CN112225743A - 一种喹啉基近红外罗丹明荧光染料、比率荧光探针及其合成和应用 - Google Patents

一种喹啉基近红外罗丹明荧光染料、比率荧光探针及其合成和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种喹啉基近红外罗丹明荧光染料、比率荧光探针及其合成和应用，荧光染料和比率荧光探针的结构如式(I)所示。本发明的喹啉基近红外罗丹明荧光染料在近红外区域(650‑800nm)有很强的荧光发射，具备较好的成像检测应用潜力；本发明的比率荧光探针在高选择性地识别生物硫醇半胱氨酸(Cys)/高半胱氨酸(Hcy)，以Cys为例，探针在Cys的作用下，荧光发射强度在462nm处显著增强，在712nm处逐渐减弱，I462nm/I712nm比值与Cys浓度在一定范围内呈线性关系，检测限为0.12μM，最后在细胞内实现对Cys的比率成像检测。

Description

一种喹啉基近红外罗丹明荧光染料、比率荧光探针及其合成 和应用
技术领域
本发明属于有机荧光传感技术领域，涉及一种近红外有机染料的设计合成以及比率荧光传感应用，具体一种以喹啉基近红外罗丹明的合成并设计于比率荧光探针的检测应用。
背景技术
在生物体中，小分子生物硫醇包括半胱氨酸(Cys)/高半胱氨酸(Hcy)，在维持细胞氧化还原平衡和代谢中起关键作用，并且生物硫醇浓度异常与几种疾病有关，如Cys水平降低与儿童发育异常密切相关。此外，由于线粒体中活性氧的氧化损伤会导致细胞凋亡，Cys/Hcy可以作为抗氧化剂来去除活性氧。因此，在细胞线粒体中检测Cys/Hcy非常重要。由于具有高灵敏度、选择性和实时检测的优势，荧光探针成为监测细胞内Cys/Hcy的最佳工具之一，并已得到广泛开发。
罗丹明荧光染料因其优异光学性能，如高吸收系数、高荧光量子产率和光稳定性被广泛设计荧光探针应用于分析检测和荧光成像领域[Chem Rev 2012,112,1910–1956]。通常，罗丹明类荧光探针通过检测对象调节探针的螺环开关，从而产生“闭-开”荧光变化；然而，这种类型探针一般具有较差的检测精度问题，因为单一波长荧光变化受到如探针浓度、溶剂极性和辐射光波动等测试环境的干扰。为克服此类问题，通过调节罗丹明受体与另一种荧光团供体(如香豆素、萘二甲酰亚胺等)之间的荧光共振能量转移(FRET)或跨键能量转移(TBET)过程，设计了比率荧光探针[Acc Chem Res 2013,46,1462-1473]，从而具通过双通道发射强度变化的自校准功能，具备较高的检测精度和较低的检测限。经检索，此类探针存在对能量供体染料选择有限并且合成方法繁琐等问题。因此，迫切需要简单高效构建罗丹明类近红外比率荧光探针，应用于生物硫醇检测应用。
发明内容
本发明的主要目的是克服已有技术的不足，提供一种构建罗丹明类近红外比率荧光探针的简单高效方法，并应用于生物硫醇的检测。
本发明提供了一种喹啉基近红外罗丹明荧光染料及比率荧光探针所述近红外罗丹明荧光染料和比率荧光探针分子结构式如下：
Figure BDA0002598600790000021
本发明还提供了一种所述的喹啉基近红外罗丹明荧光染料和比率荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将4-取代-2-硝基苯甲醛与1,3-环己二酮在铁粉/乙酸下缩合，经过后处理得到粗品，再在二氯甲烷中加入三溴化硼，反应结束后处理得到缩合产物；
(2)将步骤(1)缩合产物与4-二乙氨基酮酸3在浓硫酸中加热反应，反应结束后经过后处理得到所述的喹啉基近红外罗丹明荧光染料；
所述的4-取代-2-硝基苯甲醛为4-二甲氨基-2-硝基苯甲醛或4-甲氧基-2-硝基苯甲醛。
制备化学反应式如下：
Figure BDA0002598600790000022
将染料RQ2在1,2-二氯乙烷中与三氯氧磷反应得到相关酰氯，再与3,5-双(三氟甲基)苯硫酚反应，后处理得到荧光探针RhQ。
制备化学反应式如下：
Figure BDA0002598600790000031
本发明还提供了一种所述的喹啉基罗丹明荧光染料的光谱性质。
本发明的喹啉基罗丹明荧光染料在二氯甲烷等有机溶剂中，染料在500-600nm有很强的可见吸收，特别是染料RQ2在650-800nm近红外区域有较好的荧光发射，如图2所示。
本发明还提供了一种所述的喹啉基罗丹明类比率荧光探针在生物硫醇检测的应用。
本发明的荧光探针在没有生物硫醇(Cys/Hcy)存在下，用410nm激发探针没有喹啉基的荧光，只有630nm探针发射出712nm的近红外荧光；在Cys/Hcy下，探针分子发生取代关环反应，此时410nm激发探针产生很强的462nm的喹啉基荧光，630nm激发产生减弱的712nm近红外荧光，从而实现了比率荧光检测生物硫醇Cys/Hcy，如图1所示。
本发明所述的近红外荧光探针，以Cys为例，随Cys浓度的增加，探针在410nm激发在462nm处荧光发射强度显著增强，630nm激发在712nm处荧光发射强度逐渐减弱；二者波长的比值(I462nm/I716nm)相对Cys浓度在一定范围内呈线性关系，可确定本发明所述的探针可以定量检测Cys浓度，如图3和4所示。
将本发明所述的比率荧光探针RhQ加入到Hela活细胞中染色成像，并在加探针之前加入N-乙基马来酰亚胺(NEM，巯基清除试剂)和接着外加Cys为两组对照组。两通道的荧光信号变化显著。在实验组中，细胞蓝色通道荧光较弱，红色通道荧光荧光信号强，而加入NEM的对照组里，细胞蓝色通道荧光减弱至无，红色通道荧光有增强，特别在外加Cys的对照组中，蓝色通道荧光信号很强，红色通道荧光减弱，如图8所示。
本发明的有益效果为：该喹啉基罗丹明类染料在650-800nm近红外区域有较好的荧光发射，极大红移了可见区发射的传统罗丹明染料光谱，具备很强的成像能力。而由此设计的比率荧光探针可高选择性检测生物硫醇(Cys/Hcy)，以Cys为例，随着Cys浓度的增加，探针在462nm的荧光发射强度显著增强，在712nm处荧光逐渐减弱；二者荧光比值(I462nm/I716nm)与Cys浓度在一定范围内呈线性关系，检测限为0.12μM。该比率荧光探针不仅可以定量检测溶液体系中的Cys，而且能够用于活细胞内的Cys荧光比率成像。
附图说明
图1为本发明喹啉基近红外罗丹明荧光染料分子结构及比率荧光探针与Cys作用的结构变化。
图2为本发明喹啉基罗丹明近红外荧光染料的光谱图。
图3为本发明比率荧光探针与不同浓度Cys作用的荧光发射变化图。
图4为本发明比率荧光探针对不同浓度Cys作用后的荧光强度比值变化(I462nm/I712nm)谱图。
图5为本发明比率荧光探针对Cys和Hcy的荧光强度比值(I462nm/I712nm)随时间变化谱图。
图6为本发明比率荧光探针对不同物种作用后的荧光强度比值变化(I462nm/I712nm)谱图。
图7本发明比率荧光探针和Cys作用后的质谱谱图。
图8为本发明比率荧光探针在Caov3细胞的荧光成像图。
具体实施方式
实施例1
将Fe粉末(0.56g，10mmol)加入到化合物1(0.36g，2mmol)和1,3-环己二酮(0.27g，2.4mmol)的乙酸(10mL)溶液中。将混合物在氩气下在50℃下搅拌3小时。真空下除去溶剂后，将残余物溶于乙酸乙酯(40mL)中，并用饱和NaHCO3(15mL)和水(15mL)洗涤。收集有机层，用Na2SO4干燥，过滤并旋干，得到固体粗品。再将粗品加入到乙酸和48％氢溴酸溶液(v/v＝4:1)中，80℃反应4h后。旋干溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯(40ml)中，并用饱和NaHCO3(15ml)和水(15ml)洗涤，收集有机层，Na2SO4干燥，过滤并旋干；通过柱色谱法纯化粗产物，得到产物2，黄色固体(0.27g,64％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.60(s,1H),8.65(s,1H),7.95(d,J＝9.2Hz,1H),7.15(d,J＝9.2Hz,2.4Hz,1H),7.13(d,J＝2.0Hz,1H),3.09(t,J＝6.0Hz,2H),2.64(t,J＝6.0Hz,2H),2.08(t,J＝6.0Hz,2H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:197.6,162.9,161.8,151.6,136.1,132.1,124.0,121.17,119.9,109.6,38.8,33.2,21.8。
实施例2
与实施例1类似，将Fe粉末(0.56g，10mmol)加入到化合物4(0.38g，2mmol)和1,3-环己二酮(0.27g，2.4mmol)的乙酸(10mL)溶液中。在50℃下搅拌3小时。真空下除去溶剂后，将残余物溶于乙酸乙酯(40mL)中，并用饱和NaHCO3(15ml)和水(15ml)洗涤。收集有机层，用Na2SO4干燥，过滤并旋干，柱色谱法纯化，得到产物5，黄色固体(0.21g，44％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.63(s,1H),7.72(d,J＝9.2Hz,1H),7.12(dd,J＝9.2Hz,2.4Hz,1H),7.03(d,J＝2.0Hz,1H),3.21(t,J＝6.0Hz,2H),3.16(s,6H),2.73(t,J＝6.0Hz,2H),2.23(t,J＝6.0Hz,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:197.8,162.8,153.1,151.6,136.3,130.8,122.7,119.3,115.9,105.0,40.3,38.9,33.5,21.9。
实施例3
将化合物5(240mg，1mmol)和4-二乙氨基酮酸(313mg，1mmol)缓慢加入浓H2SO4(10mL)中，混合溶液在100℃加热2小时。冷却后，将反应混合物缓慢倒入冰水中，并加入HClO4(70％，0.5mL)。过滤得到沉淀，并通过柱色谱法纯化得到染料RQ2(470mg，76％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:8.39(s,1H),7.99(d,J＝7.6Hz,1H),7.75(d,J＝8.8Hz,1H),7.67–7.63(m,1H),7.59–7.55(m,1H),7.24(d,J＝7.2Hz,1H),7.15–7.11(m,2H),6.57–6.54(m,2H),6.41–6.39(m,1H),3.38(q,J＝3.2Hz,4H),3.27–3.25(m,1H),3.10(s,6H),3.05–2.99(m,1H),2.31–2.27(m,1H),2.01–1.97(m,1H),1.20(t,J＝7.2Hz,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:170.0,157.9,152.5,151.8,149.4,148.5,134.6,129.4,129.1,128.8,127.8,125.1,123.6,119.4,119.0,115.7,109.2,105.4,105.2,104.5,97.3,44.5,40.4,31.0,20.6,12.6。
实施例4
染料RQ1与实施例3类似，以化合物2(214mg，1mmol)和4-二乙氨基酮酸(313mg，1mmol)为原料，得到染料RQ1(175mg，38％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:11.11(s,1H),9.18(s,1H),8.21(s,1H),8.07(d,J＝7.6Hz,1H),7.88(d,J＝8.8Hz,1H),7.78(m,1H),7.43(m,2H),7.28(d,J＝7.2Hz,3H),7.06(m,1H),3.43(q,J＝3.2Hz,4H),3.15(m,2H),2.54(m,2H),1.22(t,J＝7.2Hz,6H)。
实施例5
将POCl3(1mL)逐滴添加至染料RQ2(110mg，0.21mmol)的1,2-二氯乙烷(20mL)溶液中。将反应在氩气保护下于80℃加热3h。反应完成后，在真空下除去溶剂，并加入无水乙腈(10mL)，接着在0℃下缓慢加入三乙胺(1mL)和3,5-双(三氟甲基)苯硫酚(100mg，0.42mmol)，反应在室温下搅拌3小时。反应结束后，除去溶剂，并加入二氯甲烷(40mL)，用水(15mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。油状物通过柱色谱纯化，得到探针RhQ(50mg，32％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:9.08(s,1H),8.32(d,J＝7.6Hz,1H),8.01(d,J＝9.2Hz,1H),7.94–7.92(m,1H),7.84–7.81(m,2H),7.72(s,2H),7.48(d,J＝7.6Hz,1H),7.36(s,1H),7.10–7.05(m,3H),6.95(s,1H),3.68–3.64(m,4H),3.19(s,6H),3.13–3.09(m,2H),2.75–2.68(m,2H),1.35–1.32(m,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:188.1,159.3,157.9,154.9,154.4,151.7,135.9,134.9,134.6,134.3,132.5,130.7,130.5,130.1,129.7,129.1,128.8,120.3,119.3,116.4,116.3,115.4,105.5,97.0,46.0,40.3,30.6,23.4,12.4。
实施例6
喹啉基罗丹明近红外荧光染料的光谱图：染料配置成浓度为10μmol/L的二氯甲烷溶液，测定紫外可见吸收和荧光发射光谱，结果见图2。
从图所知，染料RQ1和RQ2在二氯甲烷在可见区有较强的吸收，染料的荧光发射，相对于传统可见区发射的罗丹明染料，有明显的红移，特别是染料RQ2，在650-800nm近红外区域有较好的荧光发射，具有很强的成像检测应用潜力。
实施例7
探针RhQ对不同浓度Cys的荧光发射响应谱图：配置浓度为10μmol/L探针RhQ的EtOH/PBS(pH 7.4,20mM,v/v 1:1)测试溶液，再滴加不同浓度的Cys水溶液，待平衡后，测定荧光发射光谱，结果见图3，探针的荧光强度比值I462nm/I712nm变化如图4.
从图3和4所知，探针溶液中加入Cys后，其在462nm处荧光强度显著增强，而在712nm荧光减弱，因此探针可以作为Cys的比率型荧光探针，并实现对Cys的定量检测，经计算检测限为0.12μmol/L。
实施例8
探针RhQ检测Cys和Hcy的动力学测试：配置浓度为10μmol/L探针RhQ的EtOH/PBS(pH 7.4,20mM,v/v 1:1)测试溶液，然后加入40μmol/L的Cys和Hcy，记录不同时间的荧光发射光谱变化，如图5所示。
结果显示，随着时间的增加，荧光强度比值I462nm/I712nm对Cys和Hcy均能增强，并在一定浓度范围里成线性关系，说明探针可以作为生物硫醇Cys/Hcy的比率型荧光探针。
实施例9
探针RhQ对不同物种作用后的荧光强度比值I462nm/I712nm变化：配置浓度为10μmol/L探针RhQ的EtOH/PBS(pH 7.4,20mM,v/v 1:1)测试溶液，然后加入40μmol/L的不同物种(GSH 1mmol/L)，待平衡后，测定荧光发射光谱，整理结果见图6。
由图6可知，探针的荧光强度比值仅对Cys/Hcy有很大的变化，其他物种影响很弱。
实施例10
探针RhQ和Cys作用后的质谱谱图：利用高分辨质谱测定了探针与Cys作用后产物的分子量，如图7所示，该分子的理论质谱值M+1为621.2530，实测值为621.2533，说明探针与Cys取代关环得到荧光物质RhQ-Cys，分子结构变化如图1所示。
实施例7
细胞内荧光成像测试：将培育好的Caov3细胞转移到共聚焦成像用玻璃瓶中培育24h后，实验组用该探针RhQ(10μM)溶液培育30分钟，然后PBS洗涤三次进行共聚焦细胞成像检测。对照组一在细胞内先用NEM(1mM)溶液培育30分钟后，再加探针培育30分钟，接着用PBS洗涤三次进行共聚焦细胞成像检测。对照组二，先用NEM(1mM)溶液培育30分钟后，PBS洗涤三次后，再加探针(10μM)和Cys(100μM)分别培育30分，最后用PBS洗涤三次进行共聚焦细胞成像检测。用两个波长分别激发并收集信号，激发波长为405nm时蓝色喹啉通道收集波长为420-470nm，激发波长为630nm时红色罗丹明通道收集波长为680-730nm。

Claims (9)

1.一种喹啉基近红外罗丹明比率荧光探针，其特征在于，为Probe RhQ，结构式如下：
Figure FDA0002598600780000011
2.一种喹啉基近红外罗丹明荧光染料，其特征在于，为荧光染料RQ1和RQ2，结构式如下：
Figure FDA0002598600780000012
3.一种如权利要求2所述的喹啉基近红外罗丹明荧光染料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将4-取代-2-硝基苯甲醛与1,3-环己二酮在铁粉和乙酸作用下缩合，经过后处理得到粗品，再在二氯甲烷中加入三溴化硼，反应结束后处理得到缩合产物；
(2)将步骤(1)缩合产物与4-二乙氨基酮酸在浓硫酸中加热反应，反应结束后经过后处理得到所述的喹啉基近红外罗丹明荧光染料；
所述的4-取代-2-硝基苯甲醛为4-二甲氨基-2-硝基苯甲醛或4-甲氧基-2-硝基苯甲醛。
4.一种如权利要求1所述的喹啉基近红外罗丹明比率荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求2所述的荧光染料RQ2经过POCl3酰氯化后，与3,5-双(三氟甲基)苯硫酚反应，后处理得到喹啉基近红外罗丹明比率荧光探针。
5.一种如权利要求1所述的比率荧光探针在生物硫醇检测的应用。
6.根据权利要求5所述的比率荧光探针在生物硫醇检测的应用，其特征在于，所述的生物硫醇为半胱氨酸和高半胱氨酸。
7.根据权利要求5或6所述的比率荧光探针在生物硫醇检测的应用，其特征在于，所述的荧光探针用于生物硫醇的定性检测，具体方法如下：
将所述的荧光探针配置成测试溶液，然后加入待测样品，分别用410nm和630nm光源激发，测定462nm和712nm处荧光发射强度变化，若462nm处荧光强度变强，712nm处荧光强度变弱，则确定待测样品中含有半胱氨酸或高半胱氨酸；
所述的测试溶液的溶剂为PBS和EtOH的混合溶液，体积比为1:1。
8.根据权利要求5或6所述的近红外比率荧光探针在生物硫醇检测的应用，其特征在于，所述的荧光探针用于生物硫醇的定量检测，具体方法如下：
(1)将所述的荧光探针配置成测试溶液，然后加入待测样品，分别用410nm和630nm激发下，测定462nm和712nm处荧光发射强度；
所述的测试溶液的溶剂为PBS和EtOH的混合溶液，体积比为1:1。
(2)计算得到荧光强度比值I462nm/I716nm，根据荧光强度比值I462nm/I716nm得到待测样品中的半胱氨酸或高半胱氨酸的含量。
9.根据权利要求5或6所述的近红外比率荧光探针在生物硫醇检测的应用，其特征在于，所述的荧光探针用于细胞内荧光成像测试，具体方法如下：将待测细胞用含有荧光探针的溶液进行孵化，然后PBS洗涤三次，进行共聚焦细胞成像检测；
共聚焦细胞成像检测时，用两个波长分别激发并收集信号，激发波长为405nm时蓝色通道收集波长为420-470nm，激发波长为630nm时红色通道收集波长为680-730nm。
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