CN103748091A - 使用近红外荧光团检测被分析物 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了用于选择性检测被分析物的化合物的实施方式，以及使用所述化合物检测被分析物的方法和试剂盒。所述化合物是包含至少一个以下通用结构的荧光团的桥接的紫精结合物，R1/R2、R2/R3、R3/R4、R5/R6、R6/R7和/或R7/R8中的至少一组一起形成取代或未取代的环烷基或芳基。
Figure DDA0000466054360000011

Description

使用近红外荧光团检测被分析物
与相关申请的交叉参考
本申请要求2011年7月6日提交的美国临时申请号61/505,029和2011年6月29日提交的美国临时申请号61/502,795的全文，每个所述临时申请以其全文通过参考并入本文。
技术领域
本申请公开了用于检测被分析物的包含近红外荧光团的化合物、方法和试剂盒的实施方式。
政府支持声明
本申请利用国立卫生研究院（National Institutes of Health）授予的R01EB002044号政府支持做出。美国政府在本发明中享有一定权利。
背景技术
简化的诊断测试的障碍在于当前的临床化学技术需要显著的样品制备和处理来分析复杂的生物样品。样品制备是诊断学中的主要瓶颈。能够在无需样品处理或分离步骤的条件下直接在被分析物介质（例如血、尿）中发挥作用的用于特定生物标志物的指示剂荧光团将需要较少的操作，从而产生更快速的结果并减少由样品处理造成的潜在健康危害。然而，开发这样的荧光团取得的进展令人吃惊地少。这至少部分是由长波长探针的相对缺乏造成的。
常规使用的近红外（NIR）活性染料或荧光团的类型相对少，并且目前仅有一种NIR染料被批准用于临床使用。NIR染料的优点包括来自于生物样品的干扰性吸收和荧光极小、廉价的激光二极管激发、以及散射小和组织穿透深度增强。然而，仅有相对少类型的这种染料可以容易地获得。它们包括酞菁、花青染料和方酸染料。每种染料类型具有固有的强度和限制。例如，几乎所有已确立的长波长荧光团类型都具有非常小的斯托克斯位移（即发射-激发波长差），例如10nm（Miller,SpringerSer.Fluoresc.,2008,5,147-162）。如果与相对宽谱带的光源例如LED联合使用，可能存在显著的散射光背景信号，产生不良的信噪比。
以前的研究调查了用于生物诊断和成像应用的红移性氧杂蒽染料。长波长的基于氧杂蒽的染料已被用于细胞成像应用中。然而，它们的光谱性质未落于便于检测血液中的被分析物的700-800nm的有用的NIR“血液窗口”的范围内。罗丹明是“红色”或长波长氧杂蒽染料。一种值得注意的长波长氧杂蒽染料是罗丹明800，其在取决于溶剂而比700nm高或低数纳米的红光与NIR的交界处发射。然而，它的缺点在于有限的水溶性和二聚体形成，以及16nm的小的斯托克斯位移（Sauer等，J.Fluoresc.,1995,5,247-261），这使血液中的分析复杂化。另一种新发明包括“JA”染料，其通过向含氮环添加双键而使光谱向更长波长迁移（Sauer等，美国专利号5,750,409）。Arden-Jacob和合作者开发了一系列改进的用于红光区域中的生物诊断的荧光团。然而，这些染料显示出相当小的斯托克斯位移，并且在NIR中不吸收或发射（美国专利号5,750,409）。
成环是用于产生较长波长荧光团的另一种方法。[c]型成环的氧杂蒽包括由Haugland开发的半萘并荧光素（seminaphthofluorescein）（SNAFL）和半萘并罗丹荧光素（seminaphthorhodafluor）（SNARF）化合物（Whitaker等，Anal.Biochem.,1991,194,330-344），其已被用作比率pH传感器、金属离子传感器和成像探针。（Chang等，PNAS,2004,101,1129-1134；Nolan等，J.Am.Chem.Soc.,2007,129,5910-5918.）
生物学重要的硫醇的检测已成为许多研究的焦点。不同的天然存在的硫醇可能具有类似结构，但可能具有相当不同的生理性质。对这些硫醇所观察到的生理效应和关联性引起公共健康关注。具有或多或少类似的结构但具有完全不同的生理性质的低分子量硫醇的实例包括半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH）、N-乙酰半胱氨酸和青霉胺。
谷胱甘肽是医学专业人员特别感兴趣的。谷胱甘肽水平是氧化应激的指示。此外，低谷胱甘肽水平可能与例如线粒体疾病、自闭症和汞中毒相关。
硫醇容易被氧化，并且通常是无色的并且在可见光波长处无荧光。大多数报道的用于检测硫醇的方法都基于非特异性氧化还原化学、免疫测定法或者基于用发色团或荧光团衍生化。用于检测硫醇的通用方法不容易区分结构类似的物质。对用于检测和定量生物硫醇的改进的方法，存在着显著需求。
甲基紫精（MV2+）是4,4'-联吡啶基二价阳离子：
Figure BDA0000466054340000031
MV2+已在源自于Hcy、Cys和GSH的还原性二硫化物和以α-氨基碳为中心的自由基两者的平衡动力学研究中用作氧化剂。通过在生物硫醇存在下形成的含有甲基紫精自由基阳离子的溶液的UV-Vis光谱的变化来监测还原性自由基的形成。参见R.Zhao等，“硫醇的单电子氧化和由硫自由基从α-氨基C-H键提取氢的动力学”（Kinetics ofone-electron oxidation of thiols and hydrogen abstraction by thiyl radicalsfromα-amino C-H bonds），J.Am.Chem.Soc.,vol.116,pp.12010-12015(1994)；和R.Zhao等，“谷胱甘肽硫自由基向α-氨基烷基自由基的分子内转化的重要性，热化学和生物学意义”（Significance of theintramolecular transformation of glutathione thiyl radicals toα-aminoalkylradicals.Thermochemical and biological implications），J.Chem.Soc.,Perkins Trans.,vol.2,pp.569-574(1997)。据推测，由于分子内氢提取机制涉及5原子环过渡态（参见图1A），源自于Hcy的还原性α-氨基烷基自由基的形成应该是特别有利的。相反，在Cys或GSH的情形中，H原子提取至以还原性碳为中心的自由基将分别通过不太有利的4元环（图1B）或9元环（未示出）过渡态几何结构来进行。参见图1A和1B，其分别示出了推断的质子提取，导致从Hcy和Cys的硫自由基形成α-氨基烷基自由基。这些参考文献没有公开高半胱氨酸、半胱氨酸和谷胱甘肽之间的任何可察觉的比色选择性。
通过参考并入本文的美国公布2008/0261315，公开了一种使用甲基紫精选择性测定高半胱氨酸的方法。将含有Hcy的样品与甲基紫精的无色溶液，在约25℃至110℃之间的温度和约3.9至约9.5之间的pH下加热5分钟或更长时间，产生可见的颜色变化。颜色的形成可以通过398nm和605nm处的吸收峰的出现来监测。相反，当与甲基紫精溶液在相似条件下加热时，含有Cys或GSH的样品仍然为无色。
发明内容
本申请公开了用于选择性检测被分析物的化合物的实施方式。本申请还公开了用于执行所述检测的方法和试剂盒的实施方式。当与溶液中的一种或多种被分析物反应时，本公开的化合物的实施方式在所述溶液的吸收光谱和/或发射光谱中产生可检测的变化。所述溶液可以包括生物流体（例如血或尿）。
本公开的化合物的实施方式是具有式I、II或III的结构的桥接的紫精结合物：
Figure BDA0000466054340000051
其中X-是任何平衡阴离子，RA和RB独立地是取代或未取代的脂族基团，或包含一个或多个取代或未取代的芳香环和/或杂芳环的取代或未取代的芳基或杂芳基，并且RA和RB中的至少一个是具有通式（i）的结构的荧光团：
Figure BDA0000466054340000052
其中每个描绘成“------”的键根据需要是单键或双键，以满足化合价要求；X1是O、S、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、CH2、C(CH3)2或NH；R1、R2和R4独立地是氢、羟基、氧、硫醇、低级烷基、羧基烷基、氨基、取代的氨基、烷氧基、卤素或–NHRc，其中Rc是
Figure BDA0000466054340000061
R5、R7和R8独立地是氢、羟基、硫醇、低级烷基、羧基烷基、氨基、取代的氨基、烷氧基或卤素；R3和R6独立地是氢、羟基、卤素、氧、硫、硫醇、氨基、烷基氨基、亚氨基、亚胺离子、烷基亚氨基、烷基亚胺离子、环烷基亚氨基或–NHRc，其中Rc如上所定义；R1与R2、R2与R3、R3与R4、R5与R6、R6与R7和/或R7与R8中的至少一组一起形成取代或未取代的环烷基或芳基；R9-R12独立地是氢、烷基、酰基、羧基、硝基、氨基、烷基氨基或-SO3H；R13是氢、羟基、低级烷基、低级烷氧基、–SO3H或–COOR14，其中R14是氢或低级烷基并且环B中描绘成“------”的键是双键，或者R13是与环B和环D形成环系统的一个或多个原子并且环B中描绘成“------”的键是单键；并且R1-R13中的至少一个是将所述荧光团共价结合到所述桥接的紫精骨架的连接基。
在某些实施方式中，RA和RB中的至少一个是具有通式（iii）、（iv）、（v）、（vi）、（vii）、（viii）、（ix）、（x）或（xi）的结构的荧光团：
Figure BDA0000466054340000062
Figure BDA0000466054340000071
其中每个描绘成“------”的键根据需要是单键或双键，以满足化合价要求；X1和R1-R14如上所定义；R15-R22独立地是氢、卤素、羟基、氧、硫醇、氨基、烷基氨基、烷氧基、硫、亚氨基、亚胺离子、烷基亚氨基、烷基亚胺离子或-NHRc，其中Rc如上所定义；并且R1-R22中的至少一个是将所述荧光团共价结合到所述紫精骨架的连接基。在某些实施方式中，R13是所述连接基并且是式–COO–的连接基。在某些实施方式中，X1是氧。在某些实施方式中，R13是–COO–并形成内酯环，并且R1-R12或R15-R22中的至少一个是所述连接基。
在某些实施方式中，所述荧光团具有通式（iii）、（iv）、（ix）或（x）的结构，其中X1是氧，R16和R18独立地是卤素、氢、羟基、氧、硫醇、氨基、烷基氨基、烷氧基、其中Rc如上所定义的–NHRc、或连接基部分，并且R16和R18中的至少一个不是氢。在某些实施方式中，所述荧光团具有通式（iv）的结构，其中X1是氧，并且R19和R21独立地是羟基、硫醇、氧、亚氨基、亚胺离子、烷基亚氨基、烷基亚胺离子、氨基、烷基氨基、其中Rc如上所定义的-NHRc、或连接基部分，并且R19和R21中的至少一个不是氢；在特定实施方式中，前述通式（iv）的荧光团还在R16或R18处包括卤素、羟基、硫醇、氨基、烷基氨基、烷氧基或–NHRc，其中Rc如上所定义。在某些实施方式中，所述荧光团具有通式（iii）的结构，其中X1是氧并且R6和R16是–NHRc，或者所述荧光团具有通式（iv）的结构，其中X1是氧并且R16和R21是–NHRc。在某些实施方式中，所述荧光团具有通式（vi）的结构，其中R17是卤素、羟基、硫醇、氨基、烷基氨基或–NHRc，其中Rc如上所定义，并且R20是氧、硫、亚氨基、亚胺离子、烷基亚胺离子或–NHRc，其中Rc如上所定义。
本公开的NIR荧光团-紫精结合物的某些实施方式包括至少一个通式（i）、（iii）、（iv）、（v）、（vi）、（vii）、（viii）、（ix）、（x）或（xi）的荧光团，所述荧光团在大于或等于700nm、例如大于或等于750nm的波长处具有发射光谱最大值。在某些实施方式中，所述荧光团具有大于或等于80nm、例如大于或等于100nm的斯托克斯位移。
在某些实施方式中，RA和RB两者都是荧光团，每个荧光团独立地具有选自通式（i）、（iii）、（iv）、（v）、（vi）、（vii）、（viii）、（ix）、（x）或（xi）的结构。在某些实施方式中，RA和RB具有相同的结构。在某些实施方式中，RA和RB中的一个是通式（i）、（iii）、（iv）、（v）、（vi）、（vii）、（viii）、（ix）、（x）或（xi）的荧光团，并且RA和RB中的另一个是低级烷基腈、低级烷基取代的苯基、烯基、炔基、取代的香豆素、缩醛或羧酸化物基团。在某些实施方式中，RA和RB中的另一个是
Figure BDA0000466054340000091
所述化合物的实施方式可用于检测被分析物。在某些实施方式中，用于检测被分析物的方法包括通过将包含被分析物的样品与本公开的化合物的实施方式相接触来形成溶液，允许所述溶液中所述被分析物与所述化合物之间的反应进行有效的时间段，以产生溶液的颜色、吸收光谱、发射光谱或其组合的可检测的变化，其中所述变化指示存在所述被分析物，以及检测所述变化。在某些实施方式中，通过将所述溶液暴露于光源并通过检测来自于所述化合物的荧光以检测所述被分析物，来检测所述变化。例如，可以在所述反应已进行所述有效的时间段后检测与所述化合物的发射光谱最大值相对应的波长处的荧光。在某些实施方式中，所述方法还包括通过在与所述化合物的发射光谱最大值相对应的波长处测量来自于所述化合物的荧光的量，对所述被分析物进行定量。
在某些实施方式中，通过在所述反应已进行所述有效的时间段后，在一个或多个波长处检测所述溶液的吸光度的变化，来检测所述变化。在某些实施方式中，将在将所述样品与所述化合物合并后的第一时间时所述溶液的吸收光谱，与所述反应已进行所述有效的时间段后所述溶液的吸收光谱进行比较。在其他实施方式中，将在将所述样品与所述化合物合并后的第一时间时所述溶液的发射光谱，与所述反应已进行所述有效的时间段后所述溶液的发射光谱进行比较。
在某些实施方式中，所述样品包括生物流体例如血或尿。在某些实施方式中，所述被分析物是半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷或其组合。
当所述被分析物包括谷胱甘肽、半胱氨酸和/或高半胱氨酸时，所述化合物可以包括至少一个通式（vi）的荧光团，其中X1是O、S、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、CH2或NH；R1、R4、R5和R8独立地是氢、羟基、硫醇、低级烷基、羧基烷基、氨基、取代的氨基、烷氧基或卤素；R9-R12独立地是氢、烷基、酰基、羧基、硝基、氨基、烷基氨基或-SO3H；R13是氢、羟基、低级烷基、低级烷氧基、–SO3H或–COOR14，其中R14是氢或低级烷基，并且环B中描绘成“------”的键是双键，或者R13是与环B和环D形成环系统的一个或多个原子并且环B中描绘成“------”的键是单键；R15-R18独立地是氢、卤素、羟基、硫醇、氨基、烷基氨基、或烷氧基；R19-R22独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、氧、亚氨基、亚胺离子、烷基亚氨基、烷基亚胺离子、氨基或烷基氨基，并且R1、R4、R5、R8-R13、R15、R16、R18、R19、R21或R22中的至少一个是将所述荧光团共价结合到所述紫精骨架的连接基。在某些实施方式中，R13是所述连接基并且是式–COO–的连接基。在某些实施方式中，当所述被分析物是谷胱甘肽时，R17是羟基、氨基或烷基氨基，并且R20是氧、羟基、氨基、烷基氨基、亚氨基或烷基亚胺离子。在某些实施方式中，当所述被分析物是琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷或其组合时，R17和R20中的至少一个是–NHRc。在这样的实施方式中，R13通常是-COOR14，其中R14是氢或低级烷基，并且所述连接基位于R9、R10、R11或R12处。
用于检测被分析物的试剂盒的实施方式包括本公开的化合物的至少一种实施方式，其在与包含所述被分析物的样品（例如生物流体）合并时，与不包含所述被分析物的样品中的所述化合物相比，会发生吸收光谱和/或发射光谱的变化。在某些实施方式中，所述试剂盒还包含至少一种缓冲溶液，在所述缓冲溶液中，所述化合物在与包含所述被分析物的样品合并时，与当与所述缓冲溶液和不包含所述被分析物的样品合并时的所述化合物相比，会发生吸收光谱和/或发射光谱的变化。所述试剂盒的某些实施方式也可以包含用于评估由所述化合物与所述被分析物之间的反应产生的颜色变化的颜色对比图。在某些实施方式中，所述试剂盒还包含多个一次性容器，所述化合物与所述被分析物之间的反应可以在所述容器中进行。在特定实施方式中，在所述多个一次性容器中预先称量在与所述被分析物反应时有效地发生颜色、吸收光谱、发射光谱或其组合的可检测变化的量的所述化合物。
在某些实施方式中，当所述被分析物是半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷或其组合时，所述试剂盒包含具有至少一个通式（vi）的荧光团的化合物，其中R17是羟基、氨基、烷基氨基或-NHRc，其中Rc如上所定义，并且R20是氧、羟基、氨基、烷基氨基、亚氨基、烷基亚胺离子或–NHRc，其中Rc如上所定义。
从下面的详细描述，本发明的上述和其他目的、特征和优点将变得更加显而易见，所述详细描述参考附图来进行，其中至少某些附图以全彩色的形式提交。
附图说明
图1A和1B示出了推断的质子提取，其分别导致从高半胱氨酸和半胱氨酸的硫自由基形成α-氨基烷基自由基。
图2包括了在成环的环的碳-1或碳-3处带有取代基的[c]型成环的氧杂蒽的通用化学结构，其中R是-OH或-N(CH3)2，R'是氧或-N(CH3)2 +，并且R''是氢或低级烷基。
图3示出了单桥接的邻位、间位和对位双香豆素紫精类似物的能量最小化结构和π-π堆叠。
图4是谷胱甘肽和对位双香豆素紫精的超分子组装体的能量最小化结构。
图5是反应路线，其示出了本公开的具有通式（iv）的化学结构的染料的某些实施方式的合成。
图6是反应路线，其示出了本公开的具有通式（iii）的半萘并荧光素化学结构的染料的某些实施方式的合成。
图7是反应路线，其示出了本公开的具有通式（iii）的对甲氨基酚或罗丹明化学结构的染料的某些实施方式的合成。
图8是反应路线，其示出了本公开的具有通式（iv）的化学结构的染料的一种实施方式的合成。
图9是反应路线，其示出了本公开的具有通式（vi）和（viii）-（xi）的化学结构的染料的某些实施方式的合成。
图10是反应路线，其示出了本公开的具有通式（v）和（vii）的化学结构的染料的某些实施方式的合成。
图11是反应路线，其示出了本公开的具有通式（i）的化学结构的染料的某些实施方式的合成，其中X1是Si(CH3)2、Ge(CH3)2或Sn(CH3)2。
图12是反应路线，其示出了本公开的具有通式（i）的化学结构的染料的某些实施方式的合成，其中X1是S或Se。
图13是反应路线，其示出了本公开的具有通式（iii）的双硼酸化学结构的染料的某些实施方式的合成。
图14是反应路线，其示出了本公开的具有通式（iv）的双硼酸化学结构的染料的某些实施方式的合成。
图15是反应路线，其示出了本公开的NIR染料-紫精结合物的一种实施方式的合成。
图16是反应路线，其示出了本公开的NIR染料-紫精结合物的另一种实施方式的合成。
图17-19分别示出了单桥接的邻位、间位和对位双对甲氨基酚紫精类似物的能量最小化结构。
图20示出了本公开的染料的一种实施方式与谷胱甘肽的分子相互作用。
图21示出了本公开的染料的两种实施方式与S-Ado（左侧）和SAICAr（右侧）的分子相互作用。
图22是本公开的染料的一种实施方式的x-射线结构。
图23是本公开的染料的两种实施方式在其二价阴离子和单价阴离子状态下的一系列吸收光谱。
图24是本公开的染料的两种实施方式在其中性和阴离子形式下的一系列吸收光谱。
图25是本公开的染料的两种实施方式在其中性和阴离子形式下的一系列吸收光谱。
图26是本公开的染料的一种实施方式在其酚和苯氧化物形式下的一系列吸收光谱。
图27是本公开的染料的一种实施方式在其酚和苯氧化物形式下的一系列吸收光谱。
图28是本公开的染料的两种实施方式在其阳离子形式下的一系列吸收光谱。
图29是本公开的染料的一种实施方式的一系列pH滴定曲线。
图30是本公开的染料的一种实施方式在缓冲液中和在含5%全血的缓冲液中的一系列光谱。
图31A是本公开的染料的一种实施方式在10%全血中的吸收光谱。
图31B是本公开的染料的一种实施方式在10%和90%全血中的一系列发射光谱。
图32是一系列吸收光谱，其示出了离子化对本公开的染料的数种实施方式的吸收最大值的影响。
图33示出了本公开的染料的一种实施方式的分子内氢键网络。
图34是分子模拟，其示出了对于本公开的染料的一种实施方式来说，氢键键合增强稠合环系统的同面性，其在去质子化后降低。
图35a-f是罗丹明双硼酸的两种实施方式及其相应前体的吸收和荧光光谱。在1:9的DMSO：缓冲液（图35a-c）和1:1的DMSO：缓冲液（图35d-f）中获得光谱。
图36是罗丹明双硼酸的两种实施方式及其相应前体的一系列DMSO滴定曲线；pH7.4的磷酸盐缓冲液的终浓度为12.5mM。
图37a-d是罗丹明双硼酸的一种实施方式对各种糖做出响应的吸光度和荧光光谱。图37a是所述化合物（3.75μM）对1:9的DMSO：缓冲液中的10mM糖做出响应的吸收和发射光谱；图37b是荧光发射（激发580nm/发射660nm）随1:9的DMSO：缓冲液中的糖浓度的变化；图37c是所述化合物（3.75μM）对1:1的DMSO：缓冲液中的10mM糖做出响应的吸收和发射光谱；图37d是荧光发射（激发580nm/发射640nm）随1:1的DMSO：缓冲液中的糖浓度的变化。pH7.4的磷酸盐缓冲液的终浓度为12.5mM。
图38a-d是罗丹明双硼酸的一种实施方式对各种糖做出响应的吸光度和荧光光谱。图38a是所述化合物（7.5μM）的吸收（630nm）光谱随1:9的DMSO：缓冲液中的糖浓度的变化；图38b是所述化合物（7.5μM）的荧光（激发630/发射690nm）光谱随1:9的DMSO：缓冲液中的糖浓度的变化；图38c是所述化合物（7.5μM）的吸收（640nm）光谱随1:1的DMSO：缓冲液中的糖浓度的变化；图38d是所述化合物（7.5μM）的荧光（激发640/发射700nm）光谱随1:1的DMSO：缓冲液中的糖浓度的变化；pH7.4的磷酸盐缓冲液的终浓度为12.5mM。
图39示出了在核糖与罗丹明双硼酸化合物的一种实施方式之间形成的复合物的一种实施方式的能量最小化结构。
图40示出了在两分子果糖与罗丹明双硼酸化合物的一种实施方式之间形成的复合物的一种实施方式的能量最小化结构。
具体实施方式
本申请公开了用于选择性检测被分析物的化合物的实施方式。所述化合物包含桥接的紫精骨架并可以包含至少一个荧光团。本申请还公开了用于执行所述检测的方法和试剂盒的实施方式。当与溶液中的一种或多种被分析物反应时，本公开的化合物的实施方式在所述溶液的吸收光谱和/或发射光谱中产生可检测的变化。在某些实施方式中，所述化合物包含能够产生在近红外区中的某一波长处具有最大值的发射光谱的荧光团，即近红外（NIR）染料。包含近红外荧光团部分的化合物的某些实施方式表现出所需特性的组合，所述特性包括（i）相对低的分子量，（ii）水溶性，和/或（iii）来自于它们的荧光中性和阴离子形式的双重激发和发射。重要的是，苯并成环和可离子化部分的区域选择性化学的系统性变化（iv）向NIR发射提供了可调节的深红并（v）提供了增加的斯托克斯位移。有利的是，本公开的化合物的特定实施方式在来自于体液例如血或尿的干扰范围之外的波长处产生发射光谱最大值，使所述化合物适用于直接检测生物流体中的被分析物。
I.术语和定义
提供了对术语和缩写的以下解释以更好地描述本公开，并在本公开的实践中指导本领域普通技术人员。当在本文中使用时，“包含”意味着“包括”，并且单数形式包括复数指称物，除非上下文明确表明不是如此。术语“或”是指所陈述的可选要素中的单个要素或两个或更多个要素的组合，除非上下文明确表明不是如此。
除非另有解释，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但下面描述了适合的方法和材料。材料、方法和实例仅仅是说明性的而不打算是限制性的。从下面的详细描述和权利要求书，本公开的其他特征将变得显而易见。
除非另有指明，否则说明书或权利要求书中使用的表示组分、分子量、百分率、温度、时间等的量的所有数字应该被理解为被术语“约”修饰。因此，除非另有隐含或明确的指示，否则所列出的数值参数是近似值，其可能取决于所寻求的目标性质和/或在标准试验条件/方法下的检测限。当直接或明确地将实施方式与所讨论的现有技术区分开时，除非用单词“约”叙述，否则实施方式的数字不是近似值。
化学中常用术语的定义可以在由John Wiley&Sons,Inc.于1997年出版的Richard J.Lewis,Sr.主编的《Hawley简明化学词典》（Hawley’sCondensed Chemical Dictionary）（ISBN0-471-29205-2）中找到。
为了便于综述本公开的各种实施方式，提供了对特定术语的以下解释：
吸光度：化合物或物质对入射在其上的某些波长的辐射的扣留；当光穿过化合物或物质或穿过化合物或物质的溶液时，被吸收的特定波长处的光的量的度量。
术语脂族是指具有分支或未分支的碳链。所述链可以是饱和的（全都具有单键）或不饱和的（具有一个或多个双键或叁键）。
烷基是指具有饱和碳链的烃基。所述链可以是分支或未分支的。术语低级烷基是指所述链包含1-10个碳原子。
类似物或衍生物是从相似化合物衍生的化合物或可以被想象为从另一种化合物产生的化合物，例如如果一个原子被另一个原子或原子团替代。类似物可能彼此相差一个或多个原子、官能团或子结构，其可以被其他原子、基团或子结构替代。
增环/成环是向一个环状结构或环结构添加另一个环状结构或环结构以形成多环或成环的化合物的化学反应。根据新添加的环的位置，成环可以被分类为[a]型、[b]型或[c]型。[a]型是指“向下成环”，[b]型是指“横向成环”，[c]型是指“向上成环”，如下所示：
Figure BDA0000466054340000171
当在本文中使用时，术语“成环的”是指具有环或环状区段或由其构成。术语“苯并成环的”是指环状化合物（通常为芳香族）的衍生物，所述环状化合物被稠合到苯环。苯并成环的化合物的实例包括苯并芘、喹啉、萘醌、萘并荧光素、罗丹明和氧杂蒽等。
芳香族或芳基化合物通常是不饱和的环状烃，其具有交替的单键和双键。含有三个叁键的6碳环苯是典型的芳香族化合物。
长移是分子的吸收、反射、透射或发射光谱中的光谱带位置向更长波长或更低频率变化。长移通常被称为“红移”。长移可以出现在具有不同取代和/或取代模式的一系列结构相关的分子的光谱中。环境例如溶剂极性的变化也能产生长移。
结合物：与第二单元偶联的第一单元。当在本文中使用时，术语“结合物”是指一个分子共价键合于另一个分子。
香豆素：具有下面的通用结构的苯并吡喃酮：
Figure BDA0000466054340000172
当在本文中使用时，“取代的香豆素”是指包含一个或多个取代基的香豆素。适合的取代基可以包括取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烷氧基、低级烷基羰基、取代或未取代的氨基、卤素和羟基。在某些实施方式中，香豆素在3-和/或7-位被例如低级烷基、低级烷基羰基、低级烷氧基、氨基或取代的氨基取代。
检测：确定例如样品中是否存在试剂（例如靶分子）。“检测”是指确定某物是否存在，例如确定生物样品中是否存在靶分子的任何方法。例如，“检测”可以包括使用目测装置或机械装置确定样品是否显示出特定的特性。
发射或发射信号是指从光源产生的特定波长的光。在特定实施例中，在荧光团吸收处于其激发波长处的光之后，从所述荧光团发射出发射信号。
激发或激发信号是指将电子跃迁激发到更高能级所必需和/或足以做到这一点的特定波长的光。在特定实施例中，激发信号是将荧光团激发到某种状态所必需和/或足以做到这一点的特定波长的光，在所述状态下，所述荧光团发射与来自于所述激发信号的光的波长不同（例如更长）波长的光。
荧光是原子或分子从较高电子态穿到较低电子态时发射的可见辐射，其中能量的吸收和发射之间的时间间隔为10-8至10-3秒。当在本文中使用时，当原子或分子从激发源（例如产生190-850nm波长范围内的光的灯）吸收能量，然后将能量作为可见和/或近红外辐射发射时，产生荧光。
荧光团或产荧光团是能够产生荧光的化合物，例如荧光染料。术语“荧光团”还指分子的引起所述分子在暴露于激发源时发荧光的部分。
官能团是分子内为所述分子的特征性化学反应负责的特定原子团。示例性官能团包括但不限于烷烃、烯烃、炔烃、芳烃、卤素（氟、氯、溴、碘）、环氧化物、羟基、羰基（酮）、醛、碳酸酯、羧酸化物、醚、酯、过氧基、氢过氧基、羧酰胺、胺（伯、仲、叔）、铵、酰亚胺、叠氮化物、氰酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、硝酸酯、亚硝酸酯、腈、硝基烷烃、亚硝基、吡啶基、磷酸酯、磺酰基、硫化物、硫醇（巯基）、二硫化物。
杂芳基化合物是具有至少一个杂原子的芳香族化合物，即环中的一个或多个碳原子已被具有至少一对孤对电子的原子，通常为氮、氧或硫替代。
亚氨基是指式=NH的官能团。
亚胺离子是指质子化或取代的亚胺，例如=NH2 +或(=NRARB)+，其中RA和RB表示烷基或取代的烷基。当在本文中使用时，(=NRARB)+被称为烷基亚胺离子基团。
MIP：分子印迹聚合物。
近红外（NIR）是可见区与红外区之间的电磁波谱区。对于近红外区的边界没有设定的定义，但是定义包括650-2500nm、750-2500nm、780-2500nm、800-2500nm、700-1400nm或780-3000nm的波长范围。当在本文中使用时，NIR通常是指700-1400nm的波长区域。
对甲氨基酚是荧光素与罗丹明的结构杂合体。罗丹明是一类相关的荧光酮染料。荧光素、罗丹明和两种对甲氨基酚类似物的结构如下所示。
Figure BDA0000466054340000191
Figure BDA0000466054340000201
SNAFL：半萘并荧光素
SNAFR：半萘并荧光酮
SNARF：半萘并罗丹荧光素
斯托克斯位移是指相同电子跃迁的吸收光谱最大值与发射光谱最大值之间的差（采用波长或频率单位）。通常，最大荧光发射的波长长于激发的辐射的波长，即最大吸收的波长。
取代基是作为反应的结果而替代分子中的另一个原子的原子或原子团。术语“取代基”通常是指替代母体烃链或环上的氢原子的原子或原子团。
取代的：基本化合物例如芳基或脂族化合物或其自由基具有与其偶联的、通常替代氢原子的第二取代基。例如，取代的芳基化合物或取代基可以具有偶联到芳基的闭合环的脂族基团，例如甲苯。同样地，仅仅作为实例而不是限制，长链烃可以具有与其键合的取代基，例如一个或多个卤素、芳基、环状基团、杂芳基或杂环基。
氧杂蒽是式C13H10O的有机杂环化合物。
氧杂蒽衍生物被称为氧杂蒽类，并包括荧光素、罗丹明及其衍生物。II.代表性实施方式的概述
本申请公开了选择性检测缓冲溶液和/或生物介质中的被分析物的荧光团-紫精结合物的实施方式。本申请还公开了用于执行所述检测的方法和试剂盒的实施方式。当与溶液中的一种或多种被分析物反应时，本公开的化合物的实施方式在所述溶液的吸收光谱和/或发射光谱中产生可检测的变化。
本公开的化合物的实施方式具有本文中描述的式I、式II或式III的结构。在某些实施方式中，RA和RB中的至少一个是具有本文中描述的通式（iii）、（iv）、（v）、（vi）、（vii）、（viii）、（ix）、（x）或（xi）的结构的荧光团，其中R1-R22中的至少一个是将荧光团共价结合到紫精骨架的连接基，并且其中如果荧光团具有通式（iii）的结构，则R1和R8中的至少一个不是氢或R13不是–COOR14。在任何或所有上述实施方式中，R13可以是连接基并且是式–COO–的连接基。
在任何或所有上述实施方式中，RA和RB两者都可以是独立地具有按照通式（i）、（iii）、（iv）、（v）、（vi）、（vii）、（viii）、（ix）、（x）或（xi）选择的结构的荧光团。在某些实施方式中，RA和RB具有相同的结构。
在任何或所有上述实施方式中，RA和RB中的一个可以是通式（i）、（iii）、（iv）、（v）、（vi）、（vii）、（viii）、（ix）、（x）或（xi）的荧光团，并且RA和RB中的另一个可以是低级烷基腈、低级烷基取代的苯基、烯基、炔基、取代的香豆素、缩醛或羧酸化物基团。在某些实施方式中，RA和RB中的另一个是
Figure BDA0000466054340000211
Figure BDA0000466054340000212
在任何或所有上述实施方式中，X1可以是氧。在任何或所有上述实施方式中，RA和RB中的至少一个可以是具有通式（i）的结构的荧光团，其中R13是–COO–并形成内酯环，并且R1-R12中的至少一个是连接基。在任何或所有上述实施方式中，RA和RB中的至少一个可以是具有通式（iii）、（iv）、（v）、（vi）、（vii）、（viii）、（ix）、（x）或（xi）的结构的荧光团，其中R13是–COO–并形成内酯环，并且R1-R12或R15-R22中的至少一个是连接基。在任何或所有上述实施方式中，化合物可以包含至少一个与可离子化部分相邻布置的卤素原子。
在任何或所有上述实施方式中，通式（i）、（iii）、（iv）、（v）、（vi）、（vii）、（viii）、（ix）、（x）或（xi）的荧光团可以在大于或等于700nm的波长处具有发射光谱最大值，例如大于或等于750nm的发射光谱最大值。在任何或所有上述实施方式中，通式（i）、（iii）、（iv）、（v）、（vi）、（vii）、（viii）、（ix）、（x）或（xi）的荧光团可以具有大于或等于80nm、例如大于或等于100nm的斯托克斯位移。
在任何或所有上述实施方式中，荧光团可以具有通式（iii）、（iv）、（ix）或（x）的结构，其中X1是氧，并且R18是卤素、羟基、硫醇、氨基、烷基氨基或烷氧基。在任何或所有上述实施方式中，荧光团可以具有通式（vi）的结构，其中R17是卤素、羟基、硫醇、氨基、烷基氨基或–NHRc，并且R20是氧、硫、亚氨基、亚胺离子、烷基亚胺离子或-NHRc。
在任何或所有上述实施方式中，荧光团可以具有通式（iv）的结构，其中X1是氧，并且R19是羟基、硫醇、氧、亚氨基、亚胺离子、烷基亚氨基、烷基亚胺离子、氨基或烷基氨基。在某些实施方式中，R18是卤素、羟基、硫醇、氨基、烷基氨基或烷氧基。在任何或所有上述实施方式中，荧光团可以具有通式（iii）的结构，其中X1是氧，并且R6和R16是–NHRc，或者荧光团可以具有通式（iv）的结构，其中X1是氧，并且R16和R21是–NHRc。
用于检测被分析物的方法包括通过将包含被分析物的样品与任何或所有上述实施方式的化合物合并来形成溶液，允许所述溶液中被分析物与化合物之间的反应进行有效的时间段，以在溶液的吸收光谱、发射光谱或两者中产生可检测的变化，其中所述变化指示存在所述被分析物，以及检测所述变化。
在任何或所有实施方式中，检测所述变化可以包括在所述反应已进行有效的时间段后，在一个或多个波长处检测溶液的吸光度的变化。在任何或所有实施方式中，检测所述变化可以包括将在将样品与化合物合并后第一时间时所述溶液的吸收光谱，与所述反应已进行有效的时间段后所述溶液的吸收光谱进行比较。在任何或所有实施方式中，检测所述变化可以包括将在将样品与化合物合并后第一时间时所述溶液的发射光谱，与所述反应已进行有效的时间段后所述溶液的发射光谱进行比较。在任何或所有实施方式中，检测所述变化可以包括将在与化合物反应之前所述溶液的颜色，与在与化合物反应有效的时间段后所述溶液的颜色进行比较。
在任何或所有实施方式中，检测所述变化可以包括将溶液暴露于光源，以及通过检测来自于化合物的荧光来检测被分析物。在某些实施方式中，光源具有190nm至850nm范围内的波长。在某些实施方式中，检测来自于化合物的荧光包括在反应已进行有效的时间段后，检测与化合物的发射光谱最大值相对应的波长处的荧光。化合物可以在大于或等于700nm、例如大于或等于750nm的波长处具有发射光谱最大值。在某些实施方式中，方法还包括通过在与化合物的发射光谱最大值相对应的波长处测量来自于化合物的荧光的量，对被分析物进行定量。
在任何或所有上述实施方式中，样品可以是生物流体。在某些实施方式中，生物流体包含血或尿。在任何或所有上述实施方式中，被分析物可以是半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽或其组合。
在任何或所有上述实施方式中，被分析物可以是半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷、或琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷与琥珀酰基腺苷的组合。在这样的实施方式中，化合物可以包括至少一个通式（vi）的荧光团，其中X1是O、S、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、CH2或NH；R1、R4、R5和R8独立地是氢、羟基、硫醇、低级烷基、羧基烷基、氨基、取代的氨基、烷氧基或卤素；R9-R12独立地是氢、烷基、酰基、羧基、硝基、氨基、烷基氨基或-SO3H；R13是氢、羟基、低级烷基、低级烷氧基、–SO3H或–COOR14，其中R14是氢或低级烷基，并且环B中描绘成“------”的键是双键，或者R13是与环B和环D形成环系统的一个或多个原子并且环B中描绘成“------”的键是单键；R15-R18独立地是氢、卤素、羟基、硫醇、氨基、烷基氨基、烷氧基或–NHRc；R19-R22独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、氧、亚氨基、亚胺离子、烷基亚氨基、烷基亚胺离子、氨基、烷基氨基或–NHRc；并且R1、R4、R5、R8-R13、R15、R16、R18、R19、R21或R22中的至少一个是将荧光团共价结合到紫精骨架的连接基。在某些实施方式中，R13是连接基并且是式–COO–的连接基。在某些实施方式中，被分析物是谷胱甘肽，R17是羟基、氨基或烷基氨基，并且R20是氧、羟基、氨基、烷基氨基、亚氨基或烷基亚胺离子。在某些实施方式中，被分析物是琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷或其组合，R17和R20中的至少一个是–NHRc，R13是-COOR14，其中R14是氢或低级烷基，并且R9、R10、R11或R12中的一个是连接基。在某些实施方式中，被分析物是琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷或其组合，并且化合物包含至少一个通式（iii）的荧光团，其中X1是氧并且R6和R16是–NHRc，或者化合物包含至少一个通式（iv）的荧光团，其中X1是氧并且R16和R21是–NHRc。
用于检测被分析物的试剂盒的实施方式包括任何或所有上述实施方式的至少一种化合物，其中所述化合物当与包含被分析物的样品合并时，与不包含所述被分析物的样品中的化合物相比，会发生吸收光谱和/或发射光谱的变化。在某些实施方式中，样品是生物流体。在任何或所有上述实施方式中，试剂盒还可以包括至少一种缓冲溶液，在所述缓冲溶液中，所述化合物当与包含被分析物的样品合并时，与当与缓冲溶液和不包含所述被分析物的样品合并时的化合物相比，会发生吸收光谱和/或发射光谱的变化。
在任何或所有上述实施方式中，被分析物可以是谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷、或琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷与琥珀酰基腺苷的组合。在某些实施方式中，试剂盒中的化合物包括至少一个本文中描述的通式（vi）的荧光团。在某些实施方式中，试剂盒中的化合物包括至少一个本文中描述的通式（iii）的荧光团，其中X1是氧并且R6和R16是–NHRc，或者试剂盒中的化合物包括至少一个本文中描述的通式（iv）的荧光团，其中X1是氧并且R16和R21是–NHRc。
在任何或所有上述实施方式中，试剂盒可以包括用于评估由化合物与被分析物之间的反应产生的颜色变化的颜色对比图。在任何或所有上述实施方式中，试剂盒可以包括多个一次性容器，化合物与被分析物之间的反应可以在所述容器中进行。在某些实施方式中，在所述多个一次性容器中预先称量在与被分析物反应时有效地发生吸收光谱、发射光谱或两者的可检测变化的量的化合物。
III.荧光团-紫精结合物
本文中公开了选择性检测缓冲溶液和/或生物介质中的被分析物的荧光团-紫精结合物的实施方式。示例性的被分析物包括硫醇（例如半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）和/或谷胱甘肽（GSH））、琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷或其组合。本公开的荧光团-紫精结合物的实施方式包括至少一个与桥接的紫精结合的荧光团部分。在某些实施方式中，荧光团能够产生在近红外区中的某一波长处具有发射最大值的发射光谱。当在本文中使用时，术语“桥接的紫精”是指一种化合物，所述化合物的中心部分包含被键合到共同结构要素或桥例如二甲基苯环的两个紫精部分。可以将各种取代基连接于紫精部分的游离端，形成具有各种性质的桥接的紫精化合物。在某些实施方式中，结合物与缓冲溶液和/或生物流体中的被分析物反应，产生有色产物和/或发生吸收光谱和/或发射光谱的变化。产物形成和/或光谱差异可以通过目测或光谱学方法例如UV-可见光或荧光光谱术来监测。在特定实施方式中，荧光团-紫精结合物对于Cys、Hcy和GSH中的一个或多个具有选择性。在其他实施方式中，荧光团-紫精结合物对琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷或其组合具有选择性。选择性可以通过形成更强颜色的产物和/或不同颜色的产物来证实。选择性也可以通过含有桥接的紫精和被分析物的溶液的吸收光谱和/或发射光谱的可检测的变化，或通过含有荧光团-紫精结合物和被分析物的溶液在一个或多个波长处的吸光度和/或荧光发射的可检测变化来证实。在某些实施方式中，温度和/或缓冲液组成影响特定荧光团-紫精结合物的选择性。测定可以是定性的（例如监测反应前后颜色的目测变化或通过监测反应前后吸收光谱和/或发射光谱的变化）或定量的（例如测量在一个或多个特定波长处吸光度或发射的变化）。
荧光团-紫精结合物是通式I、II或III的化合物：
Figure BDA0000466054340000261
Figure BDA0000466054340000271
其中X是任何平衡阴离子，RA和RB是取代基，并且RA和RB中的至少一个是基于成环的氧杂蒽结构的荧光团。在某些实施方式中，每个X-独立地是卤化物或PF6 -。特别令人感兴趣的是在近红外区中的某一波长处具有发射光谱最大值的荧光团，即近红外（NIR）荧光团。在某些实施方式中，正如本文中公开的，RA和RB是相同的。然而，在其他实施方式中，RA和RB可以独立地进行选择。其他适合的RA和RB取代基包括取代和未取代的脂族基团，例如取代和未取代的烷烃、烯烃或炔烃，包含一个或多个取代或未取代的芳香环和/或杂芳环的芳基或杂芳基，特别是低级脂族基团、芳基或杂芳基取代基，其中取代的低级脂族基团、芳基或杂芳基取代基包括一个或多个官能团，所述官能团包括羟基、巯基、腈、酰胺、羟基、含羰基基团例如酮、醛和羧基。在某些实施方式中，RA和RB中的一个是NIR荧光团，并且RA和RB中的另一个是低级烷基腈、低级烷基取代的苯基、烯基、炔基、取代的香豆素（例如在3-位被低级烷基或低级烷基羰基取代和/或在7-位被低级烷基、低级烷氧基、氨基或取代的氨基取代的香豆素）、缩醛或羧酸化物基团。在某些实施方式中，RA和RB中的另一个是
Figure BDA0000466054340000281
本公开的荧光团的实施方式是基于成环的氧杂蒽结构的NIR染料。与结构相关的类似物相比，本公开的NIR荧光团的一些实施方式表现出明显的长移和增加的斯托克斯位移。在某些实施方式中，NIR荧光团是具有单或双成环的苯并成环的氧杂蒽。成环可以是[a]型–向下、[b]型–横向或[c]型–向上。与可商购的NIR荧光团即NIR染料相比，单或双成环的NIR荧光团的至少一些实施方式具有明显红移的吸收和发射光谱。在某些实施方式中，光谱至少红移100nm。特别是，本公开的NIR荧光团的某些实施方式具有大于700nm的发射最大值。在某些实施方式中，发射最大值完全在近红外区中，例如大于700nm、大于750nm以及甚至大于780nm。相比较而言，一些已知的成环的氧杂蒽的发射最大值接近于560nm（完全苯并成环的二苯并荧光素）、630nm（SNAFL）、650nm（SNARF）、670nm（萘并荧光素）或650-675nm（二苯并罗丹明）。在某些实施方式中，吸收最大值大于600nm、大于650nm、大于675nm以及甚至大于800nm。
与已知的长波长氧杂蒽相比，NIR荧光团的某些实施方式还显示出增加的斯托克斯位移。在某些实施方式中，斯托克斯位移（相同电子跃迁的吸收光谱最大值与发射光谱最大值之间的差）大于50nm、大于80nm、大于100nm或大于150nm，例如50-200nm、50-150nm、80-150nm、90-170nm、100-150nm或100-200nm。大的斯托克斯位移是有利的，因为它便于利用相对宽谱带的光源例如发光二极管，所述光源在所测量的发射波长处具有来自于光源的极小的散射光干扰。
A.荧光团结构
在某些实施方式中，荧光团是具有通式（i）的结构的NIR荧光团。
Figure BDA0000466054340000291
在通式（i）中，每个描绘成“------”的键根据需要是单键或双键，以满足化合价要求；X1是O、S、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、CH2、C(CH3)2、或NH。R1、R2和R4独立地是氢、羟基、氧、硫醇、低级烷基、羧基烷基、氨基、取代的氨基、烷氧基、卤素或–NHRc，其中Rc是
Figure BDA0000466054340000292
R5、R7和R8独立地是氢、羟基、硫醇、低级烷基、羧基烷基、氨基、取代的氨基、烷氧基或卤素；R3和R6独立地是氢、羟基、卤素、氧、硫、硫醇、氨基、烷基氨基、亚氨基、亚胺离子、烷基亚氨基、烷基亚胺离子、环烷基亚氨基或–NHRc，其中Rc如上所定义；并且R1与R2、R2与R3、R3与R4、R5与R6、R6与R7和/或R7与R8中的至少一组一起形成取代或未取代的环烷基或芳基。R9-R12独立地是氢、烷基、酰基、羧基、硝基、氨基、烷基氨基或-SO3H。R13是氢、羟基、低级烷基、低级烷氧基、–SO3H或–COOR14，其中R14是氢或低级烷基，并且环B中描绘成“------”的键是双键，或者R13是与环B和环D形成环系统的一个或多个原子并且环B中描绘成“------”的键是单键。
R1-R13中的至少一个是将荧光团共价结合到桥接的紫精骨架的连接基部分。适合的连接基包括低级烷基、烷氧基、羧酸化物、烷基羧酸化物、氨基和取代的氨基，以及聚氨基和聚(氧化烯烃)链。在特定实施方式中，R13是连接基并且是式–COO–的连接基。在某些实施方式中，R4或R5是连接基并且是低级烷基(-CH2-)n，其中n是1至10的整数。在其他实施方式中，连接基是由R1与R2、R2与R3、R3与R4、R5与R6、R6与R7或R7与R8形成的取代的环烷基或芳基上的低级烷基、烷氧基、羧酸化物、烷基羧酸化物、氨基、取代的氨基、聚氨基或聚(氧化烯烃)基团。
在某些实施方式中，R13是–COO–并形成通式(ii)中所示的内酯环。
Figure BDA0000466054340000301
在某些实施方式中，R3与R4和/或R5与R6一起形成通式（iii）和（iv）中所示的芳基环或取代的芳基环。
Figure BDA0000466054340000302
其中每个描绘成“------”的键根据需要是单键或双键，以满足化合价要求。R1-R14和X1如对通式（i）和（ii）所定义的。R15-R22独立地是氢、卤素、羟基、氧、硫醇、氨基、烷基氨基、烷氧基例如低级烷氧基、硫、亚氨基、亚胺离子、烷基亚氨基、烷基亚胺离子或–NHRc，其中Rc如上所定义。R1、R2、R5（如果存在）、R6（如果存在）、R7、R8、R9-R13、R15-R18或R19-R22（如果存在）中的一个是将NIR荧光团共价结合到桥接的紫精骨架的连接基部分。在某些实施方式中，X1是氧，R1、R2、R5、R7和R8独立地是氢、卤素或连接基部分；R6是氧、亚氨基、亚胺离子、低级烷基亚胺离子或–NHRc，其中Rc如上所定义；R9-R12独立地是氢、氨基、低级烷基、羧基、-SO3H或连接基部分；R15、R17、R20和R22独立地是氢或连接基部分；R13是氢、低级烷基、低级烷氧基、-SO3H、连接基部分或-COOR14，其中R14是氢或低级烷基并且环B中描绘成“------”的键是双键，或者R13是与环B和环D形成环系统的一个或多个原子并且环B中描绘成“------”的键是单键；R16和R18独立地是氢、羟基、氧、低级烷氧基、氨基、烷基氨基、其中Rc如上所定义的–NHRc、或连接基部分，并且R16和R18中的至少一个不是氢；R19和R21独立地是氧、亚氨基、亚胺离子、低级烷基亚胺离子、其中Rc如上所定义的–NHRc、或连接基部分，并且R19和R21中的至少一个不是氢。在某些实施方式中，X1是氧，R1、R2、R5、R8、R9、R12、R15、R17、R20和R22独立地是氢或连接基部分；R6是氧、亚氨基、亚胺离子、低级烷基亚胺离子或–NHRc，其中Rc如上所定义；R7是氢、卤素或连接基部分；R10和R11独立地是氢、氨基、低级烷基、羧基、-SO3H或连接基部分；R13是氢、低级烷基、低级烷氧基、-SO3H、连接基部分或-COOR14，其中R14是氢或低级烷基，并且环B中描绘成“------”的键是双键，或者R13是与环B和环D形成环系统的一个或多个原子并且环B中描绘成“------”的键是单键；R16和R18独立地是氢、羟基、氧、低级烷氧基、氨基、烷基氨基、其中Rc如上所定义的–NHRc、或连接基部分，并且R16和R18中的至少一个不是氢；R19是氢、羟基、氧、亚氨基、亚胺离子、低级烷基亚胺离子、其中Rc如上所定义的–NHRc、或连接基部分；R21是氢、氧、其中Rc如上所定义的-NHRc、或连接基部分，并且R19和R21中的至少一个不是氢。在特定实施方式中，R5或R13是将荧光团共价结合到桥接的紫精骨架的连接基部分。表1中示出了通式（iii）和（iv）的代表性化合物。
表1
Figure BDA0000466054340000321
Figure BDA0000466054340000331
*未包括在表1中的一个R取代基是将NIR荧光团共价结合到紫精骨架的连接基；未包括在表1中的所有其他R取代基是氢，并且X1是氧。
Figure BDA0000466054340000332
形成内酯环。
在某些实施方式中，R2与R3和/或R6与R7一起形成通式（v）和（vi）中所示的芳基环或取代的芳基环。
Figure BDA0000466054340000333
其中每个描绘成“------”的键根据需要是单键或双键，以满足化合价要求，并且R1-R22和X1如上所定义。R1、R4、R5、R6（如果存在）、R7（如果存在）、R8-R13、R15-R18或R19-R22（如果存在）中的一个是将NIR荧光团共价结合到桥接的紫精骨架的连接基部分。在某些实施方式中，X1是氧，R1、R4、R5、R7和R8独立地是氢、卤素或连接基部分；
R6是氧、亚氨基、亚胺离子、低级烷基亚胺离子或-NHRc，其中Rc如上所定义；R9-R12独立地是氢、氨基、低级烷基、羧基、-SO3H或连接基部分；R15、R17、R19和R22是氢或连接基部分；R13是氢、低级烷基、低级烷氧基、-SO3H、连接基部分或-COOR14，其中R14是氢或低级烷基，并且环B中描绘成“------”的键是双键，或者R13是与环B和环D形成环系统的一个或多个原子并且环B中描绘成“------”的键是单键；R16、R17和R18中的至少一个是羟基、氧、氨基、烷基氨基、其中Rc如上所定义的–NHRc、或连接基部分；并且R19、R20和R21中的至少一个是氧、亚氨基、亚胺离子、低级烷基亚胺离子、其中Rc如上所定义的-NHRc、或连接基部分。在某些实施方式中，X1是氧，R1、R4、R5、R8、R9、R12、R15、R16、R18、R19、R21和R22是氢或连接基部分；R6是氧、亚氨基、亚胺离子、低级烷基亚胺离子或-NHRc，其中Rc如上所定义；R7是氢、卤素或连接基部分；R10和R11独立地是氢、氨基、低级烷基、羧基、-SO3H或连接基部分；R13是氢、低级烷基、低级烷氧基、-SO3H或-COOR14，其中R14是氢或低级烷基，或者R13是连接基部分；R17是羟基、氧、氨基、烷基氨基、其中Rc如上所定义的–NHRc、或连接基部分；并且R20是氧、亚氨基、亚胺离子、低级烷基亚胺离子、其中Rc如上所定义的–NHRc、或连接基部分。在特定实施方式中，R13是将荧光团共价结合到桥接的紫精骨架的连接基部分。表2中示出了通式（v）和（vi）的代表性化合物。
表2
Figure BDA0000466054340000341
*未包括在表2中的一个R取代基是将NIR荧光团共价结合到紫精骨架的连接基；未包括在表2中的所有其他R取代基是氢，并且X1是氧。
Figure BDA0000466054340000352
形成环。
在某些实施方式中，R1与R2和/或R7与R8一起形成通式（vii）和（viii）中所示的芳基环或取代的芳基环。
Figure BDA0000466054340000353
其中每个描绘成“------”的键根据需要是单键或双键，以满足化合价要求。通式（vii）中的R3-R18和X1如上所定义。通式（viii）中的R3-R5、R9-R22和X1如上所定义，并且R6是氢、羟基、氧、卤素、硫醇、氨基、烷基氨基或-NHRc，其中Rc如上所定义。R3-R6、R7（如果存在）、R8（如果存在）、R9-R13、R15-R18或R19-R22（如果存在）中的一个是将NIR荧光团共价结合到桥接的紫精骨架的连接基部分。在某些实施方式中，X1是氧，R3、R4、R5独立地是氢、卤素或连接基部分；R7和R8如果存在的话，独立地是氢、卤素或连接基部分；R9-R12独立地是氢、氨基、低级烷基、羧基、-SO3H或连接基部分；R15、R17、R19和R22独立地是氢或连接基部分；R13是氢、低级烷基、低级烷氧基、-SO3H、连接基部分或-COOR14，其中R14是氢或低级烷基，并且环B中描绘成“------”的键是双键，或者R13是与环B和环D形成环系统的一个或多个原子并且环B中描绘成“------”的键是单键；R16、R17和R18中的至少一个是羟基、氧、氨基、烷基氨基、其中Rc如上所定义的–NHRc、或连接基部分；R19、R20和R21中的至少一个是氧、亚氨基、亚胺离子、低级烷基亚胺离子、其中Rc如上所定义的–NHRc、或连接基部分；在通式（vii）中，R6是氧、亚氨基、亚胺离子、低级烷基亚胺离子或–NHRc，其中Rc如上所定义，并且在通式（viii）中，R6是氢或–NHRc，其中Rc如上所定义。在特定实施方式中，X1是氧，R3、R4、R5、R8（如果存在）、R9、R12、R15、R17、R18、R19、R20和R22独立地是氢或连接基部分；R7（如果存在）是氢、卤素或连接基部分；R10和R11独立地是氢、氨基、低级烷基、羧基、-SO3H或连接基部分；R13是氢、低级烷基、低级烷氧基、-SO3H、其中R14是氢或低级烷基的-COOR14、或连接基部分；R16是羟基、氨基、烷基氨基或连接基部分；R21是氧、亚氨基、亚胺离子、低级烷基亚胺离子或连接基部分；在通式（vii）中，R6是氧、亚氨基、亚胺离子、低级烷基亚胺离子或–NHRc，其中Rc如上所定义，或者在通式（viii）中，R6是氢或–NHRc，其中Rc如上所定义。在特定实施方式中，R13是将荧光团共价结合到桥接的紫精骨架的连接基部分。表3中示出了通式（vii）和（viii）的代表性化合物。
表3
Cpd R6* R7 R10 R11 R13 R16 R18 R19 R21
1a O H H H -OCH3 -OH H -- --
1b O H -CH3 H -CH3 -OH H -- --
1c O H H -COOH H -OH H -- --
1d O H H -NH2 H -OH H -- --
1e O H H H -SO3H -OH H -- --
1f O H -SO3H H -SO3H -OH H -- --
1g O F H H H -OH H -- --
1h =NH H -SO3H H -SO3H -NH2 H -- --
1i =N(CH3)2 + H H H H -OH H -- --
1j =N(CH3)2 + H H H H -N(CH3)2 H -- --
1k =N(CH3)2 + H -SO3H H -SO3H -N(CH3)2 H -- --
6a H -- -CH3 H -CH3 -OH H H =O
6b H -- -SO3H H -SO3H -OH H H =O
6c H -- -CH3 H -CH3 -NH2 H H =NH
6d H -- -CH3 H -CH3 -N(CH3)2 H H =N(CH3)2 +
6e H -- H -COOH H -OH H H =O
6f H -- H -COOH H -N(CH3)2 H H =N(CH3)2 +
36a H -- H -COOH -CH3 H -OH =O H
36b H -- H H -COOH H -OH =O H
36c H -- H -COOH -CH3 H -OH =N(CH3)2 + H
36d H -- H H -COOH H -OH =N(CH3)2 + H
*未包括在表3中的一个R取代基是将NIR荧光团共价结合到紫精骨架的连接基；未包括在表3中的所有其他R取代基是氢，并且X1是氧。
在某些实施方式中，NIR荧光团具有混合的成环，例如[a]型和[c]型、[a]型和[b]型、或者[b]型和[c]型。例如，在某些实施方式中，R3与R4一起形成芳基环或取代的芳基环，并且R7与R8一起形成芳基环或取代的芳基环，如通式（ix）中所示。在其他实施方式中，R3与R4一起形成芳基环或取代的芳基环，并且R6与R7一起形成芳基环或取代的芳基环，如通式（x）中所示。在其他实施方式中，R1与R2一起形成芳基环或取代的芳基环，并且R6与R7一起形成芳基环或取代的芳基环，如通式（xi）中所示。
Figure BDA0000466054340000371
其中每个描绘成“------”的键根据需要是单键或双键，以满足化合价要求。通式（ix）-（xi）中的R1-R5、R7-R22和X1如上所定义，并且R6是氢、羟基、氧、卤素、硫醇、氨基、烷基氨基或-NHRc，其中Rc如上所定义。R1-R4（如果存在）、R5、R6、R8（如果存在）、R9-R13或R15-R22中的一个是将NIR荧光团共价结合到桥接的紫精骨架的连接基部分。在某些实施方式中，X1是氧；R1-R6（如果存在）、R8（如果存在）、R9、R10、R12、R15、R17和R22独立地是氢或连接基部分；R11是氢、氨基、低级烷基、羧基、-SO3H或连接基部分；R13是氢、低级烷基、低级烷氧基、-SO3H、-COOR14，其中R14是氢或低级烷基，并且环B中描绘成“------”的键是双键，或者是连接基部分，或者R13是与环B和环D形成环系统的一个或多个原子并且环B中描绘成“------”的键是单键；R16、R17和R18独立地是氢、羟基、氧、低级烷氧基、氨基、烷基氨基、其中Rc如上所定义的-NHRc、或连接基部分，并且R16和R18中的至少一个不是氢；R19-R21独立地是氢、羟基、硫醇、氧、亚氨基、亚胺离子、烷基亚氨基、烷基亚胺离子、氨基、烷基氨基、其中Rc如上所定义的-NHRc、或连接基部分，并且R19-R21中的至少一个不是氢。在特定实施方式中，X1是氧；R1-R6（如果存在）、R8（如果存在）、R9、R10、R12、R15、R17和R22独立地是氢或连接基部分；R11是氢、羧基或连接基部分；R13是低级烷基、羧基或连接基部分；R16和R18独立地是氢、羟基、氧、其中Rc如上所定义的-NHRc、或连接基部分，并且R16和R18中的至少一个不是氢；R19-R21独立地是氢、氧、烷基亚胺离子、其中Rc如上所定义的-NHRc、或连接基部分，并且R19-R21中的至少一个不是氢。在特定实施方式中，R5或R13是将荧光团共价结合到桥接的紫精骨架的连接基部分。表4中示出了通式（ix）-（xi）的代表性化合物。
表4
Cpd R11* R13 R16 R18 R19 R20 R21
33a -COOH -CH3 H -OH H H =O
33b H -COOH H -OH H H =O
33c -COOH -CH3 H -OH H H =N(CH3)2 +
33d H -COOH H -OH H H =N(CH3)2 +
35a -COOH -CH3 H -OH =O H H
35b H -COOH H -OH =O H H
35c -COOH -CH3 H -OH =N(CH3)2 + H H
35d H -COOH H -OH =N(CH3)2 + H H
37a -COOH -CH3 H -OH H =O H
37b H -COOH H -OH H =O H
37c -COOH -CH3 H -OH H =N(CH3)2 + H
37d H -COOH H -OH H =N(CH3)2 + H
38a -COOH -CH3 -OH H H =O H
38b H -COOH -OH H H =O H
38c -COOH -CH3 -OH H H =N(CH3)2 + H
38d H -COOH -OH H H =N(CH3)2 + H
39a -COOH -CH3 -OH H =O H H
39b H -COOH -OH H =O H H
39c -COOH -CH3 -OH H =N(CH3)2 + H H
39d H -COOH -OH H =N(CH3)2 + H H
*未包括在表4中的一个R取代基是将NIR荧光团共价结合到紫精骨架的连接基；未包括在表4中的所有其他R取代基是氢，并且X1是氧。
B.对光谱和斯托克斯位移的结构性影响
基于结构的系统性评估令人吃惊地证实，单成环的氧杂蒽的成环的环上取代基位置的变化，使发射和吸收最大值显著红移。例如，在如图2中所示的某些实施方式中，通式（iii）的[c]型成环的氧杂蒽可以在成环的环的3-位（R16）或1-位（R18）处包含取代基。在工作实施方式中，据发现，将取代基布置在通式（iii）和（iv）中的1-位（R18）处以代替3-位（R16），使吸收光谱红移超过10nm，通常超过30nm或超过50nm，例如10-200nm、10-60nm、30-75nm、50-75nm、30-100nm或75-200nm。在某些实施方式中，3-1移位使发射光谱红移至少100nm，例如100-200nm、120-160nm或130-150nm。在某些实施方式中，当取代基位于1-位（通式（iii）和（iv）中的R18）处时，发射最大值出现在大于725nm、大于750nm或大于770nm处。在某些情况下，发射最大值是不可测量的，但是据信出现在大于850nm（在仪器的量程之外）处。同时也注意到斯托克斯位移的增加。在某些实施方式中，3-1移位将斯托克斯位移的数量增加大于50nm，例如50-100nm、70-90nm或70-100nm。
因此，3-1移位提供了数个优点。吸收和发射最大值两者都红移。由于发射光谱通常比吸收光谱具有更大的红移，因此斯托克斯位移增加。这种行为在对称（例如通式（iv））和不对称结构（例如通式（iii））中都出现，并且在各种可离子化基团（例如羟基和胺官能团）中都观察到。在某些实施方式中，将3-1移位与可离子化官能团的移位相组合，也提供了出人意料的pH响应。一些对甲氨基酚在高pH下吸收和发射长波长。然而，对于将3-1移位与可离子化部分移位相组合的本公开荧光团的某些实施方式来说，在酸性pH值下观察到长波长行为。
在某些实施方式中，具有3-1移位的荧光团的阴离子形式与所述荧光团的相应的中性形式相比，产生更大的红移。例如，与化合物20a相比，化合物15a的吸收最大值红移15nm。然而，与化合物20a的阴离子形式化合物20c相比，化合物15a的阴离子形式化合物15h的吸收最大值具有50nm的红移。图32是一系列UV-可见光光谱，其示出了离子化对本公开荧光团的某些实施方式的吸收光谱的影响。与化合物20c相比，化合物15h的发射波长的长移为130nm。这些迁移之间的差异产生760nm处的NIR发射，具有160nm的显著增加的斯托克斯位移。
在通式（iii）、（ix）和（x）的化合物中，R18与内部桥接氧之间存在贯穿空间的极性相互作用。在对称化合物例如通式（iv）的化合物的情形中，当R19是氧时，场效应进一步增强。在这样的化合物例如化合物8中，还存在独特的分子内氢键网络（图33）。这一网络在可离子化的氧原子上产生增强的负电荷密度，从而促进相对大的长移。分子模拟证实，氢键网络还增强稠合环系统的同面性，其在羟基去质子化时减小（图34）。在化合物例如化合物8中，氢键可以通过1H NMR波谱术看到。在化合物8的羟基质子、羰基与中心氧之间形成氢键后，在氢原子周围发生电子密度的重新分配。在化合物8中，模拟显示，在R19处的羰基与R18处的羟基之间的总氢键距离O---H-O为
Figure BDA0000466054340000401
其小于典型的氢键距离（≥
Figure BDA0000466054340000402
）并接近于对低阻挡氢键观察到的距离（
Figure BDA0000466054340000403
Figure BDA0000466054340000404
）。氢键形成的证据也在化合物15a中看到，但是程度较低。在化合物15a中，R18位处的羟基与氧杂蒽中心氧之间的总氢键距离O---H-O为
Figure BDA0000466054340000405
其落于常见氢键的范围内。在化合物8中移除共享质子以产生化合物8a，不引起当化合物22被去质子化成化合物22a时所观察到的吸收最大值的大的长移，因此提供了氢键网络对化合物例如8的特性的影响的进一步证据。令人吃惊的是，当化合物10被去质子化时，迁移是向蓝移的。
在某些实施方式例如化合物8中，在高达pH9下表现出氢键形成的化合物中观察到NIR荧光，而移除共享质子被观察到使荧光淬灭。值得注意的是，化合物7在低于7.4的生理pH下在1:9的DMSO：缓冲液中作为其相应的无色内酯存在，因此具体表现为独特的pH探针。
与罗丹明相比，具有通式（iii）或（iv）的化学结构的荧光团的某些实施方式具有更长的吸收和发射波长。在R16和R6（式（iii））或R21（式（iv））处具有–NHRc（硼酸）取代基的类似物，与在R16和R6/R21处具有–NH2的相应荧光团相比进一步红移。在不存在糖的情况下，硼酸可以通过PET（光诱导的电子转移）机制而被淬灭。在某些实施方式中，在糖结合后，对不对称（式（iii））和对称（式（iv））的双硼酸类似物两者都观察到长移和量子产率的增加。
在某些实施方式中，通式（i）的荧光团通过其下方的苯环而结合到桥接的紫精骨架。这样的结合可以通过将包括内酯环的荧光团（即R13=-COO-）结合到紫精骨架，由此使内酯环打开并与紫精骨架形成酯键来实现。
在这种几何结构中，下方的苯环可以起到间隔基的作用，并促进氧杂蒽的结合系统与联吡啶部分之间的分子内π-π相互作用。当荧光团被结合到紫精时，这些π-π相互作用使荧光团的荧光淬灭。在某些实施方式中，被分析物的存在破坏这些π-π相互作用，并恢复荧光团的荧光。
在其他实施方式中，通式（i）的荧光团通过其上方的氧杂蒽环中的一个而结合到紫精骨架。在下面的实例中，R5是如上所定义的连接基，并且荧光团在其R5位处结合到紫精骨架。
Figure BDA0000466054340000421
据假设，超分子组装体类型的机制可能参与在溶液中被分析物（例如谷胱甘肽）与桥接的紫精的某些实施方式之间的反应中观察到的吸收和/或发射（荧光）光谱变化。在某些实施方式中，结合到桥接的紫精骨架的荧光团失去其产荧光能力。据认为，紫精可以从荧光团接受电子，从而使荧光淬灭。例如，图3示出了邻位、间位和对位双香豆素类似物的能量最小化结构。每种结构证实了两个香豆素部分之间的π-π堆叠。然而，只有对位结构形成谷胱甘肽分子可以契合在其中的空腔。图4示出了由GSH和对位双香豆素类似物形成的可能的超分子组装体。据预期，GSH插入到空腔中将破坏π-π堆叠。此外，当桥接的紫精类似物在GSH分子周围折叠时，GSH分子中的负电荷区域可以与荧光团部分中的正电荷中心对齐，从而通过电荷转移机制恢复香豆素部分的产荧光能力。对于本公开的具有通式（i）-（xi）的结构的荧光团的某些实施方式，预期到类似的行为。在某些实施方式中，RA和RB两者都是荧光团，并且两个荧光团可以具有相同的化学结构或不同的化学结构。在其他实施方式中，RA和RB中的一个是荧光团，并且RA和RB中的另一个是取代和未取代的脂族基团，例如取代和未取代的烷烃、烯烃或炔烃，包含一个或多个取代或未取代的芳香环和/或杂芳环的芳基或杂芳基，特别是低级脂族基团、芳基或杂芳基取代基，其中取代的低级脂族基团、芳基或杂芳基取代基包括一个或多个官能团，所述官能团包括羟基、巯基、腈、酰胺、羟基、含羰基基团例如酮、醛和羧基。
IV.合成
如反应路线1（图5）中所示合成具有通式（iv）的化学结构的萘并荧光素类似物的某些实施方式。在某些实施方式中，类似物如下合成：通过1,8-二羟基萘和邻苯二甲酸在甲磺酸中的酸缩合来产生含内酯的化合物（化合物7）。将化合物7与乙酰氯在甲醇中反应以打开内酯环，从而将该化合物酯化并产生羧酸甲酯8；通过该结合系统中的电子密度重新分配，将一个羟基转变成氧。化合物8与碳酸钾和碘甲烷在二甲基甲酰胺中的进一步反应将剩余的羟基转变成甲氧基（化合物9）。在其他实施方式中，通式（iv）的类似物如下合成：通过1,8-二羟基萘与所需醛在磷酸中的酸缩合来产生具有代表性化合物10和11的结构的类似物。在某些实施方式中，将化合物10和11与碳酸钾和碘甲烷进一步反应以产生甲基类似物。
通过如反应路线2（图6）中示出的酸缩合来合成具有通式（iii）的化学结构的类似物。羟基二苯甲酮衍生物（化合物12）和1,8-萘衍生物（化合物13）通过在甲磺酸和三氟乙酸的1:1的混合物中进行反应而被缩合，以产生含内酯的化合物（化合物14）。化合物14与甲醇在硫酸中的进一步反应打开内酯环，由此将化合物该酯化并产生甲基酯（化合物15）；通过该结合系统中的电子重新分配，将化合物14转变成化合物15。或者，将化合物14与碳酸钾和碘甲烷反应以打开环，并产生化合物16。
如反应路线3（图7）中所示合成具有通式（iii）的化学结构的某些不对称的半萘并荧光素和罗丹明类似物。羟基二苯甲酮衍生物（化合物17）和萘酚衍生物（化合物18）在甲磺酸/三氟乙酸中通过酸缩合进行反应，以产生含内酯的化合物即化合物19。化合物19与甲醇在硫酸中的进一步反应产生化合物20。
通过反应路线4（图8）中示出的Fischer酯化，将可商购的含内酯的萘并荧光素类似物转变成其甲基酯。将萘并荧光素类似物（化合物21）溶解在甲醇中。加入硫酸，并将混合物回流24小时以产生化合物22。
如反应路线5（图9）中所示合成具有通式（vi）的化学结构的一些类似物和具有通式（viii）-（xi）的化学结构的一些不对称的扩展的共轭类似物。反应路线5中示出的方法包括通过Grignard反应形成叔甲醇无色母体，然后去保护并与BBr3缩合以产生相应的氧杂蒽染料。酮前体可以通过相应的甲氧基萘与苯甲酰氯或邻苯二甲酸酐在多磷酸存在下进行反应来合成（Gorelick等，Zhurnal Org.Kihimii,1983,19,199-206）。
如反应路线6（图10）中所示合成具有通式（v）和（vii）的化学结构的一些类似物。合成羟基二苯甲酮衍生物，并将其与1,8-萘衍生物在甲磺酸和三氟乙酸的1:1混合物中缩合，以产生含内酯的化合物的混合物。如果需要，可以通过将该化合物与甲醇在硫酸中反应或通过将该化合物与碳酸钾和碘甲烷反应来打开内酯环，以产生甲基酯衍生物。
可以按照反应路线7（图11）来合成具有其中X1为Si(CH3)2、Ge(CH3)2或Sn(CH3)2的通式（i）的化学结构的一些类似物。对于反应路线7来说，R1、R2、R4、R5、R7和R8如前所定义，其前提是R1、R2、R4、R5、R7或R8都不是–NH2。在步骤（a）中，可以通过卤素-金属交换反应从双(2-溴苯基)甲烷衍生物产生二锂中间体，将其用硅、锗或锡的适合的二烷基二氯化物淬灭、并氧化，以形成氧杂蒽。在步骤（b）中，可以插入苯基锂衍生物以产生对甲氨基酚或罗丹明类型的结构。参见例如Koide等，ACS Chem.Biol.2011,6(6),600-608。
可以按照反应路线8（图12）来合成具有其中X1为S或Se的通式（i）的化学结构的一些类似物。对于反应路线8来说，R1、R2、R4、R5、R7和R8如前所定义，其前提是R1、R2、R4、R5、R7或R8都不是–NH2或卤素。硫类似物可以如下合成：从间氨基苯甲醚通过其重氮氯化物制备3-碘苯甲醚，并且独立地，通过乙醇钠与相应的苯硫酚的反应制备3-甲氧基苯硫酚钠盐。将3-碘苯甲醚和3-甲氧基苯硫酚钠盐与粉末状铜一起进行加热，产生1,1′-硫代双(3-甲氧基苯)，其通过在乙酸中用氢碘酸进行醚切割而被转变成m,m′-硫代二苯酚。然后可以通过将m,m′-硫代二苯酚与邻苯二甲酸酐在氯化锌存在下熔融（途径a），或通过与2-磺基苯甲酸环状酸酐和甲苯-4-磺酸熔融（途径b）以产生如图12中所示的磺基苯甲酸类似物，来制备对甲氨基酚类似物。参见例如Pfoertner,J.Chem.Soc.,Perkin Trans.2,1991,523-526。
按照反应路线9（图13）来合成具有其中R6和R16为氨基或硼酸的通式（iii）的化学结构的一些类似物。将罗丹明在碱性条件下水解，然后与氨基羟基萘进行酸缩合，以产生半萘并罗丹明。还原性胺化产生相应的双硼酸。
按照反应路线10（图14）来合成具有其中R16和R21为氨基或硼酸的通式（iv）的化学结构的一些类似物。通过邻苯二甲酸酐和氨基羟基萘的由酸促进的缩合来制备萘并罗丹明。还原性胺化产生相应的双硼酸。
在某些实施方式中，如反应路线11（图15）中所示将荧光团结合到对位桥接的紫精。将联吡啶和对双(溴甲基)苯在乙腈中合并并回流，以形成对位桥接的紫精。然后将紫精与六氟磷酸铵反应，以产生紫精六氟磷酸盐。将所述六氟磷酸盐与1,3-二溴丙烷反应，所述1,3-二溴丙烷连接于桥接的紫精的末端并起到用于荧光团的连接基的作用。将通式（ii）（即含有内酯环）的荧光团与含有连接基的桥接的紫精合并并加热。该反应打开内酯环，并且荧光团分子通过其下方的环结合到每个连接基，由此形成具有两个荧光团部分的桥接的紫精。可以分别使用邻或间双(溴甲基)苯代替对双(溴甲基)苯，类似地合成邻位和间位桥接的紫精。
在某些实施方式中，可以使用如反应路线12（图16）中所示的烷基化化学，将荧光团通过其一个环上的R基团结合到桥接的紫精。
在某些实施方式中，桥接的紫精骨架任一端上的R基团RA和RB可以彼此不同。例如，可以将荧光团的组合结合到紫精骨架。或者，可以将荧光团和除了荧光团之外的第二部分结合到紫精骨架。其他适合的部分包括例如取代和未取代的脂族基团，例如取代和未取代的烷烃、烯烃或炔烃，包含一个或多个取代或未取代的芳香环和/或杂芳环的芳基或杂芳基，特别是低级脂族基团、芳基或杂芳基取代基，其中取代的低级脂族基团、芳基或杂芳基取代基包括一个或多个官能团，所述官能团包括羟基、巯基、腈、酰胺、羟基和含羰基基团例如酮、醛和羧基。在下面示出的代表性实施方式中，通式（iii）的荧光团（例如化合物3i（或15d）或化合物15b）被结合到桥接的紫精骨架的一端，并且乙腈部分被结合到桥接的紫精骨架的另一端。
Figure BDA0000466054340000461
在某些实施方式中，降低荧光团的pKa和/或提高荧光团的水溶性可能是有利的。在某些实施方式中，可以通过对荧光团进行卤代，例如通过将一个或多个氟原子与一个或多个可离子化部分邻位布置，使得大部分荧光团分子在中性水溶液中处于离子形式，来降低pKa。本发明人已发现，与中性荧光团分子相比，本公开的荧光团的离子化物质通常具有更大的斯托克斯位移。通过在合成期间即缩合反应期间使用氟代萘酚，可以将荧光团的实施方式氟代。可以如文献中所述，通过将羟基萘与氟供体（例如（1-氯甲基-4-氟-1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷双(四氟硼酸酯)））在甲基氰中，在回流下进行反应来合成氟代萘酚（Yang等，Heteroatom Chem.,1998,9,229-239；Bluck等，J.Fluor.Chem.,2004,125,1873-1877）。
在某些实施方式中，降低生物介质中的非特异性结合，也可能是有利的。为了降低非特异性结合，可以通过将本公开的荧光团结合到低聚乙二醇，来制备荧光团的低聚乙二醇化衍生物。如果使用双官能团的聚乙二醇化试剂，可以将荧光团进一步结合到其他目的生物分子。包含6-8个乙二醇单元的适合的双官能团的聚乙二醇化试剂是可商购的，或者可以使用文献中的方案来制备（Svedhem等，J.Org.Chem.,2001,66,4494-4503；Wosnick等，J.Am.Chem.Soc.,2005,127,3400-3405）。可以通过酰胺键的形成，将聚乙二醇化试剂结合到本公开的包含羧基的荧光团的实施方式。聚乙二醇化也可以提高具有疏水性质的荧光团的溶解性。
V.应用
本公开的NIR荧光团-紫精结合物的某些实施方式适用于激惹生物介质例如血液、血浆和尿。血液在可见光区域中具有强的背景吸收、显著的自发荧光和散射。本公开的结合物的某些实施方式在长得足以克服来自于血液血红蛋白的干扰的波长处具有发射光谱最大值，例如在大于640nm或大于680nm处具有发射光谱最大值。在特定实施方式中，本公开的结合物还具有大于640nm、例如大于680nm的吸收光谱最大值。在这样的实施方式中，可以使用波长大于640nm的光源，从而使由血液引起的光吸收最小化。在血液的光学范围之外起作用的NIR荧光团-紫精结合物，将通过限制稀释和样品制备/处理来简化被分析物和生物标志物的测试，从而减少误差源、缩短获得结果的时间和/或降低由样品处理和操作造成的健康危害。目前的方法和检测试剂利用色谱法、脆弱的材料（例如在水性溶液中不稳定、需要储存在低于-20℃和/或需要储存在暗处的材料）和/或高度的样品处理。例如，在目前的方法中，样品可能被稀释超过1000倍以克服来自于血液的光学干扰，或者可能在血浆而不是全血中进行测试。相反，本公开的NIR荧光团-紫精结合物的某些实施方式在室温下，即使在溶液中也能稳定数周。与荧光素相比，本公开的结合物的某些实施方式在细胞培养基中也更加光稳定。因此，据预期，本公开的NIR荧光团-紫精结合物的某些实施方式可能可用于检测体液中的被分析物。
在某些实施方式中，近红外荧光团包含5元内酯环（即通式（ii）），其可以通过所述5元环中的氧原子偶联到桥接的紫精（也参见反应路线11（图15）、实施例2和图17-19）。
Figure BDA0000466054340000481
所述5元环可以被打开以形成羧酸化物基团（-COO-），其可以被偶联到桥接的紫精。
荧光团的吸光度和荧光光谱通常是pH依赖性的。例如，一种酯衍生物（化合物15d）在0.1M NaOH中的吸收最大值为620nm，在相同溶剂中的发射最大值为770nm。在这种溶剂中的斯托克斯位移为150nm（3142cm-1）。
Figure BDA0000466054340000491
本公开的NIR荧光团-紫精结合物的某些实施方式包含可以促进特定分子标志物的检测的官能团。NIR荧光团-紫精结合物的实施方式可以被官能化，以（a）产生在荧光团与所需的生物标志物之间具有共价和/或超分子相互作用的组合的所需几何结构，和/或（b）在所需的生物标志物存在下改变氧化-还原和/或能量转移性质。例如，分子建模表明，具有通式（vi）的化学结构并在R17和R20位处具有极性末端基团例如氨基、氧和/或羟基的NIR荧光团的某些实施方式可能表现出有利的与谷胱甘肽的极性末端的静电相互作用（图20）。分子建模还表明，具有通式（vi）的化学结构并且其中R17和R20中的至少一个是Rc是
Figure BDA0000466054340000492
的–NHRc的NIR荧光团的某些实施方式可能优先与特定核苷相互作用（图21）。在某些实施方式中，当R13包含羧酸化物部分时，可以增强特异性。
目的生物标志物包括谷胱甘肽（GSH），在线粒体障碍（例如糖尿病、动脉粥样硬化、神经变性疾病、缺氧缺血性脑病、自闭症、早产儿视网膜病、慢性渐进性外眼肌麻痹和癌症（Akturi等，PNAS U.S.A.,2009,106,3941-3945））和有机酸血症（例如甲基丙二酸血症）中，谷胱甘肽在全血、白细胞和血浆中减少。用于检测GSH的一些可商购的方法利用的检测试剂对GSH不具有超过其他硫醇（例如半胱氨酸、二硫苏糖醇）的选择性，和/或需要在血浆中进行测试。然而，全血中的GSH水平在毫摩尔范围内，或比血浆中的水平高100-1000倍。
本公开的NIR荧光团-紫精结合物的某些实施方式可能适合于选择性检测血液中的GSH。例如，分子建模显示，化合物5a（表2）与GSH具有非常有利的结构相互作用。另外，发现化合物5a在5%血液溶液中是可检测的（参见实施例3）。被官能化成促进多点的、谷胱甘肽选择性的共价、超分子和/或氧化还原相互作用的NIR荧光团-紫精结合物的实施方式，可以起到氧化应激和线粒体障碍的指示物的作用。
罗丹明B内半缩醛具有GSH选择性，其据认为由与醛互变异构体的反应产生，因此造成了所观察到的发射和吸收增加。
Figure BDA0000466054340000501
据信，在GSH的情形中，至少部分由于荧光团的极性基团（其事实上调节离子化状态和光学性质）与GSH三肽的极性基团之间的有利的静电相互作用，平衡有利于硫代半缩醛。为了理解可能的盐桥形成和离子配对，对在荧光团例如化合物24的反应中形成的共价复合物进行模拟，证实了相对延长的GSH部分可以同时与荧光团的极性末端相互作用（图20）。
其他目的生物标志物包括琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷（SAICA-核苷）和琥珀酰基腺苷（S-Ado），它们是腺苷酸基琥珀酸裂解酶（ADSL）缺陷症的指示物。
Figure BDA0000466054340000511
ADSL缺陷症是一种罕见的（约1/200,000）先天性嘌呤代谢障碍，其能够引起智力低下和癫痫（Jaeken,Lancet,1984,2,1058-1061）。嘌呤和嘧啶（PP）代谢中未诊断的遗传缺陷可能引起早期死亡和/或收容入院。ADSL缺陷症的特征在于SAICA-核苷和S-Ado的大量尿液排泄（毫摩尔水平），SAICA-核苷和S-Ado是对应于SAICA-核糖核苷酸（SAICAr）和腺苷酸基琥珀酸的核苷。
被官能化成具有特定核苷所靶向的共价和超分子结合位点的本公开的荧光团-紫精结合物的实施方式，可以起到ADLS缺陷症的指示物的作用。在某些实施方式中，荧光团-紫精结合物包含至少一个硼酸官能团，即至少一个R基团是–NHRc，其中Rc是
Figure BDA0000466054340000512
与果糖相比，用苯基硼酸修饰的罗丹明可以表现出前所未有的对核糖和同类物的亲和性（Jiang等，J.Am.Chem.Soc.,2006,128,12221-12228）。
Figure BDA0000466054340000521
计算机辅助分子模拟表明，除了硼酸与核糖的呋喃糖形式的2,3-顺式二醇反应的偏好性和强的静电相互作用B--O---H-N+之外，非共价次级相互作用对于改变发色团的离子化状态也发挥重要作用。图21示出了可以在核苷与具有通式（vi）的化学结构的荧光团的两种实施方式（化合物43和44，表2）的羧酸化物部分之间出现的带电荷的氢键。使用利用SybylTMX1.1（Tripos,St.Louis,MO）进行的模拟退火（加热/冷却的连续循环）和利用MOPAC2009（Stewart Computational Chemistry,Colorado Springs,CO）进行的几何结构优化，来制备图21中的能量最小化模型。与羧酸化物部分的相互作用似乎在与S-Ado和SAICAr的相互作用中发挥重要作用，因为罗丹明双硼酸中羧酸化物部分的酯化导致其选择性向果糖逆转。
在某些情况下，如果生物介质中的评估不令人满意，可以合成特异性针对特定被分析物的分子印迹聚合物（MIP），并将用于固相萃取步骤中，然后用本公开的NIR荧光团-紫精结合物的实施方式进行评估。MIP允许捕获和浓缩被分析物。可以获得出色的协同作用，因为荧光团-紫精结合物和/或MIP在选择性方面的任何缺陷可以被另一种组分补偿。
VI.试剂盒
试剂盒也是本公开的特征。试剂盒的实施方式包括符合通式I-III中的任一个并适合于选择性检测样品（例如生物流体如血或尿）中的被分析物的至少一种化合物。在某些实施方式中，试剂盒还包括至少一种缓冲溶液，在所述缓冲溶液中，化合物当与包含或怀疑包含被分析物的样品合并时，与合并有不含被分析物的样品的缓冲溶液中的化合物相比，会发生吸收光谱和/或发射光谱的变化。试剂盒可以包括用于评估由化合物与被分析物之间的反应产生的颜色变化的颜色对比图。试剂盒还可以包括一个或多个容器例如一次性试管或比色皿，检测可以在所述容器中进行。试剂盒还可以包括用于执行检测的说明书。在某些实施方式中，试剂盒包括被分析物例如谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷和/或琥珀酰基腺苷的对照样品。对照样品通常被提供为固体形式。
在试剂盒的某些实施方式中，化合物被提供为固体，并且缓冲液被提供为液体形式。缓冲液可以以适合于检测Cys、Hcy、GSH、琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷或其混合物的浓度提供。或者，缓冲液可以被提供为浓溶液，其随后在使用前进行稀释。在某些实施方式中，可以将化合物预先称量在一个或多个容器（例如试管或比色皿）中，并随后通过向容器添加缓冲液和测试样品来进行检测。
VII.实施例
试剂和通用程序：
化学。除非另有指明，否则所有可商购的起始原料被直接使用而不需进一步纯化。萘并荧光素从Sigma-Aldrich获得。硅胶（SorbentTechnologies）32-63μm被用于快速柱层析。1H-NMR在ARX-400Advance Bruker波谱仪上获得。除非另有指明，否则化学位移（δ）以ppm为单位相对于d6-DMSO（2.50ppm，1H，39.5213C）给出。MS（HRMS，ESI）谱在波特兰州立大学生物分析质谱部门（Portland State UniversityBioanalytical Mass Spectrometry Facility）处，在配有专用Accela HPLC系统的ThermoElectron LTQ-Orbitrap高分辨率质谱仪上获得。
使用甲磺酸进行的通用酸缩合。将二羟基萘（3.12mmol）和邻苯二甲酸酐（1.56mmol）溶解在3mL甲磺酸中。将混合物在90℃搅拌24h。允许混合物冷却至室温，然后倾倒在蒸馏水（50mL）中。将沉淀物过滤并用水洗涤（3x50mL）。如果没有沉淀物形成，通过分批加入固体NaHCO3将混合物中和至pH5-7。将沉淀物在真空下干燥。通过在硅胶上快速柱层析来分离目标化合物。
使用CH3SO3H:TFA的1:1混合物进行的通用缩合方法。将羟基二苯甲酮（918μmol）和1,8-萘衍生物（1380μmol）溶解在1.5mL甲磺酸中，然后加入1.5mL三氟乙酸（TFA）。将混合物在80℃加热并搅拌16-24小时。允许反应混合物变温至室温，然后将其倾倒在50mL去离子（DI）水中。通过分批加入固体NaHCO3将混合物中和至pH6-7。将得到的沉淀物过滤，用DI水洗涤并空气干燥。通过在硅胶上快速柱层析来分离目标化合物。
通用酯化方法A。将羧酸化物（0.243μmol）溶解在2mL甲醇（MeOH）中。向该溶液逐滴加入浓H2SO4（100μL），然后将混合物回流24h。允许混合物冷却至室温，然后倾倒在50mL冰水中，并一次性加入200mg NaHCO3。如果沉淀物形成，将固体过滤，并用2%NaHCO3（2x10mL）洗涤，然后用水（2x10mL）洗涤。如果没有获得沉淀物，将中和的水性相用CHCl3（3x50mL）萃取。将有机相在Na2SO4上干燥，并在真空下将溶剂蒸发。然后通过快速柱层析分离目标化合物。
通用酯化方法B。在氩气气氛下，将化合物（0.131mmol）溶解在25mL无水甲醇中。将溶液在冰浴中冷却至0℃。逐滴加入乙酰氯（750μL）。将混合物搅拌并在50℃下保持48小时。逐滴加入乙酰氯（300μL），并将混合物在50℃下继续保持24小时。允许混合物冷却至室温，在真空下将溶剂蒸发。
实施例1
近红外荧光团的合成和表征
如反应路线1（图5）中所示，通过1,8-二羟基萘与邻苯二甲酸酐在甲磺酸中的酸缩合或通过1,8-二羟基萘与相应的醛在85%H3PO4中在125℃/24h缩合来合成具有通式IV的结构的类似物。通过典型的Fischer酯化方案，从21获得萘并荧光素甲基酯22（反应路线4）。通过羟基二苯甲酮与相应的萘酚在CH3SO3H:TFA的1:1混合物中在80℃下酸缩合16-24h来合成通式III的不对称半萘并荧光素、对甲氨基酚和罗丹明类似物（反应路线2和3）。所需的羟基二苯甲酮和1,8-萘衍生物按照描述的或改良的文献方案来合成。甲基酯衍生物通过在MeOH中由H2SO4或HCl催化的酯化来获得；通过在二甲基甲酰胺中，在K2CO3存在下，用碘甲烷处理羧酸化物或甲基酯中间体来提供进一步的甲基烷基化。总的来说，对于该系列中包含的大多数化合物来说获得总体良好的得率，例外的是二羟基二苯甲酮与8-氨基萘酚衍生物之间的缩合产物，其中主要的分离产物对应于荧光素。所有化合物通过快速柱层析（正相或反相）分离，并通过NMR和MS进行表征。化合物14a（图22）的结构通过X-射线单晶体结构来证实。
化合物21和7（具有已知的区域选择性化学的[c]型全成环的萘并荧光素，与具有3-1移位的全成环的[c]型萘并荧光素）
化合物21和7通过UV-可见光谱术进行表征（图23）。使用每种化合物在90%水和10%DMSO溶液中的15μM溶液来测量吸光度。600nm（浅色虚线）和675nm（浅色实线）处的峰分别表示化合物21和7在NaOH（pH12）中的二价阴离子。590nm（深色虚线）和650nm（深色实线）处的峰分别表示化合物21在pH7.4下的单价和二价阴离子的混合物以及化合物7在pH9下的占优势的单价阴离子。因此，取决于离子化状态，3-1移位引起吸收光谱红移约60-75nm。
还通过荧光发射光谱对化合物21和7进行表征。使用每种化合物在90%水和10%DMSO溶液中的15μM溶液来测量荧光。对于化合物21来说，在pH9下，从二价阴离子观察到的最长波长发射出现在680nm附近。对于化合物7（移位的）来说，在pH9下，从单价阴离子观察到的最长波长发射出现在800nm附近。在氢氧化钠中，来自于移位的二价阴离子的发射或者太弱而不能被检测到，或者更可能地，超出了仪器的工作量程（>850nm）。3-1移位产生约120nm的红移的发射，并且可能更依赖于离子化状态。
测量了每种化合物的斯托克斯位移，并且对于化合物21的二价阴离子来说，斯托克斯位移被确定为约80nm，对于化合物7（移位的）单价阴离子来说，斯托克斯位移被确定为约150nm。因此，3-1移位也增加斯托克斯位移。
化合物22和8（具有已知的区域选择性化学的[c]型全成环的萘并荧光素甲基酯，与具有3-1移位的全成环的[c]型萘并荧光素甲基酯）
化合物22按照反应路线4来合成。将萘并荧光素（化合物21，0.05g，0.115mmol）溶解在2mL甲醇中。将溶液在冰浴中冷却至0℃。向溶液加入浓硫酸（100μL），并将混合物回流24小时。允许混合物冷却至室温，然后倾倒在250mL冰水中；加入200mg NaHCO3。将沉淀物过滤，用2%NaHCO3洗涤两次，然后用水洗涤两次。在硅胶上通过快速柱层析来分离化合物22，使用CH2Cl2:MeOH9:1进行洗脱。得率为26mg，50%。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.05(s,1H),8.96(d,J–9.2Hz,2H),8.60(d,J–9.0Hz,1H),8.33(d,J=7.9Hz,1H),7.98(t,J=6.9Hz,1H),7.89(t,J=7.7Hz,1H),7.63(d,J=9.2Hz,2H),7.56(d,J=6.8Hz,1H),7.32–7.21(m,1H),7.18–7.03(m,2H),6.91(d,J=9.1Hz,2H),3.56(s,3H)。HR ESI[M+H+]m/z C29H19O5的计算值为447.1231；实测值447.1237。
化合物8如下合成：将1,8-二羟基萘（0.5g，3.12mmol）和邻苯二甲酸酐（0.231g，1.56mmol）溶解在2mL甲磺酸中，然后加入2mL三氟乙酸。将混合物在80℃下加热并搅拌24h。允许混合物冷却至室温，然后倾倒在100mL去离子水中。将沉淀物（化合物7）过滤并用去离子水洗涤，然后在硅胶上通过快速柱层析进行分离，使用CH2Cl2:MeOH9:1来洗脱。得率为0.122g，18%。然后按照对化合物22所描述的进行酯化。在硅胶上通过快速柱层析分离化合物8，使用CH2Cl2:MeOH9:1来洗脱。得率0.023g，86%。1H NMR(400MHz,DMSO)δ14.45(s,1H),8.32(dd,J=7.9,1.0Hz,1H),7.97(td,J=7.5,1.3Hz,1H),7.87(td,J=7.7,1.3Hz,1H),7.62-7.66(m,4H),7.56(dd,J=7.6,0.9Hz,1H),7.13,(d,J=7.2Hz,2H),6.91(dd,J=8.4,0.8Hz,2H),6.77(d,J=9.1Hz,2H),3.55(s,3H)。13C NMR(101MHz,DMSO)δ167.48,165.22,154.58,137.69,135.10,134.52,133.66,130.95,130.56,130.40,130.05,129.20,120.79,119.99,119.87,116.26,112.80,52.42。HR ESI[M+H+]m/z C29H19O5的计算值为447.1236；实测值447.1237。
化合物22和8通过UV-可见光谱术进行表征（图24）。使用每种化合物在90%水和10%DMSO溶液中的15μM溶液来测量吸光度。610nm（浅色虚线）和685nm（浅色实线）处的峰分别表示化合物22和8在NaOH（pH12）中的阴离子。605nm（深色虚线）和805nm（深色实线）处的峰分别表示化合物22和8在pH7.4下的中性形式。因此，取决于离子化状态，3-1移位引起吸收光谱红移约75-200nm。
有趣的是注意到对于移位的化合物来说，羟基的离子化产生更短波长的吸收。这与对已知的区域选择性化学所观察到的相反。从前面的两个实例还可以明显看出，当羧酸化物被甲基酯替代时，3-1移位对光谱性质的影响（红移的光谱）更加显著。
由3-1移位提供的羟基的独特位置，导致与氧杂蒽的氧的相互作用增加。这是对观察到的红移和出人意料的行为的一种可能的解释。分子建模证实，在中性形式下，移位的结构的羟基质子被两个氢键牢固锁住，并且在阴离子形式下，与已知的区域选择性化学相比，对于移位的来说，氧杂蒽的氧更加正电性（Mulliken电荷为-0.289，相比于-0.386）。目前正在进行的工作对这种相互作用进行进一步表征，并利用这种策略进一步调节基于氧杂蒽的结构的光谱性质，而不需可能包括用更加正电性的元素（例如S、Se、C、Si等）替代氧杂蒽的氧的复杂的合成策略。在最近的工作中，Nagano和合作者使用类似的策略，将罗丹明和派若宁的吸收和发射波长各自扩展约80nm（DOI：10.1021/cb1002416）。应该指出，这种方法保留了母体结构中存在的相对小的斯托克斯位移（15-20nm）。然而，本文公开的移位方法增加斯托克斯位移。另外，与从本文描述的3-1移位方法得到的化合物相比，由Nagano和合作者报道的化合物的发射蓝移约100nm或更多。
还通过荧光发射光谱对化合物22和8进行表征。使用每种化合物在90%水和10%DMSO溶液中的15μM溶液来测量荧光。对于化合物22来说，在pH9下，从阴离子观察到的最长波长发射出现在690nm附近。对于化合物8（移位的）来说，没有观察到发射。由于在这类化合物中观察到的大于800nm的吸收峰和通常大的斯托克斯位移，有可能的是，发射超出了仪器的工作量程（>850nm）。假设移位的化合物的发射超出850nm，则3-1移位引起发射红移超过160nm。
测量了每种化合物的斯托克斯位移，并且对于化合物22的阴离子来说，斯托克斯位移被确定为约80nm，对于化合物8（移位的）中性形式来说，斯托克斯位移被确定为不可测量的。有可能的是，3-1移位也增加斯托克斯位移。
还测量了化合物22和8在甲醇中的吸光度和荧光。化合物22在598nm处表现出吸收最大值。化合物8在701nm处表现出吸收最大值。化合物22在688nm处表现出发射最大值。化合物8在816nm处表现出发射最大值。因此，在化合物8中，将羟基置于氧杂蒽内部的氧附近，在吸收光谱中产生103nm的长移。移位还在激发光谱中提供了相应的迁移，并在荧光发射中提供了128nm的大的长移。重要的是，化合物8在近红外区中吸收和发射，具有分别为701nm和816nm的吸收最大值和发射最大值。在其他溶剂系统例如DMSO、DMSO:水1:1（pH9）、DMSO:水1:9（pH9）、DMSO:水s1:1（pH12.1，NaOH）和DMSO:水1:9（pH12.1，NaOH）中，观察到了类似趋势。
化合物20a和15a（具有已知的区域选择性化学的[c]型成环的半萘并荧光素甲基酯，与具有3-1移位的成环的[c]型半萘并荧光素甲基酯）
商购了一些在3位碳上具有可离子化基团的区域选择性化学的[c]型半萘并荧光素。然而，由于当用甲基酯替代羧酸化物时在具有上述移位的几何结构的化合物上观察到的巨大影响，制备了以前未报道过的半萘并荧光素甲基酯类似物，用于与新的移位的化合物进行直接比较。
通过将化合物17a（0.25g，0.968mmol）与化合物18a（0.232g，1.45mmol）在酸性条件下缩合来合成化合物20a（反应路线3）。在硅胶上通过快速柱层析来分离化合物19a，使用EtOAc:MeOH9:1来洗脱。得率303mg，82%。按照前面对化合物22所描述的将化合物19a（50mg，131μmol）酯化。在硅胶上通过快速柱层析来分离化合物20a，使用EtOAc:MeOH9:1来洗脱。得率27mg，52%。1H NMR(600MHz,DMSO)δ10.57(s,1H),8.53(d,J=9.1Hz,1H),8.25(dd,J=8.0,1.0Hz,1H),7.90(td,J=7.5,1.3Hz,1H),7.81(td,J=7.8,1.3Hz,1H),7.53(dd,J=14.7,7.7Hz,2H),7.34(dd,J=9.1,2.4Hz,1H),7.23(d,J=2.3Hz,1H),6.86(d,J=9.6Hz,1H),6.78(d,J=89Hz,1H),6.50(D,J=2.0Hz,1H),6.47(dd,J=9.6,2.0Hz,1H),3.56(s,3H)。13C NMR(151MHz,DMSO)δ183.52,165.24,159.27,158.26,150.81,149.36,137.52,134.26,133.27,130.72,130.69,130.04,192.92,129.85,129.48,124.47,123.27,122.90,119.85,117.45,116.08,113.91,110.07,104.55,52.10。HR ESI[M+H+]m/z C25H17O5的计算值为397.1068；实测值为397.1081。
通过将化合物12a（0.250mg，0918mmol）与化合物13a（0.232g，1.45mmol）在酸性条件下缩合来合成化合物15a（反应路线2）。在硅胶上通过快速柱层析来分离化合物14a，使用CH2Cl2:MeOH9:1来洗脱。得率300mg，81%。按照前面对化合物22所描述的将化合物14a酯化。在硅胶上通过快速柱层析来分离化合物15a，使用CH2Cl2:MeOH9:1来洗脱。得率40mg，77%。1H NMR(600MHz,DMSO)δ10.78(s,1H),8.25(d,J=7.9Hz,1H),7.91(td,J=7.6,1.3Hz,1H),7.86-7.77(m,1H),7.63-7.51(m,3H),7.40(s,1H),7.13(s,1H),6.86(d,J=9.7Hz,1H),6.81(d,J=8.7Hz,1H),6.50(dd,J=9.7,1.9Hz,1H),6.34(d,J=2.0Hz,1H),3.55(s,3H)。HR ESI[M+H+]m/z C25H17O5的计算值为397.1079；实测值为397.1081。
化合物20a和15a通过UV-可见光谱术进行表征（图25）。使用每种化合物在90%水和10%DMSO溶液中的15μM溶液来测量吸光度。545nm（浅色虚线）和595nm（浅色实线）处的峰分别表示在NaOH（pH12）中的相应阴离子，即化合物20c和15h。515nm（深色虚线）和525nm（深色实线）处的峰分别表示化合物20a和15a在pH6下的占优势的中性形式。因此，取决于离子化状态，3-1移位引起吸收光谱红移约10-55nm。
还通过荧光发射光谱对化合物20a和15a进行表征。使用每种化合物在90%水和10%DMSO溶液中的15μM溶液来测量荧光。对于化合物20a来说，在NaOH（pH12）下，从其相应的阴离子即化合物20c观察到的最长波长发射出现在640nm附近。对于化合物15a（具有3-1移位）来说，在NaOH中，从其相应的阴离子即化合物15h观察到的最长波长发射出现在760nm附近。3-1移位引起发射最长波长的物质的发射红移约120nm。
测量了每种化合物的斯托克斯位移，并且对于化合物20c阴离子来说，斯托克斯位移被确定为约95nm，对于化合物15h（移位的）阴离子来说，斯托克斯位移被确定为约165nm。因此，3-1移位使斯托克斯位移增加约70nm。
还测量了化合物20a和15a在甲醇中的吸光度和荧光。化合物20a在487nm和521nm处表现出吸收最大值。化合物15a在501nm和536nm处表现出吸收最大值。化合物20a在550nm处表现出发射最大值。化合物15a在582nm处表现出发射最大值。因此，在化合物15a中，将羟基置于氧杂蒽内部的氧附近，在吸收光谱中产生15nm的长移。移位还在激发光谱中提供了相应的迁移，并在荧光发射中提供了32nm的大的长移。
尽管化合物15a在甲醇中的红移是适中的，但其相应的阴离子（化合物15h）在1:9的DMSO:水基质中与相同条件下的阴离子20c相比，更显著地迁移50nm至599nm。它的荧光发射迁移甚至更大，为130nm，在760nm处发射。阴离子15h的相对大的迁移支持了极性效应在调节化合物中的HOMO-LUMO能隙中发挥关键作用。据预期，不对称的15h的氧阴离子与相应的氧阴离子20c相比，对邻近的醚氧的极性具有更加显著的场效应。与许多其他发射NIR的化合物相似，化合物15h在水性溶液中表现出相对低的量子产率（低于1%）。化合物15h的亮度与其他NIR探针相当。
化合物15b和15d（具有3-1移位的区域选择性化学的[c]型成环的半萘并罗丹荧光素甲基酯（分别为游离氨基和二甲基））
已知的半萘并荧光素的甲基酯类似物的行为与以前报道的化合物类似。观察到与含有羧酸化物的化合物相比仅仅略微的红移，其在约10nm的量级上（Whitaker等，Analytical Biochemistry,1991,194,330-344）。因此，没有制备已知半萘并罗丹荧光素的甲基酯类似物（也被称为半萘并对甲氨基酚）用于直接比较。使用具有已知的区域选择性化学的类似化合物的文献值与化合物15b和15d进行比较。
化合物15b（游离氨基）通过UV-可见光谱术进行表征（图26），并与C.SNARF-5（文献，SNARF=半萘并罗丹荧光素）进行比较。使用化合物15b在90%水和10%DMSO溶液中的15μM溶液来测量吸光度。535nm（深色线）处的峰表示15b在pH6下的占优势的酚形式。615nm（浅色线）处的峰表示化合物15b在NaOH（pH12）中的苯氧化物。相比之下，C.SNARF-5产生550nm处的峰（阴离子形式）和485nm处的峰（中性形式）（Whitaker等，Anal.Biochem.1991,194,330-344）。因此，取决于离子化状态，3-1移位引起吸收光谱红移约50-65nm。
还通过荧光发射光谱对化合物15b进行表征并与C.SNARF-5进行比较。使用化合物15b在90%水和10%DMSO溶液中的15μM溶液来测量荧光。对于C.SNARF-5来说，从阴离子观察到的最长波长发射出现在632nm附近（Whitaker等，Anal.Biochem.1991,194,330-344）。对于化合物15b（移位的）来说，从苯氧化物观察到的最长波长发射出现在770nm附近。对于发射最长波长的物质来说，3-1移位产生红移约138nm的发射。
测量了每种化合物的斯托克斯位移，并且对于C.SNARF-5阴离子来说，斯托克斯位移被确定为约82nm，对于化合物15b（移位的）苯氧化物来说，斯托克斯位移被确定为约155nm。因此，3-1移位使斯托克斯位移增加约73nm。
化合物15d（二甲基）通过UV-可见光谱术进行表征（图27），并与SNARF-1（文献）进行比较。使用化合物15d在90%水和10%DMSO溶液中的15μM溶液来测量吸光度。570nm（深色线）处的峰表示15d在pH6下的占优势的中性形式。630nm（浅色线）处的峰表示化合物15d在NaOH（pH12）中的苯氧化物。相比之下，SNARF-1产生573nm处的峰（阴离子形式）和515nm处的峰（中性形式）（Whitaker等，Anal.Biochem.1991,194,330-344）。因此，取决于离子化状态，3-1移位引起吸收光谱红移约55-57nm。
还通过荧光发射光谱对化合物15d进行表征并与SNARF-1进行比较。使用化合物15d在90%水和10%DMSO溶液中的15μM溶液来测量荧光。对于SNARF-1来说，从阴离子观察到的最长波长发射出现在631nm附近（Whitaker等，Anal.Biochem.1991,194,330-344）。对于化合物15d（移位的）来说，从苯氧化物观察到的最长波长发射出现在780nm附近（NaOH，pH12）。对于发射最长波长的物质来说，3-1移位产生红移约149nm的发射。
测量了每种化合物的斯托克斯位移，并且对于SNARF-1阴离子来说，斯托克斯位移被确定为约58nm，对于化合物15d（移位的）苯氧化物来说，斯托克斯位移被确定为约150nm。因此，3-1移位使斯托克斯位移增加约92nm。
化合物20b和15g（分别为具有已知和3-1移位的区域选择性化学的[c]型成环的半萘并罗丹明甲基酯（游离氨基））
据本发明人所了解，具有[c]型成环和已知的区域选择性化学的完全的半萘并罗丹明类似物尚未被报道。我们制备了这种化合物（20b），用于与具有3-1移位的新的半萘并罗丹明（15g）进行直接比较。
化合物20b和15g通过UV-可见光谱术进行表征（图28）。使用每种化合物在90%水和10%DMSO溶液中的15μM溶液来测量吸光度。540nm（虚线）和570nm（实线）处的峰分别表示在pH7.4下的化合物20b和15g的阳离子。因此，3-1移位引起吸收光谱红移约30nm。
还通过荧光发射光谱对化合物20b和15g进行表征。使用每种化合物在90%水和10%DMSO溶液中的15μM溶液来测量荧光。对于化合物20b来说，在pH7.4下从阳离子观察到的最长波长发射出现在640nm附近。对于化合物15g（移位的）来说，在pH7.4下从阳离子观察到的最长波长发射出现在770nm附近。3-1移位引起红移约130nm的发射。
测量了每种化合物的斯托克斯位移，并且对于化合物20b阳离子来说，斯托克斯位移被确定为约100nm，对于化合物15g（移位的）阳离子来说，斯托克斯位移被确定为约200nm。因此，3-1移位使斯托克斯位移增加约100nm。
化合物15e和15f（具有3-1移位的区域选择性化学和移位的可离子化部分的[c]型成环的半萘并罗丹荧光素甲基酯（游离氨基和二甲基））
除了上面的实例之外，制备了第二系列的具有3-1移位的半萘并罗丹荧光素（15e-15f），其中可离子化的羟基和胺（游离氨基和二甲基）官能团也被移位。用于比较的最接近的化合物，即具有已知的区域选择性化学的[c]型成环的半萘并罗丹荧光素，据报道“在MeOH中，当在525nm处激发时显示出在600nm处发射的更长波长的荧光”（Clark等，Tetrahedron Lett.,2004,45,7129-7131）。
该新系列的基于可离子化羟基和胺官能团的移位与本文公开的3-1移位的区域选择性化学相组合的化合物，显示出出人意料的酸碱性质。已知的半萘并罗丹荧光素在高pH下显示出长波长吸收；然而，该系列中的游离氨基化合物对低pH有响应，具有增加的长波长吸收。图29示出了化合物15e的一系列pH滴定曲线，证实了在低pH下增加的长波长吸收和减小的短波长吸收。
初步数据还表明，该系列（游离氨基和二甲基）表现出与本文公开的具有3-1移位的其他化合物可比的红移的光谱。发射最长波长的物质的发射最大值在～740-780nm的范围内。显然，与以前报道的化合物相比，基于移位的组合的红移的化合物红移得明显更大。
化合物10-7-(2,5-二甲基苯基)-13-羟基-1H-二苯并[c,h]氧杂蒽-1-酮
Figure BDA0000466054340000641
将1,8-二羟基萘（0.298mg，1.86mmol）和2,5-二甲基苯甲醛悬浮在2mL85%H3PO4中，将混合物剧烈搅拌并在125℃加热24小时。允许混合物冷却至室温，然后倾倒在50mL水中。将形成的沉淀物过滤并用水洗涤（2×50mL）。在硅胶上通过快速柱层析分离目标化合物，使用CH2Cl2:MeOH9:1来洗脱。得率为67mg，17%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.59–7.45(m,4H),7.35(s,2H),7.16(s,2H),7.10(s,2H),7.04(d,J=6.8Hz,2H),6.94(d,J=8.9Hz,2H),2.45(s,3H),2.00(s,3H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ155.96,138.17,136.37,135.49,133.06,132.79,130.87,130.65,129.51,121.04,120.73,120.52,117.21,113.46,21.18,19.43。HR ESI[M+H+]m/z C29H21O3的计算值为417.1476，实测值为417.1496。
化合物16a-2-(1-甲氧基-10-氧代-10H-苯并[c]氧杂蒽-7-基)苯甲酸甲酯
在氩气气氛下，将化合物14a（0.050g，0.131mmol）和K2CO3（0.072g，0.523mmol）悬浮在600μL无水DMF中。一次性加入CH3I（0.111g，0.785mmol），并将混合物在60℃加热24小时。允许混合物冷却至室温，然后加入5mL饱和NH4Cl水溶液。在硅胶上通过快速柱层析分离化合物16a，使用CH2Cl2:MeOH9:1来洗脱。得率为9.8mg，18%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.29(dd,J=7.8,1.1Hz,1H),7.80–7.73(m,1H),7.74–7.67(m,1H),7.60(t,J=8.0Hz,1H),7.47(d,J=8.9Hz,1H),7.42(d,J=7.6Hz,1H),7.35(dd,J=7.5,1.0Hz,1H),7.07(d,J=7.5Hz,1H),6.93(dd,J=9.1,5.3Hz,2H),6.68(q,J=1.8Hz,2H),4.13(s,3H),3.59(s,3H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ185.38,165.66,158.82,158.40,151.35,150.61,137.97,135.12,132.78,131.21,130.67,130.38,130.32,129.67,129.27,124.52,123.41,120.49,118.58,116.77,114.92,107.91,105.48,56.26,52.39。HR ESI[M+H+]m/z C26H19O5的计算值为411.1231，实测值为411.1237。
在R18处甲基化以产生甲酯16a，极大地提高了量子产率。发射黄色-橙色光的16a的量子产率为0.4649，比相应的中性化合物15a高40倍。它比发射黄色-绿色光的中性化合物20a略高，比发射橙色-红色光的阴离子20c高>2倍。在10:90的DMSO:水溶液中对化合物（7.5μM）进行分析。当使用3-瓦的megaMAX505nm ALS系统从下方激发溶液时，在暗室中可以容易地看见荧光发射。通过3-1移位和甲基化的组合产生的发射增强性质，与以前报道的半萘并荧光素甲基酯化合物形成对比。
对于本公开化合物的某些实施方式的其他NMR、ESI和吸收光谱以及HOMO-LUMO表面来说，感兴趣的读者可以参考http://pubs.acs.org/doi/suppl/10.1021/ja302445w/suppl_file/ja302445w_si_ 001.pdf。
实施例2
对位、邻位和间位桥接的双紫精的合成
按照反应路线13合成对位桥接的紫精：
反应路线13
Figure BDA0000466054340000661
将联吡啶（16.66g，106.65mmol）溶解在125mL乙腈中，并对溶液进行回流。接下来，将对双(溴甲基)苯（5g，18.94mmol）溶解在300mL乙腈中。将该溶液在1小时内加入到联吡啶回流溶液中。在对双(溴甲基)苯溶液完全添加后，将混合物继续回流24小时。将形成的沉淀物过滤，用乙腈洗涤（2x50mL）并空气干燥。获得作为浅黄色固体的单桥接的紫精103。得率10.5g，96%。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)9.4-9.41(4H,d),8.85-8.86(4H,d),8.65-8.67(4H,d),8.00-8.01(4H,d),7.74(4H,s),5.94(4H,s)。
将化合物103（3g，5.3mmol）悬浮在30mL水中，并将混合物加热直至沉淀物完全溶解。缓慢加入20mL1M NH4PF6。允许混合物冷却至室温并过滤；将浅黄色沉淀物用水洗涤（3x50mL）并在真空下干燥。得率3.426g，93%。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)9.32-9.34(4H,d),8.86-8.87(4H,d),8.63-8.64(4H,d),7.99-8.00(4H,d)7.66(4H,s),5.88(4H,s)。
使用与反应路线9相同的通用程序，利用间双(氯甲基)苯代替化合物101，按照反应路线14合成间位桥接的紫精：
反应路线14
使用与反应路线10相同的通用程序，利用邻双(溴甲基)苯代替化合物101，按照反应路线15合成邻位桥接的紫精：
反应路线15
实施例2
桥接的对位双对甲氨基酚紫精结合物的合成
单(1',1''-(1,4-亚苯基双(亚甲基))双(1-(3-(2-(10-(二甲基亚氨基)-1-羟基-10H-苯并[c]氧杂蒽-7-基)苯甲酰基氧基)丙基)-4,4'-联吡啶-1,1'-二
Figure BDA0000466054340000681
))四溴化物，54：使用近红外荧光团来生产用于GSH检测的对称和不对称的单桥接的紫精结合物两者，目前正在进行中。化合物54这种单桥接的对位紫精双对甲氨基酚类似物可以如反应路线11（图15）中所示来合成。
按照已发表的流程来合成对甲氨基酚14d（反应路线16）。（Strongin等，“开发用于检测和增强血液指纹的产荧光试剂”（Developing Fluorogenic Reagents for Detecting and Enhancing BloodyFingerprints）,NCJ227841,Grant Report,2009）。
反应路线16
Figure BDA0000466054340000682
图17-19中示出了每种双对甲氨基酚紫精异构体的能量最小化结构。
可以使用相同的通用程序，分别利用间双(氯甲基)苯或邻双(溴甲基)苯代替对双(溴甲基)苯，按照反应路线11（图15）来合成间位和邻位桥接的紫精结合物。
如反应路线12（图16）中所示来合成包含通过荧光团的上部环连接于紫精骨架的荧光团的桥接的对位双紫精的实施方式。
实施例3
在血液中的发射
将化合物15d（表1）在50%DMSO:50%25mM pH9磷酸盐缓冲液中稀释至40μM。如图30中所示，稀释的化合物产生荧光，其λmax ex=～690nm并且λmax em=～790nm（斯托克斯位移=～100nm，1834cm-1）。将全血（在Na-EDTA中的猪血，Lampire Biological Laboratories）包含在该溶剂的水性部分中以产生5体积%的最终血液浓度，仅引起极少的荧光损失，其归因于血红蛋白吸收和来自于血液组分的散射。发射保持稳定至少1小时。吸收曲线与激光指示器的输出（635-670nm；最大输出<5mW）相匹配。使用数字相机（Kodak EasyShare Z740），在通过Hoya R72相机滤镜（在<690nm时%T<1%，在>750nm时%T>90%）收集的使用8秒曝光获取的NIR照片中，可以明显看见NIR发射（80μM）。使用5%全血观察到类似结果，但是在可见光和NIR图像两者中可以明显看到散射激发光的增加，使用第二滤镜很容易克服这一问题。
然而，化合物15d的吸收与常用激光指示器的输出之间的密切匹配，允许使用简单廉价的光源来激发它。此外，使用商业级数字相机，在正常室内光下并结合廉价的Hoya R72红外滤镜对它的NIR发射进行检测（图30插图）。
在血液溶液中，化合物4a（表1）的吸收是明显可见的，并在延长的时间段内保持稳定。还发现化合物5a（表2）也在5%血液中起作用。它的吸收和荧光光谱随时间衰减，但是在约1小时后仍保持可见（尽管仅具有其原始发射强度的10-20%）。分子建模显示出化合物5f和24与谷胱甘肽的有利的结构相互作用（参见例如图20–化合物24）。
对化合物15g（具有3-1移位的[c]型成环的半萘并罗丹明甲酯（游离胺））的光谱行为进行研究，以确定它用于探测全血中的用途的潜力。在3x3mm比色池中研究化合物15g在10体积%或90体积%全血（在Na-EDTA中的猪血，Lampire Biological Laboratories）中的溶液。首先将荧光团溶解在50mM pH7.4磷酸盐缓冲液中以确保完全溶解，并且在90%全血的情况下，将该储用溶液以1:9的比例与全血混合。在10%全血的情况下，向9份化合物15g储用液的适当稀释（用去离子水）的溶液加入1份全血。在两种情况下，化合物15g的终浓度为150μM，最终磷酸盐缓冲液浓度为5mM。图31A示出了10%全血中的化合物15g与不含化合物的10%全血相比的吸收光谱。在光谱的许多范围中，染料与单独的血液相比产生更大的吸收。两个光谱之间的吸收变化提供了染料的有效吸收。如图31A中所示，存在从约650nm延伸至850nm的相对高透光性的血液“窗口”。这种染料的宽吸收和大的斯托克斯位移，允许在超出血液中血红蛋白的主要峰的波长处具有效率大于50%的显著激发。图31B示出了在670nm处激发后，10%和90%全血样品中化合物15g的发射光谱。如图31B中所示，在两种血液样品中清楚地看到染料发射，其发射光谱最大值为约750nm。图31B中的照片插图证实，10%和90%全血样品（分别为左侧和右侧）几乎不可通过肉眼分辨。
化合物8（具有3-1移位的[c]型全成环的萘并荧光素甲酯）在大于800nm处显示出最大吸收，其远超血液中血红蛋白的吸收。结果，化合物8也可能在血液中性能良好。
实施例4
罗丹明双硼酸的合成和表征
化合物51-半萘并罗丹明双硼酸：参考反应路线9（图13），通过将罗丹明110在160℃下碱水解3小时，以92%的得率获得起始原料2-(4-氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸。使用1:1的CH3SO3H:TFA混合物与1,6-氨基羟基萘进行酸缩合，在使用9:1的CH2Cl2:MeOH通过快速柱层析进行分离后，以63%的得率得到相应的半萘并罗丹明50。分两步在二氯乙烷（DCE）中进行还原性胺化以产生相应的双硼酸51。也可以使用其他溶剂，包括MeCN和THF，但是所需目标产物的得率低（小于1%）。第一步包括将50与2-甲酰基硼酸和三乙酰氧基硼氢化钠在微波辐射下，在130℃反应40分钟。将微波管打开，一次性加入乙酸，并将混合物在130℃继续加热40分钟。将混合物用饱和NaHCO3中和，并使用CH2Cl2:MeOH9:1，通过制备型TLC分离目标化合物。通过1H NMR、HR ESI MS对目标化合物进行表征，并通过反相HPLC确定其纯度（96%）。
化合物53–萘并罗丹明双硼酸：参考反应路线10（图14），通过在三氟甲磺酸存在下在100℃加热2小时，然后在氩气下在140℃继续加热2h，对邻苯二甲酸酐和1,6-氨基羟基萘进行酸催化的缩合，以74%的得率合成萘并罗丹明52。如上所述分两步在DCE中进行还原性胺化以产生相应的双硼酸53。通过用反相HPLC监测反应，获得最佳的反应条件。通过制备型TLC，使用CH2Cl2:MeOH95:5进行洗脱，以38%的得率分离目标化合物。通过1H NMR、HR ESI MS对萘并罗丹明52和目标化合物进行表征，并在C18反相柱和由含H2O:1%TFA的MeCN溶液构成的洗脱用梯度溶剂系统上，通过反相HPLC确定它们的纯度（分别为99%和95%）。
表征：测定了化合物50-53的光谱性质。罗丹明双硼酸51和53以及它们相应的前体50和52的溶液的吸收和荧光光谱被示出在图35a-c（1:9的DMSO：缓冲液）和35d-f（1:1的DMSO：缓冲液）中。在500nm和675nm处激发和监测前体50（2.25μM）和双硼酸化合物51（3.75μM）。在590nm和700nm处激发和监测前体52（12.5μM）和双硼酸化合物53（7.5μM）。激发和发射光谱被归一化至它们在激发波长处的吸光度，并与量子产率成正比。
结果被概述在下面的表5中。1:9的DMSO缓冲液中半萘并罗丹明50的最大吸收在535nm处（与罗丹明110相比红移40nm）。其在628nm处的最大发射显示出19%的合理的量子产率，并且与罗丹明110相比红移约100nm。相应的双硼酸51进一步红移，其中最大吸收和发射分别在560和638nm处。在硼-氮系统中，发射通过光诱导的电子转移（PET）而被略微淬灭，正如由较低的量子产率所表明的。有趣的是注意到，对原始的“RhoBo”和下面讨论的全成环的双硼酸53的淬灭远大于不对称的双硼酸51。
萘并罗丹明52的最大吸收进一步迁移到578nm，并且发射波长和量子产率（668nm，10%）与可商购的萘并荧光素相当。相应的双硼酸53进一步红移，其中最大吸收和发射分别位于628和692nm处。尽管它显示出相当强的蓝色/绿色，但它的荧光几乎被完全淬灭，这允许用作电势开启型传感器。与其他化合物类似，在1:1的DMSO缓冲液中，它的发射略微红移，并且其量子产率略微提高。然而，与其相应的罗丹明前体52类似，它在这种溶剂中主要以闭合且无色的内酯形式存在。
表5
Figure BDA0000466054340000731
apH7.4的磷酸盐缓冲液的终浓度为12.5mM。b溶剂为10mM HEPES,pH7.5,15%(v/v)EtOH；值来自于Leytus等，Biochem.J.209,299(*1983)。c值从Halo等，J.Am.Chem.Soc.131,438(2008)获得。d部分内酯形成。e弱的PET淬灭。f强的PET淬灭，g接近完全的内酯形成。
实施例5
糖的探测和选择性
硼酸探针的响应。在葡萄糖、核糖和果糖在各种溶剂中的广浓度范围内，对化合物51和53进行监测。首先对用于糖探测的包括MeCN、MeOH、EtOH、DMSO和缓冲液在内的溶剂进行筛选。探针在MeCN和缓冲液中部分可溶，并且在MeOH、EtOH和DMSO中可溶。选择DMSO混合物用于进一步研究。
由于这些类型的探针表现出溶剂依赖性的内酯环打开-闭合平衡（反应路线17），进行DMSO滴定以便确定用于糖探测的可能的条件范围。将样品在0-60%DMSO中进行滴定。pH7.4的磷酸盐缓冲液的终浓度为12.5mM。吸光度值如下进行测量：半萘并罗丹明50–532nm，双硼酸51–578nm，萘并罗丹明52–578nm，双硼酸53–627nm。如图36中所示，在较低DMSO浓度下，罗丹明前体50和52以及双硼酸51和53至少在一定程度上作为有色羧酸化物物质存在。随着DMSO浓度增加，除了双硼酸51之外，所有其他化合物以内酯形式占优势（低吸光度值）。对于双硼酸51来说，在这个DMSO浓度范围内羧酸化物形式占优势。在60-90%的DMSO浓度下，对所有化合物来说均发生沉淀；然而，在90%DMSO下，所有化合物均可溶并且主要为它们的无色闭合内酯形式。有趣的是注意到，与相应的罗丹明前体相比，硼酸衍生物不易于形成内酯。
Figure BDA0000466054340000741
在我们以前的工作中，对使用在9:1的DMSO：缓冲液混合物（pH7.4的磷酸盐缓冲液的终浓度为12.5mM）中的这些探针来探测葡萄糖、果糖和核糖进行的初始筛选，显示出不能观察到吸光度或荧光的变化。在室温或37℃下温育长达24小时给出类似的结果。看起来，在这种溶剂中糖的结合不充分改变内酯平衡。
在1:1和1:9的DMSO-缓冲液（pH7.4的磷酸盐缓冲液的终浓度为12.5mM）溶液两者中，进一步研究了在糖存在下化合物51和53两者的光谱行为。两种双硼酸都对糖的结合做出响应，使它们的发射红移并预期荧光强度增加。
图37示出了在上面提到的两种溶剂条件下，双硼酸51对果糖、核糖和葡萄糖的响应。图37a是化合物51（3.75μM）对1:9的DMSO：缓冲液中的10mM糖做出响应的吸收和发射光谱；图37b是荧光发射（激发580nm/发射660nm）随1:9的DMSO：缓冲液中的糖浓度的变化；图37c是化合物51（3.75μM）对1:1的DMSO：缓冲液中的10mM糖做出响应的吸收和发射光谱；图37d是荧光发射（激发580nm/发射640nm）随1:1的DMSO：缓冲液中的糖浓度的变化。pH7.4的磷酸盐缓冲液的终浓度为12.5mM。图37b、37d中的水平线表示不存在被分析物时化合物51的荧光。在1:9DMSO：缓冲液系统中，这种不对称的罗丹明双硼酸对果糖的响应更强（图37a和37b）。在所研究的最低浓度下，对果糖和核糖观察到荧光强度的增加。在高的糖浓度下，对所有三种糖的响应趋于一致。对于所有糖来说，吸光度的接近2倍的增加导致荧光增加超过5倍。发现该溶剂系统对所述响应具有大的影响。在1:1DMSO：缓冲液系统中，双硼酸51对核糖的响应最强（图37c和37d）。在所研究的整个浓度范围内，观察到吸光度和荧光两者增加约1.5倍。与1:9DMSO：缓冲液系统相比，所有三种糖的结合在较低浓度下发生，其中核糖和果糖两者的响应在所研究的最低浓度10mM处已经达到平台期。与1:9的溶剂系统不同，对不同糖的响应存在显著的光谱差异（图37c，相比于图37a）。
在不对称的双硼酸51和对称的双硼酸53的响应之间存在显著差异。图38a-d示出了在1:9和1:1DMSO：缓冲液系统两者中，化合物53对果糖、核糖和葡萄糖的响应。图38a是化合物53（7.5μM）的吸收（630nm）光谱随1:9的DMSO：缓冲液中的糖浓度的变化；图38b是化合物53（7.5μM）的荧光（激发630/发射690nm）光谱随1:9的DMSO：缓冲液中的糖浓度的变化；图38c是化合物53（7.5μM）的吸收（640nm）光谱随1:1的DMSO：缓冲液中的糖浓度的变化；图38d是化合物53（7.5μM）的荧光（激发640/发射700nm）光谱随1:1的DMSO：缓冲液中的糖浓度的变化；pH7.4的磷酸盐缓冲液的终浓度为12.5mM。水平线表示在不存在被分析物的情况下化合物53的吸光度和荧光。在所筛选的三种糖中，在1:9DMSO-缓冲液系统中，化合物53几乎专门地对浓度低于100mM的果糖响应（图38a，38b）。在所研究的最高果糖浓度下，630nm处的吸光度增加低于3倍，引起在630nm处激发后710nm处的荧光发射的超过140倍的开启响应。在对任何糖的响应中没有观察到光谱迁移。吸光度的增加可能至少部分是糖结合后内酯打开的结果。荧光的增加主要是游离罗丹明双硼酸的硼-氮系统中的PET淬灭的几乎完全破坏的结果。据估计，在结合后化合物53的量子产率达到20%或更高（140倍的荧光增加除以3倍的吸光度增加乘以游离化合物53的量子产率=0.186），其大于前体52的量子产率。发色团在结合后的次级相互作用和附加刚化，可能造成这种发射的进一步提高。同样地，发现溶剂系统具有重要影响。在将溶剂系统改变成1:1DMSO-缓冲液后，对核糖的亲和性大幅提高，在所研究的最低浓度（10mM）下接近于对果糖所观察到的响应。发现所有三种糖在较低浓度下的结合增加（图38c和38d），并且在640nm处激发后，所有三种糖的响应趋于一致，即720nm处的发射增加约5倍。1:1DMSO-缓冲液中的游离双硼酸53是无色的，但是糖的结合促进内酯的打开，产生绿-蓝色。
当溶剂系统主要为水性（1:9的DMSO：缓冲液）时，水引起的溶剂化通过盐桥抑制分子内相互作用，允许化合物51中的糖硼酸酯复合物事实上采取毫无问题地接近羧基的任何可能的构象，尤其是对于罗丹明系统的环没有延伸的一侧来说。对于相对低水性的系统（1:1DMSO：缓冲液），由于结合的糖与染料之间的分子内结合相互作用的增强，选择性略微转向核糖。图39示出了化合物51的核糖双硼酸酯的模型，其描述了在1:1DMSO：缓冲液溶液中N-H-O-B原子内的静电相互作用。N-H-O-B原子之间的静电相互作用限制C-B键的旋转，引起对核糖复合物的选择性。只有一个硼酸酯能够接近羧酸化物。
与化合物51相比，化合物53的两个硼酸基团彼此远离并与羧酸化物远离。在1:9DMSO：缓冲液溶剂系统中，选择性遵从正常行为（果糖>核糖>葡萄糖）。当DMSO：缓冲液比例为1:9时，分子内静电相互作用事实上不存在，允许更自由地采取许多可能的构象。如果形成糖双硼酸酯，它们之间的相互作用可以使平面发色团略微弯曲，以允许与羧酸化物相互作用。
在将溶剂系统改变成1:1DMSO-缓冲液后，对称的化合物53对核糖的亲和性大幅提高，在相对低的浓度下接近于对果糖观察到的响应。在这种更加有机的溶剂系统中，不对称的硼酸化合物51逆转其选择性，并且对核糖的响应最强。对于具有1:1比例的DMSO：缓冲液的系统来说，静电相互作用非常弱，但是强得足以限制分子采取许多可能的构象。图40示出了化合物53与两分子果糖的双硼酸酯复合物的模型。
在1:9DMSO：缓冲液系统中，化合物51和53两者表现出选择性趋势（果糖>核糖>葡萄糖）。作为用于选择性测定糖的候选物，化合物53是特别有吸引力的，因为它通过透亮到蓝-绿色的颜色变化专一地对果糖响应，相应的开启NIR荧光增强高达140倍并且没有来自于浓度低于100mM的其他糖的干扰。
实施例6
筛选荧光团
本公开的荧光团-紫精结合物的实施方式可以通过确定每个荧光团的性质来筛选，所述性质：包括1）每种形式（即中性和离子化的）的最大吸收的波长；2）每种形式的摩尔吸收率；3）每种形式的最大激发的波长；4）每种形式的最大发射（对pmt（光电倍增管）响应进行校正）的波长；5）每种形式的以nm和能量两者为单位的斯托克斯位移；6）覆盖包括溶剂加成物、中性和可离子化形式的波长区域（激发335-800nm；发射360-850nm）的完全激发-发射矩阵EEM（对pmt响应进行校正的）；7）每种形式的相对量子产率；和/或8）pKa（或者取决于溶剂的表观pKa）。
包括吸收光谱、激发发射矩阵（EEM）、常见“激光线”激发后的发射光谱和观察到的发射峰的激发光谱和/或pH滴定系列的连续稀释在内的标准化程序，将提供对荧光团-紫精结合物及其各种形式进行表征所需的数据。
筛选可以分为两个步骤。第一步骤是化合物的初始筛选，其包括：
步骤1-A：含有5%DMSO的pH8.25缓冲液（pH8.25接近于或略大于大多数荧光团的可能的pKa（除了提出的氟代衍生物之外），因此阴离子和中性两种形式将以显著（几乎相等）的量存在）中～7.5μM的每种化合物（如果吸收大于约0.25则浓度将被降低，或者如果吸收小于约0.05则浓度将被增加）的单一吸收光谱和EEM。DMSO将有助于中性形式的任何潜在的溶解性问题（如果荧光团足够可溶，DMSO量可以减少）。
步骤1-B：与1-A相同的程序，但是使用5%缓冲液和95%DMSO。
步骤2：对荧光团-紫精结合物的多种浓度（用于摩尔吸收率和量子产率测量）和多种pH（用于pKa测量）进行研究，以寻找最有希望的候选物。当可用时，适合的量子产率标准品将允许估算绝对量子产率。
步骤3：可以使用计算机辅助的分子建模来研究由被分析物和荧光团-紫精结合物的各种几何结构提供的与目标被分析物的潜在相互作用。
结果解释。步骤1A和1B提供了大量初步数据（两种溶剂中的每种物质的吸收和发射最大值，以及两种溶剂中长波长物质的相对量子产率的估算值）。这种初始的第一筛选不提供关于摩尔吸收率、pKa或绝对量子产率的任何信息。可以在步骤2和/或3中进一步研究所选的化合物。
实施例7
检测和定量生物流体中的被分析物
可以对有希望的荧光团-紫精结合物进行研究，以确定它们与目标被分析物（例如GSH、半胱氨酸、高半胱氨酸、SAICAr、S-Ado）的结合，并确定来自于血液和/或尿液的任何潜在的干扰。可以使用用于定量白蛋白染料与血液组分的结合的已知程序（Omoefe等，J.of Biomed.Optics2001,6(3),359-365）。
可以在含有主要的流体组分并掺有目标被分析物的人造血或尿溶液中进行测量。主要的血液组分及其在血液中的平均浓度（mg/L）为：HSA–41,000，HDL–850，LDL–810，球蛋白–32,000，红细胞（43.5%血细胞比容）489,375（Abugo等，J.Biomed.Opt.,2001,6,359-365；Abugo等，Anal.Biochem.,2000,279,142-150）。NASA已充分研究并报告了人类尿液的化学组成（NASA合同报告CR-1802）。模拟的尿液和尿液溶液的组成是基于他们的发现。五种主要组分（尿素、肌酸酐、草酸盐、尿酸和柠檬酸盐）以前已被用于模拟尿液内含物（Ow等，IFMBEProceedings,2008,Vol.21,Part3,Part11,742-745；Osman等，Biomed2008Proceedings2008,21,742-745）。
表观结合常数可以不需任何模型假设而从原始滴定数据直接估算得到；然而，可以使用数据的分析表现来模拟荧光团在具有多种潜在干扰的复杂混合物中的行为。可以使用包括实验滴定曲线的拟合的现象学方法为实验数据建模，并允许粗略估算各种荧光团-紫精结合物在含有生物流体组分的混合物中的结合。测试所有血液（或尿液）组分可能是不可能的；然而，包含主要组分应该足以筛选本公开荧光团的实施方式对目标被分析物的选择性。可以通过将生物流体中的标准品校准曲线与最佳缓冲系统中的标准品校准曲线进行比较，来评估基质效应。
可以根据实验结果并结合进一步的计算机辅助分子模拟，来精细调节选择性。可以使用掺有校准（参比）标准品的样品和使用质量控制（QC）样品，在真正的生物流体中（GSH在血液中，SAICAr和S-Ado在尿液中）进行GSH和SAICAr以及S-Ado的分析。开发的方法可以按照用于方法开发的标准程序来评估，所述程序包括（a）准确度，（b）精确度，（c）选择性，（d）灵敏度，（e）可重复性和（f）稳定性。可以使用标准添加方案来确定被分析物的回收。所使用的所有生物流体可以从商业来源购买。
来自于用于定量溶液中的目标被分析物的最佳条件以及如Orfanos所述（Anal.Biochem.,1980,104,70-74）的类似方法的结果，可以适用于检测和定量沉积在滤纸上的生物流体中的目标被分析物。可以在滤纸上获得干燥的血液（或尿液）样本。对于血液斑点来说，可以从纸上冲出圆盘，并通常将血液内含物洗脱/提取到小体积溶剂中。在常规分析中，来自于血红蛋白的吸收仍然是主要干扰。这通常通过进一步稀释以确保血红蛋白含量低于30μg/ml来克服。这样的稀释使以高浓度存在的被分析物的测量复杂化，并且甚至可能阻止痕量被分析物的分析。基于初步结果（参见实施例3），本公开的NIR荧光团的实施方式在至少5%全血的存在下起作用。因此，将典型的4.8-mm圆盘的内含物提取到小体积（0.6mL或更小，含有我们的荧光团之一）中得到的提取物可以被直接使用而无需稀释。
本公开的荧光团-紫精结合物的某些实施方式的氟代可以促进在水性溶液中的溶解性。在某些情况下，可以向分析溶液添加二硫苏糖醇（DTT）以防止和/或最大限度地降低二硫化物的形成。本公开的荧光团的至少某些实施方式在DTT存在下起作用；此外，监测总GSH-GSSG（通过向溶液添加DTT）是可行的，这是由于约90%的血液GSH处于还原形式，并且在患者和对照两者中谷胱甘肽二硫化物（GSSG）的水平相似（Atkuri等，PNAS U.S.A.,2009,106,3941-3945）。
这些研究使鉴定与目标被分析物强烈并选择性结合的NIR荧光团-紫精结合物成为可能。可以评估结合后的荧光增强，并将其用于确定何种荧光团或荧光团-紫精结合物几何结构和官能团有利于目标被分析物或特定干扰组分。
实施例8
谷胱甘肽选择性评估
可以在对照实验（生理条件下或如果需要在助溶剂存在下的缓冲介质）中进行机制研究，以确定所观察到的本公开的NIR荧光团-紫精结合物对目标被分析物的选择性的起源。结合物、加成物或反应产物可以通过HPLC和LC-MS ESI来分离和表征。分离的复合物、加成物或反应产物的晶体结构可以通过X-射线晶体学来确定。可以使用光谱法来获得目标被分析物与NIR荧光团-紫精结合物之间的复合物形成的结合常数，所述光谱法包括：1H NMR，2D1H NMR（ROESY，NOESY）、UV-vis或荧光。选择性和交叉反应性可以在可能的干扰物（例如对于GSH来说，Cys、Cys-Gly和/或Cys-Glu）存在下进行评估。可以使用光谱法来评估参与选择性/特异性的因素，包括pH、离子强度、缓冲系统的类型和被分析物：NIR荧光团-紫精结合物的摩尔比。
实施例9
选择性检测尿液中的SAICAr和S-Ado
用至少一个硼酸官能团（即-NHRc，其中Rc如上所定义）官能化的本公开的荧光团-紫精结合物的实施方式，可以起到ADLS缺陷症的指示物的作用。可以使用与在实施例5中进行的类似的机制研究和表征研究来确定对SAICAr和/或S-Ado检测的选择性。有希望的候选物可以在尿液和/或合成尿液样品中进行评估。
描述了可能与本公开相关的主题内容或背景信息的其他专利文献包括美国公布号2008/0261315、美国公布号2010/0051826、WO2008/011508和PCT/US2010/062582，其每个以其全文通过参考并入本文。
鉴于本公开发明的原理可以适用于许多可能的实施方式，因此应该认识到，示出的实施方式仅仅是本发明的优选实施例，而不应被当作对本发明范围的限制。相反，本发明的范围由权利要求书限定。因此，我们请求保护落在这些权利要求书的范围和精神之内的所有实施方式作为我们的发明。

Claims (49)

1.式I、式II或式III的化合物，其包含桥接的紫精骨架以及取代基RA和RB：
Figure FDA0000466054330000011
其中X-是任何平衡阴离子，RA和RB独立地是取代或未取代的脂族基团，或包含一个或多个取代或未取代的芳香环和/或杂芳环的取代或未取代的芳基或杂芳基，并且RA和RB中的至少一个是具有通式（i）的结构的荧光团：
Figure FDA0000466054330000021
其中每个描绘成“------”的键根据需要是单键或双键，以满足化合价要求；
X1是O、S、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、CH2、C(CH3)2或NH；
R1、R2、R4独立地是氢、羟基、氧、硫醇、低级烷基、羧基烷基、氨基、取代的氨基、烷氧基、卤素或–NHRc，其中Rc是
Figure FDA0000466054330000022
R5、R7和R8独立地是氢、羟基、硫醇、低级烷基、羧基烷基、氨基、取代的氨基、烷氧基或卤素；
R3和R6独立地是氢、羟基、卤素、氧、硫、硫醇、氨基、烷基氨基、亚氨基、亚胺离子、烷基亚氨基、烷基亚胺离子、环烷基亚氨基或–NHRc；
R1与R2、R2与R3、R3与R4、R5与R6、R6与R7和/或R7与R8中的至少一组一起形成取代或未取代的环烷基或芳基；
R9-R12独立地是氢、烷基、酰基、羧基、硝基、氨基、烷基氨基或-SO3H；
R13是氢、羟基、低级烷基、低级烷氧基、–SO3H或–COOR14，其中R14是氢或低级烷基并且环B中描绘成“------”的键是双键，或者R13是与环B和环D形成环系统的一个或多个原子并且环B中描绘成“------”的键是单键；并且
R1-R13中的至少一个是将所述荧光团共价结合到所述桥接的紫精骨架的连接基，其中如果R3与R4一起形成取代或未取代的环烷基或芳基，则R1和R8中的至少一个不是氢，或者R13不是–COOR14，或者由R1与R2、R2与R3、R5与R6、R6与R7和/或R7与R8形成至少一个附加的取代或未取代的环烷基或芳基。
2.权利要求1的化合物，其中RA和RB中的至少一个是具有通式（iii）、（iv）、（v）、（vi）、（vii）、（viii）、（ix）、（x）或（xi）的结构的荧光团：
Figure FDA0000466054330000031
其中R15-R22独立地是氢、卤素、羟基、氧、硫醇、氨基、烷基氨基、烷氧基、硫、亚氨基、亚胺离子、烷基亚氨基、烷基亚胺离子或–NHRc，其中Rc是
Figure FDA0000466054330000042
并且
R1-R22中的至少一个是将所述荧光团共价结合到所述紫精骨架的连接基，其中如果所述荧光团具有通式（iii）的结构，则R1和R8中的至少一个不是氢，或者R13不是–COOR14。
3.权利要求1的化合物，其中R13是所述连接基并且是式–COO–的连接基。
4.权利要求1的化合物，其中RA和RB两者都是荧光团，每个荧光团独立地具有按照通式（i）选择的结构。
5.权利要求4的化合物，其中RA和RB具有相同的结构。
6.权利要求1的化合物，其中RA和RB中的一个是通式（i）的荧光团，并且RA和RB中的另一个是低级烷基腈、低级烷基取代的苯基、烯基、炔基、取代的香豆素、缩醛或羧酸化物基团。
7.权利要求6的化合物，其中所述RA和RB中的另一个是
Figure FDA0000466054330000051
8.权利要求1的化合物，其中X1是氧。
9.权利要求1的化合物，其中R13是–COO–并形成内酯环，并且R1-R12中的至少一个是所述连接基。
10.权利要求2的化合物，其中R13是–COO–并形成内酯环，并且R1-R12或R15-R22中的至少一个是所述连接基。
11.权利要求1的化合物，其中所述化合物包含至少一个与可离子化部分相邻布置的卤素原子。
12.权利要求1的化合物，其中通式（i）的荧光团在大于或等于700nm的波长处具有发射光谱最大值。
13.权利要求12的化合物，其中所述发射光谱最大值出现在大于或等于750nm的波长处。
14.权利要求1的化合物，其中通式（i）的荧光团具有大于或等于80nm的斯托克斯位移。
15.权利要求14的化合物，其中所述斯托克斯位移大于或等于100nm。
16.权利要求2的化合物，其中所述荧光团具有通式（iii）、（iv）、（ix）或（x）的结构，其中X1是氧并且R18是卤素、羟基、硫醇、氨基、烷基氨基或烷氧基。
17.权利要求2的化合物，其中所述荧光团具有通式（iv）的结构，其中X1是氧并且R19是羟基、硫醇、氧、亚氨基、亚胺离子、烷基亚氨基、烷基亚胺离子、氨基或烷基氨基。
18.权利要求17的化合物，其中R18是卤素、羟基、硫醇、氨基、烷基氨基或烷氧基。
19.权利要求2的化合物，其中所述荧光团具有通式（vi）的结构，其中R17是卤素、羟基、硫醇、氨基、烷基氨基或–NHRc，并且R20是氧、硫、亚氨基、亚胺离子、烷基亚胺离子或-NHRc。
20.权利要求2的化合物，其中所述荧光团具有通式（iii）的结构，其中X1是氧并且R6和R16是–NHRc，或者所述荧光团具有通式（iv）的结构，其中X1是氧并且R16和R21是–NHRc。
21.用于检测被分析物的方法，所述方法包括：
通过将包含被分析物的样品与权利要求1-20任一项的化合物合并来形成溶液；
允许所述溶液中所述被分析物与所述化合物之间的反应进行有效的时间段，以在所述溶液的吸收光谱、发射光谱或两者中产生可检测的变化，其中所述变化指示存在所述被分析物；以及
检测所述变化。
22.权利要求21的方法，其中检测所述变化包括：
将所述溶液暴露于光源下；以及
通过检测来自于所述化合物的荧光，来检测所述被分析物。
23.权利要求22的方法，其中所述光源具有190nm至850nm范围内的波长。
24.权利要求22的方法，其中检测来自于所述化合物的荧光包括在所述反应已进行所述有效的时间段后，检测与所述化合物的发射光谱最大值相对应的波长处的荧光。
25.权利要求24的方法，其中所述化合物在大于或等于700nm的波长处具有发射光谱最大值。
26.权利要求25的方法，其中所述化合物在大于或等于750nm的波长处具有发射光谱最大值。
27.权利要求24的方法，其还包括通过在与所述化合物的发射光谱最大值相对应的波长处测量来自于所述化合物的荧光的量，对所述被分析物进行定量。
28.权利要求21的方法，其中所述样品包括生物流体。
29.权利要求28的方法，其中所述生物流体包括血或尿。
30.权利要求21的方法，其中所述被分析物包含半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽或其组合。
31.权利要求21的方法，其中所述被分析物包含半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷、或琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷与琥珀酰基腺苷的组合。
32.权利要求31的方法，其中所述化合物包含至少一个通式（vi）的荧光团，其中
R1、R4、R5和R8独立地是氢、羟基、硫醇、低级烷基、羧基烷基、氨基、取代的氨基、烷氧基或卤素；
R15-R18独立地是氢、卤素、羟基、硫醇、氨基、烷基氨基、烷氧基或–NHRc；
R19-R22独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、氧、亚氨基、亚胺离子、烷基亚氨基、烷基亚胺离子、氨基、烷基氨基或–NHRc；并且
R1、R4、R5、R8-R13、R15、R16、R18、R19、R21或R22中的至少一个是将所述荧光团共价结合到所述紫精骨架的连接基。
33.权利要求32的方法，其中R13是所述连接基并且是式–COO–的连接基。
34.权利要求32的方法，其中所述被分析物是谷胱甘肽，R17是羟基、氨基或烷基氨基，并且R20是氧、羟基、氨基、烷基氨基、亚氨基或烷基亚胺离子。
35.权利要求32的方法，其中所述被分析物是琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷或其组合，R17和R20中的至少一个是–NHRc，R13是-COOR14，其中R14是氢或低级烷基，并且R9、R10、R11或R12中的一个是所述连接基。
36.权利要求31的方法，其中所述被分析物是琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷或其组合，并且所述化合物包含至少一个通式（iii）的荧光团，其中X1是氧并且R6和R16是–NHRc，或者所述化合物包含至少一个通式（iv）的荧光团，其中X1是氧并且R16和R21是–NHRc。
37.权利要求21的方法，其中检测所述变化包括在所述反应已进行所述有效的时间段后，在一个或多个波长处检测所述溶液的吸光度的变化。
38.权利要求21的方法，其中检测所述变化包括将在将所述样品与所述化合物合并后的第一时间时所述溶液的吸收光谱，与所述反应已进行所述有效的时间段后所述溶液的吸收光谱进行比较。
39.权利要求21的方法，其中检测所述变化包括将在将所述样品与所述化合物合并后的第一时间时所述溶液的发射光谱，与所述反应已进行所述有效的时间段后所述溶液的发射光谱进行比较。
40.权利要求21的方法，其中检测所述变化包括将在与所述化合物反应之前所述溶液的颜色，与在与所述化合物反应所述有效的时间段之后所述溶液的颜色进行比较。
41.用于检测被分析物的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种权利要求1-20任一项的化合物，其中所述化合物在与包含所述被分析物的样品合并时，与不包含所述被分析物的样品中的所述化合物相比，会发生吸收光谱和/或发射光谱的变化。
42.权利要求41的试剂盒，其中所述样品是生物流体。
43.权利要求41的试剂盒，其还包含至少一种缓冲溶液，在所述缓冲溶液中，所述化合物在与包含所述被分析物的样品合并时，与当与所述缓冲溶液和不包含所述被分析物的样品合并时的所述化合物相比，会发生吸收光谱和/或发射光谱的变化。
44.权利要求41的试剂盒，其中所述被分析物包含谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷、琥珀酰基腺苷、或琥珀酰基-5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷与琥珀酰基腺苷的组合。
45.权利要求44的试剂盒，其中所述化合物包含至少一个通式（vi）的荧光团，其中
R1、R4、R5和R8独立地是氢、羟基、硫醇、低级烷基、羧基烷基、氨基、取代的氨基、烷氧基或卤素；
R15-R18独立地是氢、卤素、羟基、硫醇、氨基、烷基氨基、烷氧基或–NHRc；
R19-R22独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、氧、亚氨基、亚胺离子、烷基亚氨基、烷基亚胺离子、氨基、烷基氨基或–NHRc；并且
R1、R4、R5、R8-R13、R15、R16、R18、R19、R21或R22中的至少一个是将所述荧光团共价结合到所述紫精骨架的连接基。
46.权利要求44的试剂盒，其中所述化合物包含至少一个通式（iii）的荧光团，其中X1是氧并且R6和R16是–NHRc，或者所述化合物包含至少一个通式（iv）的荧光团，其中X1是氧并且R16和R21是–NHRc。
47.权利要求41的试剂盒，其还包含用于评估由所述化合物与所述被分析物之间的反应产生的颜色变化的颜色对比图。
48.权利要求41的试剂盒，其还包含多个一次性容器，所述化合物与所述被分析物之间的反应可以在所述容器中进行。
49.权利要求48的试剂盒，其中在所述多个一次性容器中预先称量在与所述被分析物反应时有效地发生吸收光谱、发射光谱或两者的可检测变化的量的所述化合物。
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