CN111777605B - 一种香豆素类荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于荧光分子探针领域，涉及一种香豆素类荧光探针及其制备方法与应用。本发明的制备方法包括：以7‑羟基香豆素为原料合成中间体7‑羟基‑8‑香豆素醛，再以中间体7‑羟基‑8‑香豆素醛为原料合成第二中间产物8‑(苯并[d]噻唑‑2‑基)‑7‑羟基‑2H‑苯并吡喃‑2‑酮，再与2,4‑二硝基苯磺酰氯通过取代反应合成香豆素类荧光探针。本发明提供的香豆素类荧光探针对GSH等含有巯基(－SH)的氨基酸，有专一的选择性，与其他常见氨基酸荧光信号基本没有变化，灵敏度高，检测限低。

Description

一种香豆素类荧光探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于荧光分子探针领域，涉及一种香豆素类荧光探针及其制备方法与应用，特别是涉及一种检测谷胱甘肽的香豆素类荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)是一种含巯基(-SH)的氨基酸，参与了细胞内氧化还原反应等多种信号传导过程，在生理和病理过程中都扮演着十分重要的作用。其中，GSH是最丰富的细胞内硫醇，通过充当必需的内源性氧化还原调节剂，在维持生物稳态中起着至关重要的作用。细胞谷胱甘肽水平异常可能导致各种疾病，例如肝损伤，癌症，阿尔茨海默氏病和心血管疾病。因此，有效检测或监控生物样品或环境样品中的GSH已成为近年来相关领域的研究热点。

荧光探针方面的巨大努力已致力于有效检测GSH。然而，在相同的情况下，类似的生物硫醇如半胱氨酸(Cys)和高半胱氨酸(Hys)的影响可能会影响GSH的准确性测试。因此，仍然需要具有选择性和灵敏地检测GSH的荧光探针。目前很多分析方法已被用来测定GSH，如高效液相色谱法、毛细管电泳法、紫外检测法、质谱法、荧光探针检测法等。尽管这些方法的灵敏度比较高，但都具有检测成本高、样品前处理复杂、费时，不适用于实时和现场检测等缺点。由于荧光探针在选择性、检测成本等方面具有绝对的优势，目前设计和使用荧光探针来检测半胱氨酸，引起了分析工作者的广泛关注，因此，开发一种能够高选择性、高灵敏度、快速便捷地检测GSH的方法对一些重大疾病的初期临床诊断具有十分重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种香豆素类荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针合成简单，结构新颖，应用于体外检测GSH，具有较好的选择性、灵敏性、检测限低等优点。

本发明提供了一种香豆素类荧光探针，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：

本发明还提供了一种上述香豆素类荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

S1.将7-羟基香豆素与六次甲基四胺，溶于乙酸溶剂，70～100℃温度条件下反应，反应结束后降温至70℃以下调节体系PH至2～5，乙酸乙酯萃取，乙醇重结晶得到如式(Ⅰ^’)所示结构的第一中间产物；

S2.将所述第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶剂，110～120℃温度条件下反应，反应结束后加水析出固体，过滤得到如式(Ⅱ)所示结构的第二中间产物；

S3.将所述第二中间产物和三乙胺溶于二氯甲烷溶剂，然后缓慢滴加2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，0～25℃条件下反应，反应完毕后洗涤反应得到的产物，干燥，乙醇重结晶得到所述香豆素类荧光探针。

优选的，步骤S1中7-羟基香豆素与六次甲基四胺的摩尔比为1:(0.55～0.7)。

优选的，步骤S1中所述反应的时间为6～8h。

优选的，步骤S2中所述第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠的摩尔比为1:(1～1.2):(0.86～1)。

优选的，步骤S2中所述反应的时间为1～3h。

优选的，步骤S3中所述第二中间产物、2,4-二硝基苯磺酰氯以及三乙胺的摩尔比为1:(1～1.2):(1～1.2)。

优选的，步骤S3中所述反应的时间为3～5h。

本发明还提供了一种上述香豆素类荧光探针或上述制备方法得到的香豆素类荧光探针在谷胱甘肽的体外荧光检测中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明荧光探针具有香豆素荧光团，该探针中的苯磺酸酯基团与GSH之间发生共轭加成反应生成显色团，将通过激发态分子内质子转移(ESIPT)过程很快恢复至荧光呈现状态，实现了对GSH的荧光识别，荧光强度变化明显，检测灵敏度高。

2.本发明荧光探针对GSH有较好的选择性，与其他常见氨基酸作用荧光信号基本没有变化，较高的抗干扰能力，反应时间较短，有较大的斯托克斯位移，检测限低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对应本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图得到其他的附图。

图1为本发明实施例1中第一中间产物的1H-NMR谱图；

图2为本发明实施例1中第二中间产物的1H-NMR谱图；

图3为本发明实施例1中香豆素类荧光探针的1H-NMR谱图；

图4为本发明实施例2中香豆素类荧光探针对谷胱甘肽(GSH)选择性识别的荧光发射光谱图；

图5为本发明实施例3中香豆素类荧光探针在不同浓度谷胱甘肽(GSH)存在下荧光发射光谱变化图；

图6为本发明实施例4中香豆素类荧光探针在谷胱甘肽(GSH)及其他氨基酸存在下的荧光发射强度变化图；

图7为本发明实施例5中香豆素类荧光探针对谷胱甘肽(GSH)的检测限计算图；

图8为本发明实施例6中香豆素类荧光探针在不同pH下的荧光发射强度变化图；

图9为本发明实施例7中香豆素类荧光探针在不同时间下的荧光发射强度变化图。

具体实施方式

本发明提供了一种香豆素类荧光探针，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：

该香豆素类荧光探针属于反应型荧光探针，分子结构中苯磺酸酯基团与GSH之间发生共轭加成反应生成显色团，实现了对GSH的荧光识别，检测灵敏度高。

上述香豆素类荧光探针的制备方法如下：

S1.将7-羟基香豆素与六次甲基四胺，溶于乙酸溶剂，70～100℃温度条件下反应，反应结束后降温至70℃以下调节体系PH至2～5，乙酸乙酯萃取，乙醇重结晶得到如式(Ⅰ^’)所示结构的第一中间产物；

S2.将所述第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶剂，110～120℃温度条件下反应，反应结束后加水析出固体，过滤得到如式(Ⅱ)所示结构的第二中间产物；

S3.将所述第二中间产物和三乙胺溶于二氯甲烷溶剂，然后缓慢滴加2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，0～25℃条件下反应，反应完毕后洗涤反应得到的产物，干燥，乙醇重结晶得到所述香豆素类荧光探针。

本发明香豆素类荧光探针的制备可采用以下反应式表示：

具体的，本发明首先将7-羟基香豆素与六次甲基四胺，溶于乙酸溶剂，70～100℃温度条件下反应，反应结束后降温至70℃以下，加入盐酸调节体系PH值，乙酸乙酯萃取，乙醇重结晶得到第一中间产物7-羟基-8-香豆素醛，本发明中7-羟基香豆素与六次甲基四胺的摩尔比优选为1：(0.55～0.7)，更优选为1:0.55，反应时间优选为6～8h。

得到第一中间产物7-羟基-8-香豆素醛后，将7-羟基-8-香豆素醛、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶剂，110～120℃温度条件下反应，加水析出固体，过滤得到第二中间产物8-(苯并[d]噻唑-2-基)-7-羟基-2H-苯并吡喃-2-酮，本发明中第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠的摩尔比优选为1：(1～1.2)：(0.86～1)，更优选为1：1：0.86，反应时间优选为1～3h。

S3.将所述第二中间产物和三乙胺溶于二氯甲烷溶剂，然后缓慢滴加2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，0～25℃条件下反应，反应完毕后洗涤反应得到的产物，干燥，乙醇重结晶得到所述香豆素类荧光探针。

得到第二中间产物8-(苯并[d]噻唑-2-基)-7-羟基-2H-苯并吡喃-2-酮后，将第二中间产物和三乙胺溶于二氯甲烷溶剂，然后缓慢滴加2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，0～25℃条件下反应，反应完毕后洗涤反应得到的产物，干燥，乙醇重结晶得到香豆素类荧光探针。本发明中第二中间产物、2,4-二硝基苯磺酰氯以及三乙胺的摩尔比优选为1:(1～1.2):(1～1.2)，更优选为1:1:1.2，反应时间优选为3～5h。

本发明通过将第二中间产物中可产生激发态分子内质子转移(excited-stateintramolecular proton transfer，ESIPT)机理的羟基官能团用苯磺酸酯封闭，使母体荧光关闭。然后当该荧光探针用于检测GSH时，苯磺酸酯基团与GSH之间发生共轭加成反应，使封闭的羟基官能团打开，生成显色团，实现了对谷胱甘肽的荧光识别，检测灵敏度高。

本发明提供的上述香豆素类荧光探针或上述制备方法制备的香豆素类荧光探针可以应用在谷胱甘肽的体外荧光检测中，检测的PH为7左右,GSH的检出限是6.83×10^-7M。检测中，香豆素类荧光探针与GSH的最佳反应时间为16min。

为了进一步说明本发明，下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下，所获得的的所有其他实施例，都属于本发明保护范围。

仪器与试剂：

以下所有的荧光测量在Hitachi F-7000荧光光度计上进行；核磁共振光谱在Bruker DRX-400光谱仪上获得(用氘代氯仿和氘代二甲亚砜作为核磁溶剂)，溶液的pH值用Mettler toledodelta 320pH计测定。

7-羟基香豆素(化合物1)从北京翰隆达科技发展有限公司购得。

六次甲基四胺从上海迈瑞尔化学技术有限公购得。

2-氨基苯硫酚在上海国药集团有限公司购得。

偏亚硫酸钠在上海国药集团有限公司购得。

三乙胺(85％)在上海国药集团有限公司购得。

2,4-二硝基苯磺酰氯在上海迈瑞尔化学技术有限公购得。

实验过程中所用的水均为去离子水。

除非特别指明外，其它的化学试剂都是分析纯，不需要进一步的纯化和处理，可以直接使用。

实施例1：香豆素类荧光探针L的制备

第一中间产物的合成：将10g(61.6mmol)的7-羟基香豆素(化合物1)和4.8g(33.88mmol)的六次甲基四胺放入100mL的圆底烧瓶中，加入30mL乙酸溶解，加热至90℃，搅拌反应8h后停止反应；降温至70℃，加入50mL的1mol/L的盐酸溶液搅拌调至PH值为2～5；加入冰水，加入乙酸乙酯溶剂萃取，萃取三次，每次加入30mL，再用无水硫酸钠干燥有机相，减压抽滤，滤液减压旋蒸除去溶剂乙酸乙酯，得黄色固体；然后用无水乙醇重结晶黄色固体得1.8g第一中间产物，产率为18％。

第二中间产物的合成：将0.69g(3.67mmol)的7-羟基香豆素醛(第一中间产物)放入50mL的圆底烧瓶中，用5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解，在磁力搅拌下加入0.4g(3.67mmol)的二氨基苯硫酚和0.6g(3.15mmol)的偏亚硫酸钠，加热至120℃，搅拌反应3h后停止反应；将反应液冷却至室温，加入50mL去离子水使固体析出，过滤并用去离子水洗涤，真空干燥，得到淡黄色固体(第二中间产物)0.92g，产率为90％。

式(I)所示化合物(香豆素类荧光探针)的合成：将第二中间产物(0.147g，0.5mmol)溶于40mL二氯甲烷溶液中，在磁力搅拌下加入0.08mL三乙胺，将混合液在室温下搅拌30min，加入溶于5mL二氯甲烷中的丙烯酰氯(0.159g，0.6mmol)，然后室温搅拌5h，得到反应产物。将得到的反应产物用稀盐酸和盐水洗涤后经无水硫酸镁干燥，减压旋蒸，用乙醇重结晶得白色固体得0.102g，产率为39％。

分别对第一中间产物、第二中间产物和式I所示化合物(香豆素类荧光探针)进行1H-NMR谱图测定，测试结果分别如图1，图2和图3所示。

实施例2：香豆素类荧光探针L对GSH的选择性检测：

配置摩尔浓度为1.0mmol/L的香豆素类荧光探针二甲亚砜标准液；在PBS缓冲溶液的体系中，向其中分别加入香豆素类荧光探针二甲亚砜标准液和摩尔浓度为10mmol/L的氨基酸溶液；搅拌均匀后16min后检测溶液的荧光发射光谱变化；

氨基酸溶液中的氨基酸分别为：Cys、GSH、Hcy、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Vc；

如图4所示，在不加入任何氨基酸时，荧光探针L溶液在510nm处几乎没有发射峰，当加入GSH后，溶液在510nm处出现了强的发射峰，加入其他氨基酸时，除了Cys和Hcy两个都含有巯基的氨基酸在510nm出现了不是很强的峰之外，GSH、Hcy、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Vc等氨基酸加入后，荧光探针溶液在510nm处基本没有发射峰，故实验结果表明，只有含有巯基的氨基酸，才能引起荧光探针溶液在510nm处出现明显的荧光增强，且对GSH的效果更好。该香豆素类荧光探针在PBS缓冲溶液中对GSH有良好的选择性。

实施例3：香豆素类荧光探针L对GSH的荧光滴定实验：

配置摩尔浓度为1mmol/L的香豆素类荧光探针二甲亚砜标准液3100ml；平均分成7等份，在第1至第7等份中分别加入等当量为0eq、1eq、2eq、3eq、4eq、5eq、6eq的GSH搅拌均匀16min后检测各试样的荧光发射光谱，结果如图5所示；由图5所知，随着GSH浓度的逐步增大，探针溶液在510nm处的荧光强度也逐步增强，当GSH的浓度达到探针浓度的6倍，即6mmol/L时，此时荧光强度基本不再增强，滴定达到饱和，故实验结果表明，该香豆素类荧光探针对GSH具有良好的传感性质。

实施例4：香豆素类荧光探针L对GSH识别竞争实验：

在PBS缓冲溶液的体系中，向其中分别加入香豆素类荧光探针二甲亚砜标准液，再分别加入10mmol/L的其他氨基酸(Cys、Hcy、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Vc)，然后向以上各个含有氨基酸的溶液中加入10mmol/L的GSH，搅拌均匀16min后检测溶液的荧光发射光谱分别取510nm处的荧光发射强度，作图结果如图6所示(图中横坐标上的1至23分别对应Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Vc、Hcy、Cys)。由图6所知，共存的其他氨基酸对GSH的荧光识别基本没有干扰，探针的抗干扰能力很强。

实施例5：香豆素类荧光探针L对GSH的检测限的计算

检测限根据荧光光谱滴定数据计算。以荧光滴定强度为纵坐标，GSH的浓度作为横坐标作图，如图7所示。在GSH浓度在0×10^-5mmol/L到5×10^-5mmol/L的浓度范围内，运用公式D＝3Sb1/k(Sb1是空白溶液的标准方差，k是拟合直线的斜率)，其中D为检测限，K＝3，Sb1＝空白溶液的标准偏差，S是校准曲线的斜率。经计算检测限为6.83×10^-7M。

实施例6:香豆素类荧光探针L对GSH的最佳pH范围检测

对不同pH值(1.0-12.0)的PBS缓冲溶液对香豆素类荧光探针荧光强度的影响进行检测，结果见图8，图8为香豆素类荧光探针在不同pH下的荧光发射强度变化图；从图8中可以看出，香豆素类荧光探针L在不同pH的PBS缓冲溶液里，荧光强度几乎不受影响。在加入GSH的情况下，发现在中性条件下香豆素类荧光探针的荧光强度基本保持不变，稳定性很好，这表明荧光探针在中性条件下检测GSH不受pH的影响并且可用于实际样品的检测。

实施例7:香豆素类荧光探针L对GSH的最佳反应时间检测

对香豆素类荧光探针最佳反应时间进行荧光检测，结果见图9，图9为香豆素类荧光探针在不同时间下的荧光发射强度变化图；从图9中可以看出，16min左右，香豆素类荧光探针和GSH的反应基本完全，荧光强度基本保持不变，这表明荧光探针可以快速响应GSH。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种香豆素类荧光探针，其特征在于，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：

2.一种权利要求1所述香豆素类荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将7-羟基香豆素与六次甲基四胺，溶于乙酸溶剂，70～100℃温度条件下反应，反应结束后降温至70℃以下调节体系p H至2～5，乙酸乙酯萃取，乙醇重结晶得到如式(Ⅰ^’)所示结构的第一中间产物；

S2.将所述第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶剂，110～120℃温度条件下反应，反应结束后加水析出固体，过滤得到如式(Ⅱ)所示结构的第二中间产物；

S3.将所述第二中间产物和三乙胺溶于二氯甲烷溶剂，然后缓慢滴加2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，0～25℃条件下反应，反应完毕后洗涤反应得到的产物，干燥，乙醇重结晶得到所述香豆素类荧光探针。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中7-羟基香豆素与六次甲基四胺的摩尔比为1:(0.55～0.7)。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述反应的时间为6～8h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠的摩尔比为1:(1～1.2):(0.86～1)。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述反应的时间为1～3h。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述第二中间产物、2,4-二硝基苯磺酰氯以及三乙胺的摩尔比为1:(1～1.2):(1～1.2)。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述反应的温度为0～25℃，反应时间为3～5h。

9.权利要求1所述的香豆素类荧光探针或权利要求2至8任意一项所述制备方法得到的香豆素类荧光探针在谷胱甘肽的体外荧光检测中的应用。

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