豆素-3-甲醛的合成

在冰浴下，将POCl₃(0.40mL，4.2mmol)缓慢加入到0.40mL无水DMF中，撤下冰浴，50℃下搅拌45min，将7-(二乙氨基)香豆素(0.65g，3mmol)溶于3.00mL无水DMF中，两溶液混合，80℃下搅拌12h。反应完成后，把反应液加入到50.00mL冰水中，用氢氧化钠调节pH至7，抽滤，干燥，得到黄色固体。

(2)7-(二乙氨基)-3-[3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]香豆素的合成

将7-(二乙氨基)香豆素-3-甲醛(0.12g，0.5mmol)和2-乙酰基-4-甲氧基苯酚(0.08g,0.5mmol)溶于10.00mL乙腈中，加入催化剂哌啶(0.10mL,1mmol),反应加热回流30h，反应结束后，冷却至室温，抽滤，干燥，得到红色固体。

(3)7-(二乙氨基)-3-[3-(5-甲氧基-2-(7-硝基苯并恶二唑-4-氧基)-苯基)-3-氧代-1-丙烯基]香豆素的合成

将7-(二乙氨基)-3-[3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]香豆素(0.04g，0.1mmol)和NBD-Cl(0.03g，0.15mmol)溶于10.00mL二氯甲烷中，加入催化剂三乙胺20μL。常温下搅拌反应10h，通过TLC监测反应，反应结束后旋干二氯甲烷，用二氯甲烷：石油醚＝60：1进行柱层析纯化。用无水乙醇冲洗固体，干燥，得到橙红色固体。

荧光探针用¹H NMR表征，结果如下：

¹H NMR(600MHz,CDCl₃,δ/ppm):8.45(d,J＝8.4Hz,1H),7.73(t,J＝8.4Hz,2H),7.45(d,J＝15.6Hz,1H),7.41(d,J＝3.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.4Hz,1H),7.25(d,J＝9.0Hz,1H),7.19(dd,J＝9.0,3.0Hz,1H),6.80(s,1H),6.61(s,1H),6.54(d,J＝8.4Hz,1H),3.95(s,3H),3.48(q,J＝6.9Hz,4H),1.27(t,J＝6.9Hz,6H)

¹³C NMR(150MHz,CDCl₃,δ/ppm):189.90,159.81,158.23,156.76,154.82,152.17,145.75,144.97,144.16,144.04,140.94,133.73,133.38,130.69,130.18,124.73,123.40,119.23,115.14,114.07,109.69,108.85,107.87,97.03,55.94,45.09,12.42。

实施例2荧光探针随Cys/Hcy和SO₂浓度变化的荧光发射光谱

在2.0mL PBS缓冲液/DMSO(8/2,v/v，pH 7.40)的体系中加入10.0μM荧光探针储备液进行Cys/Hcy和SO₂荧光滴定实验，在荧光分光光度仪上检测，随着Cys/Hcy浓度的增加，540nm处的荧光强度逐渐增强(图1A-B)。仪器参数：激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5nm、10nm，电压为650V，荧光探针溶液的最大激发波长为λ_ex＝450nm和最大发射波长为λ_em＝540nm。以Cys/Hcy浓度为横坐标，以540nm处的荧光强度为纵坐标绘制图，得到Cys/Hcy浓度的工作曲线，线性回归方程分别为：F＝6.8096*[Cys]+165.8280、F＝12.1531*[Hcy]+235.1302,Cys/Hcy浓度的单位为10^-6mol/L；线性相关系数分别为R²＝0.9997、R²＝0.9945，线性响应范围为0μM-150μM，检出限(LOD)分别为0.25μM、0.14μM(图2A-B)。随着SO₃ ^2-浓度的增加，590nm处的荧光强度逐渐增强(图1C)。仪器参数：激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5nm、10nm，电压为650V，荧光探针溶液的最大激发波长为λ_ex＝510nm和最大发射波长为λ_em＝590nm。以SO₃ ^2-浓度为横坐标，以590nm处的荧光强度为纵坐标绘制图，得到SO₃ ^2-浓度的工作曲线，线性回归方程为：F＝34.1188*[SO₃ ^2-]+53.8964,SO₃ ^2-浓度的单位为10^-6mol/L；线性相关系数为R²＝0.9945，线性响应范围为5μM-35μM，检出限(LOD)为0.05μM(图2C)。

实施例3荧光探针对常见阴离子、阳离子以及氨基酸的响应情况

在2.0mL PBS缓冲液/DMSO(8/2,v/v，pH 7.40)的体系中加入10.0μM荧光探针储备液，再分别加入100μM小分子生物活性硫(H₂S、GSH)、阴离子(NO₃ ^-、NO₂ ^-、CO₃ ^2-、Cl^-、S₂O₃ ^2-、CH₃COO^-)、阳离子(Mg²⁺、K⁺、Na⁺、Fe²⁺、Hg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、NH₄ ⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Mn²⁺)以及氨基酸(Thr、Lea、Tyr、Glu、Ser、Asp、His、Trp、Arg、Val、Phe、Pro、Gly、Lys、Ile、Ala、Gln、Asn、Met),分别在λ_ex＝450nm和λ_ex＝510nm下，测其荧光光谱，绘制不同干扰物对应荧光强度的图。经试验验证，其它生物活性硫、阴离子、阳离子及氨基酸基本不引起荧光强度的变化。(图3)。

实施例4荧光探针对人肝癌细胞(HepG2)的成像

HepG2细胞培养在含有12％胎牛血清和1％抗生素的DEME培养基中，置于5％的CO₂培养箱里，将细胞铺在平板上并使其粘附24小时，使用前把细胞分置于多个小培养皿中。绿色通道(540±30nm)；橙色通道(590±30nm)。细胞分为五组。第一组，将培养液抽出，并用pH7.40的PBS缓冲液洗涤，然后加入含有10.0μL探针(2mM，用THF溶解)的2.0mL PBS(pH 7.40)缓冲溶液孵育，10min后抽出，再用pH 7.40的PBS缓冲液洗涤三次。第二组，将培养液抽出，并用pH 7.40的PBS缓冲液洗涤，先加入NEM(200μM)孵育30min,再加入10.0μL探针孵育10min后抽出，再用pH 7.40的PBS缓冲液洗涤三次。剩下三组，先将培养液抽出，并用pH7.40的PBS缓冲液洗涤，分别加入NEM(200μM)孵育30min，再加入10.0μL探针孵育10min，最后分别加入含有20.0μL(1×10^-2M,用蒸馏水溶解)Cys/Hcy/SO₃ ^2-的2.0mL pH 7.40的PBS缓冲溶液处理10min后抽出，再用pH 7.40的PBS缓冲液洗涤三次。最后，在五组细胞中加入2.0mL pH 7.40的PBS溶液在激光共聚焦显微镜下观察。第一组，绿色通道和橙色通道均有微弱的荧光(图4A)。第二组，绿色通道和橙色通道均无荧光(图4B)。第三组和第四组，绿色通道均出现较强的荧光(图4C-D)。第五组的橙色通道出现明显的荧光(图4E)。经以上结果证明，该探针可用于细胞内Cys/Hcy和SO₂的成像。

实施例5荧光探针对斑马鱼的成像

将斑马鱼在28℃下，置于E3胚胎培养基(15mM NaCl,0.5mM KCl，1mM MgSO₄,1mMCaCl₂,0.15mM KH₂PO₄,0.05mM Na₂HPO₄,0.7mM NaHCO₃,5-10％亚甲基蓝，pH 7.50)中。绿色通道(540±30nm)；橙色通道(590±30nm)。将斑马鱼分为五组，分别置于五个Ep管中。第一组，用20.0μL探针(2mM，用THF溶解)孵育10min。第二组，先用200μM NEM预处理30min后，再用20.0μL探针孵育10min。剩下三组，先用200μM NEM处理30min和20.0μL探针处理10min，并分别用40.0μL Cys/Hcy/SO₃ ^2-(1×10^-2M，用蒸馏水溶解)处理10min。将斑马鱼从Ep管中吸出，麻醉后，放入小培养皿中，并加入pH 7.40的PBS溶液，在激光共聚焦显微镜下观察。第一组，观察到绿色通道和橙色通道均有微弱的荧光(图5A)。第二组，两个通道均无荧光(图5B)。第三组和第四组，均在绿色通道看到较强的荧光(图5C-D)。第五组，在橙色通道看到较强的荧光(图5E)。以上现象都与细胞实验结果一致，说明该探针具有体内成像的能力，并且可以在体内对Cys/Hcy和SO₂进行检测和区分。

Claims

1.一种双位点荧光探针，其特征在于，其结构式为：

2.如权利要求1所述的一种双位点荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的一种双位点荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的7-(二乙氨基)-3-[3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]香豆素和NBD-Cl的按摩尔比1:1.5。

4.如权利要求2所述的一种双位点荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的二氯甲烷:石油醚＝60:1。

5.一种定量荧光检测Cys/Hcy和SO₂的方法，其特征在于，步骤为：

(1)用THF配制2mM的权利要求1所述的荧光探针储备液；

(2)将2.0mL的pH 7.40、体积比8/2的PBS缓冲液/DMSO体系以及10.0μL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上进行检测，探针本身无荧光，随着Cys/Hcy的加入，540nm处的荧光逐渐增强；随着SO₃ ^2-的加入，590nm处的荧光逐渐增强；

(3)以Cys/Hcy的浓度为横坐标，以540nm处的荧光强度为纵坐标绘制图，得到Cys/Hcy浓度的工作曲线，线性回归方程分别为：F＝6.8096*[Cys]+165.8280、F＝12.1531*[Hcy]+235.1302,Cys/Hcy浓度的单位为10^-6mol/L；线性相关系数分别为R²＝0.9997、R²＝0.9945，线性响应范围为0μM-150μM，检出限(LOD)分别为0.25μM、0.14μM；以SO₃ ^2-浓度为横坐标，以590nm处的荧光强度为纵坐标绘制图，得到SO₃ ^2-浓度的工作曲线，线性回归方程为：F＝34.1188*[SO₃ ^2-]+53.8964，SO₃ ^2-浓度的单位为10^-6mol/L；线性相关系数为R²＝0.9945，线性响应范围为5μM-35μM，检出限(LOD)为0.05μM。

6.如权利要求1所述的一种双位点荧光探针在制备检测生物样品中Cys/Hcy和/或SO₂的试剂中的应用。