CN104356681A

CN104356681A - 一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN104356681A
Application number: CN201410673267.7A
Authority: CN
Inventors: 曾宪顺; 刘畅; 姚慧蓉
Original assignee: Tianjin University of Technology
Current assignee: Tianjin University of Technology
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2015-02-18

Abstract

一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法，采用半萘罗丹明类氧杂蒽荧光探针材料与半萘荧光素和半萘罗丹明类荧光染料相比，该材料受本身共轭体系结构的限制，在不同pH条件下，该材料在水相中具有稳定的pH荧光开启效应，利用氧杂蒽荧光染料制备氧杂蒽染料肼化衍生物可用于汞离子的检测。本发明的优点是：该荧光探针材料具有对pH稳定、光稳定性好、较好的水溶性和良好的细胞膜通透性，并且该氧杂蒽染料的羟基位置和螺环内酯的羧基位置能够很容易被修饰生成生物相关的示踪物，其羧基位置被肼修饰后的衍生物对汞的选择性识别性能显著，能做很好的汞检测荧光探针。

Description

一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及染料分子荧光探针技术领域，尤其是一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法及其应用。

背景技术

荧光分析技术作为现代分析化学中的一种重要方法，是利用荧光分子探针作为检测试剂，通过与检测目标物结合使荧光强度或波长等荧光光学信号发生改变来实现各种分析检测的分析方法。随着计算机科学、光学成像技术及新型探针标记技术等方面的快速发展，极大推动了荧光分析技术在分子生物学、细胞生物学、医药和新药开发等领域的飞速发展。而该技术的关键就是检测信息的试剂即荧光分子探针材料。荧光材料的特性将直接影响到检测结果的准确性、灵敏度，因而开发适用于荧光标识的新型荧光材料将对化学和生物分析检测具有重要的意义。目前用于标记或衍生的荧光探针材料主要有荧光素类、罗丹明类、香豆素类、菁染料、氟硼荧类和邻苯二甲醛类化合物。这些化合物及其衍生物一直是化学和生物分析领域中的研究热点。然而组合构建的系列荧光染料已被证明是一些令人印象深刻的新型荧光探针的候选荧光材料。

目前报道的组合构建的荧光染料主要是半萘荧光素和半萘罗丹明类荧光材料（SNARF）。这类染料在不同酸碱条件下其酚羟基存在酮式结构和带电荷离子间相互转化的情况，结构转化使染料的共轭体系发生改变，对应溶液颜色、吸收波长和发射的波长及荧光强度发生变化，这种结构转化所产生的丰富光学信号变化信息广泛应用于生理环境中pH的变化情况的检测。本发明将利用供电子官能团对光学探针材料内的电子能级调控来发展一类新型的半萘罗丹明类光学荧光材料。这类新型荧光染料与已报道的半萘荧光素和半萘罗丹明类荧光染料相比，在结构上存在如下显著特征：由于受染料本身共轭体系结构的限制，染料中的酚羟基不存在由羟基转化为酮式结构的可能，因此，区别于SNARF类染料在于：染料在水相中具有稳定的pH荧光开启效应，当将这类染料作为光学信号报告基团用于环境样品检测和生物标记时，可获得稳定的荧光光学检测信号。另外，这类染料的结构容易进行化学修饰，可用于离子识别的荧光探针、细胞生物成像等领域。

发明内容

本发明的目的在于针对上述技术现状和存在问题，提供一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法及其应用，该荧光探针在较宽的pH范围内具有稳定紫外吸收和荧光发射光谱信号，有望作为荧光探针材料的光学信号报告基团广泛应用于生物学检测等领域。

本发明的技术方案：

一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法，所述荧光探针为半萘罗丹明类氧杂蒽荧光探针材料1-4，其化学结构式如下所示:

制备步骤如下：

1)将2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰)苯甲酸和1,5-二羟基萘、1，7-二羟基萘、2，6-二羟基萘或对羟基苯酚在甲磺酸中油浴加热搅拌，油浴加热温度为120-150 ℃，反应4-6小时，冷却至室温，得到反应液；

2) 将上述反应液倒入去离子水中搅拌，并用饱和碳酸氢钠水溶液调节至中性（pH=7.0），用乙酸乙酯萃取，干燥后减压蒸馏除去溶剂得到粗产品，用硅胶柱层析分离提纯，得到目标产物1，采用相同的分离方法获得化合物2、3、4。

所述2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰)苯甲酸与1,5-二羟基萘、1,7-二羟基萘、2，6-二羟基萘或对羟基苯酚的摩尔比为1:1；2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰)苯甲酸与1,5-二羟基萘、1,7-二羟基萘、2，6-二羟基萘或对羟基苯酚二者的总重量与溶剂甲磺酸的重量比为1:2-5；

所述反应液与去离子水的体积比为1：7-12；

所述反应液与乙酸乙酯的体积比为1：10-15。

与已报道的半萘荧光素和半萘罗丹明类荧光染料相比，本发明的核心在于：这种染料受本身共轭体系结构的限制，在不同pH条件下，染料中的酚羟基不存在由羟基转化为酮式结构的可能，因此，区别于SNARF类染料，本发明的染料在水相中具有稳定的pH荧光开启效应，具体表现为：本发明提供的荧光化合物在中性和酸性的水样介质中以开环的共轭形式存在，在pH 1.5-9.0的水溶液中522 nm和560 nm处有显著的吸收，609 nm处有明显的发射峰，当pH > 9.0时最大吸收峰红移到583 nm处，荧光发射强度变得很弱，随着pH的增大，溶液颜色从粉色变为紫色，其pKa值分别为3.02和9.67。

化合物1在不同pH中所对应的平衡转化结构式如下式：

。

一种所述pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的应用，利用氧杂蒽荧光染料制备氧杂蒽染料肼化衍生物，用于汞离子的检测。

所述氧杂蒽染料肼化衍生物的制备方法，氧杂蒽染料肼化衍生物5化学结构式如下：

，

其制备方法步骤如下：

1)将半萘罗丹明类氧杂蒽荧光探针材料1、水合肼和无水乙醇按照1：5 :20的摩尔比加入到圆底烧瓶中，避光回流加热24-28小时；

2) 将上述反应液倒入去离子水中搅拌，用二氯甲烷将上述反应液萃取干燥，并减压蒸馏除去溶剂得到粗产品，通过硅胶柱层析提纯得到目标产物为氧杂蒽染料肼化衍生物；得到目标产物为白色固体，目标产物为5，所述反应液与去离子水的体积比为1：7-12，所述反应液与二氯甲烷的体积比为1：10-15。

所述氧杂蒽染料肼化衍生物用于汞离子含量的荧光分析检测的具体方法是：将氧杂蒽染料肼化衍生物作为荧光探针材料，配制成浓度为5×10^-3 M的溶液，将该探针溶液加到检测对象中，使探针的浓度保持在10×10^-6 M，混合均匀之后，立即用528 nm波长的光激发，测定溶液在609 nm波长的发射光谱强度，根据标准曲线确定Hg²⁺的含量。

本发明的优点和有益效果：

该荧光探针材料具有对pH稳定、光稳定性好、较好的水溶性和良好的细胞膜通透性，可在水相pH 3.0-9.5保持荧光信号稳定开启，具有很好的光物理化学性能，并且该氧杂蒽染料的羟基位置和螺环内酯的羧基位置能够很容易被修饰生成生物相关的示踪物，其羧基位置被肼修饰后的衍生物对汞的选择性识别性能显著，能做很好的汞检测荧光探针；另外，得益于其很宽的pH适用范围及良好的细胞膜通透性，该染料被修饰后有望被应用到溶酶体等酸性细胞器中进行稳定的光学标记和识别检测。

附图说明

图1 是将化合物1与L929细胞共同孵育后的荧光显微镜成像图，其中：a为化合物1对活细胞L929(鼠成纤维瘤细胞)染色45分钟的荧光显微照片，b是化合物1对活细胞L929染色45分钟的白场显微照片。

图2为化合物5对汞离子的连续滴定图。

具体实施方式

实施例1：

一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法，所述荧光探针为半萘罗丹明类氧杂蒽荧光探针材料1，其合成路线如下所示:

，

具体制备步骤如下：

1）在250 mL圆底烧瓶中加入2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰)苯甲酸3.13 g（10 mmol）和1,5-二羟基萘1.60 g（10 mmol），边搅拌边逐滴加入甲磺酸15 mL，120 ℃ 反应4 h，冷却至室温，得到反应液；

2) 将上述反应液倒入100 mL去离子水中搅拌，并用饱和碳酸氢钠水溶液调节至中性（pH=7.0），用100mL乙酸乙酯萃取三次，收集有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂后得到粗产品，用硅胶柱层析分离提纯。得到目标产物紫色固体氧杂蒽荧光染料1，3.82 g（即化合物1），产率87%。熔点：> 300 ^oC；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, ppm): 10.45 (1H), 8.08 (2H), 7.83 (1H), 7.77 (1H), 7.74 (1H), 7.54 (1H), 7.32 (1H), 7.10 (1H), 6.97 (1H), 3.44 (4H)1.15 (6H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆, ppm):169.0, 153.99, 153.46, 147.58, 135.69, 130.65, 129.49, 128.25, 126.48, 125.77, 125.22, 124.95, 124.34, 118.54, 113.09, 112.95, 111.56, 111.47, 108.76, 97.91, 97.86, 97.79, 97.75, 97.67, 44.68, 12.85。

制得的化合物1光学性质的测定

将染料化合物1配成浓度为5 × 10^-2 mol/L的DMF溶液，避光保存备用。

1）化合物1在不同溶剂中的光学性质的测定：

将化合物1在不同溶剂中配制成1 × 10^-5 mol/L的待测液3 mL，分别测定其在加入三氟乙酸前后的紫外吸收光谱、荧光发射光谱，在多数有机溶剂中以螺环内酯的结构稳定存在，但对酸较敏感。

2）pH对吸收光谱或荧光光谱影响的测定：将染料化合物1在不同pH（1-14）条件下，配制成1 × 10^-5 mol/L的待测液3 mL。在室温下，分别测定其紫外吸收光谱和荧光发射光谱，根据紫外吸收光谱和荧光发射光谱数据拟合得到化合物1的pKa值分别为3.02和9.67。

倒置荧光显微镜下观察化合物1对活细胞L929的染色实施实例:

加配有化合物 1的浓度为10 μM的DMSO溶液5 μL于培养好的L929细胞的24孔培养板中，在37 ℃，5%CO₂的细胞培养箱中孵育45 min，然后，PBS震荡漂洗1 min×3, 再加入细胞培养基，倒置荧光显微镜(Nikon)观察细胞形态，选取代表性区域，绿色波段激发,用物镜（40×）观察，重复三次，图1a为化合物1对活细胞L929染色45 min的白场显微照片1b是化合物1对活细胞L929染色45 min后的绿色通道荧光显微照片，所用仪器为倒置荧光显微镜，型号:Nikon Eclipse TE2000U。

该pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的应用，利用氧杂蒽荧光染料制备氧杂蒽染料肼化衍生物，用于汞离子的检测。所述氧杂蒽染料肼化衍生物的制备方法，氧杂蒽染料肼化衍生物5化学结构式如下：

其制备方法，具体步骤如下：

1)将半萘罗丹明类氧杂蒽荧光探针材料1（0.22 g, 0.5 mmol）、水合肼（1 mL）和无水乙醇（5 ml）按照1：5 :20的摩尔比加入到圆底烧瓶中，将反应体系温度调至95 ℃回流26 h；

2) 反应完毕后，冷却静置至室温，将反应液倒入50 mL去离子水中搅拌，用80mL二氯甲烷将上述反应液萃取三次，干燥，并减压蒸馏除去溶剂得到粗产品，通过硅胶柱层析提纯得到目标产物为氧杂蒽染料肼化衍生物；得到目标产物为白色固体，目标产物为5，79 mg，产率35%。熔点：257 -259 ℃；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, ppm): 10.24 (1H), 7.96 (1H), 7.85 (1H), 7.71 (1H), 7.51 (2H), 7.46 (1H), 7.03 (1H), 7.02 (1H), 6.95 (1H), 6.66 (1H), 6.52 (1H), 6.42 (1H), 4.41 (2H), 3.36 (4H), 1.12 (6H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆, ppm): 166.03, 153.77, 153.00, 151.91, 148.88, 147.53, 133.10, 129.02, 128.19, 127.47, 125.51, 124.20, 122.86, 122.47, 117.54, 114.11, 112.53, 110.17, 109.11, 105.34, 98.22, 65.59, 44.16, 12.96。

所述氧杂蒽染料肼化衍生物用于汞离子含量的荧光分析检测的具体方法是：

将上述制得的4.5 mg氧杂蒽染料肼化衍生物5溶解在2 mL的 N,N-二甲基甲酰胺中制成5×10^-3 M的无色溶液，取200 μL上述溶液到100 mL容量瓶中，再加入去离子水和乙醇体积比为1:1溶剂，定容到100 mL而获得1×10^-5 M的溶液。在21个3 mL样品瓶中分别加入1×10^-5 M的溶液3 mL，然后依次加入0、0.033，0.067， 0.13， 0.27， 0.53 0.80， 1.07， 1.33， 1.60， 1.87,2.13， 2.40，2.67， 2.93， 3.20， 3.47， 3.73， 4.27， 4.80， 5.80当量的汞离子(Hg²⁺)并混合均匀。采用528 nm的作为激发波长测定其609 nm波长处荧光发射光谱。然后用609 nm处的荧光发射强度对[Hg²⁺]/[主体5]作图而得到标准工作曲线。根据标准曲线确定Hg²⁺的含量。图2为化合物5对汞离子的连续滴定图，图中表明：在528 nm光激发下，化合物5自身荧光不强，随着汞离子（Hg²⁺）的加入，609 nm处的荧光逐渐升高，并在[Hg²⁺]/[主体5] > 3.2时达到平衡状态，更多的汞离子加入不会引起荧光强度的变化。

实施例2：

一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法，所述荧光探针为半萘罗丹明类氧杂蒽荧光探针材料2，合成路线如下所示:

，

具体制备步骤如下：

在250 mL圆底烧瓶中加入2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰)苯甲酸2.99 g（10 mmol），1,7-二羟基萘1.60 g（10 mmol），边搅拌边逐滴加入甲磺酸15 mL，120 ℃反应4 h后停止。将上述反应液冷却至室温，倒入100 mL去离子水中搅拌，用饱和碳酸氢钠水溶液将反应液的pH调节至中性(pH=7.0)。然后，将混合溶液用乙酸乙酯(100 mL)萃取三次。收集有机相用无水硫酸钠干燥，并减压蒸馏除去溶剂得到粗产品，用硅胶柱层析分离提纯。得到目标产物氧杂蒽荧光染料2为红棕色固体3.35 g，产率70%；熔点278-280 ℃； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, ppm) δ 10.32 (1H), 8.58 (1H), 8.26 (1H), 7.63 (2H), 7.16 (2H), 6.65 (2Hz), 6.63 (1H), 6.42 (1H), 6.00 (1H), 3.40 (4H), 1.21 (6H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆, ppm): 169.79, 157.40, 153.81, 152.87, 150.22, 146.35, 136.45, 130.98, 130.46, 129.61, 129.14, 127.16, 125.71, 125.55, 125.05, 124.00, 121.02, 120.97, 113.77, 110.02, 105.42, 104.62, 97.96, 49.53, 44.77, 13.28。

制得的化合物2光学性质的测定及倒置荧光显微镜下观察化合物2对活细胞L929的染色的操作方法与实施例1相同。

实施例3：

一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法，所述荧光探针为半萘罗丹明类氧杂蒽荧光探针材料3，合成路线如下所示:

，

具体制备步骤如下：

在250 mL圆底烧瓶中加入2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰)苯甲酸3.12 g（10 mmol），2,6-二羟基萘1.63 g（10 mmol），边搅拌边逐滴加入甲磺酸13 mL，125 ℃反应4 h后停止。将上述反应液冷却至室温，倒入120 mL去离子水中搅拌，用饱和碳酸氢钠水溶液将反应液的pH调节至中性。然后，将混合溶液用100 mL乙酸乙酯萃取三次。收集有机相用无水硫酸钠干燥，并减压蒸馏除去溶剂得到粗产品，用硅胶柱层析分离提纯。得到目标产物氧杂蒽荧光染料3为红棕色固体2.66 g，产率62%；熔点252-254 ℃； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, ppm) δ 10.19 (1H), 8.30 (1H), 8.26 (2H), 7.76 (2H), 7.48 (2H), 7.36 (2Hz), 6.95 (1H), 6.42 (1H), 6.35 (1H), 3.52 (4H), 1.17 (6H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆, ppm): 169.77, 157.35, 153.22, 152.78, 150.12, 146.35, 136.45, 130.98, 130.46, 129.61, 129.31, 127.16, 125.71, 125.47, 125.05, 124.00, 121.02, 120.97, 113.79, 110.18, 105.42, 104.41, 97.56, 49.81, 44.73, 12.28。

制得的化合物3光学性质的测定及倒置荧光显微镜下观察化合物3对活细胞L929的染色的操作方法与实施例1相同。

实施例4：

一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法，所述荧光探针为半萘罗丹明类氧杂蒽荧光探针材料4，合成路线如下所示:

，

具体制备步骤如下：

在250 mL圆底烧瓶中加入2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰)苯甲酸3.12 g（10 mmol），对羟基苯酚1.12 g（10 mmol），边搅拌边逐滴加入甲磺酸13 mL，125 ℃反应4 h后停止。将上述反应液冷却至室温，倒入120 mL去离子水中搅拌，用饱和碳酸氢钠水溶液将反应液的pH调节至中性。然后，将混合溶液用120 mL乙酸乙酯)萃取三次。收集有机相用无水硫酸钠干燥，并减压蒸馏除去溶剂得到粗产品，用硅胶柱层析分离提纯。得到目标产物氧杂蒽荧光染料4为粉色固体3.05 g，产率78%；熔点188-190 ℃； ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, ppm): 9.32 (1H), 8.02 (1H), 7.81 (1H), 7.73 (1H), 7.30 (1H), 7.20 (1H), 6.89 (1H), 6.50-6.42 (3H), 6.06 (1H), 3.34 (4H), 1.09 (6H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆, ppm): 169.20, 153.51, 152.97, 149.74, 144.59, 136.03, 129.11, 126.68, 125.04, 124,56, 119.10, 116.13, 112.43, 108.85, 104.30, 97.30, 84.19, 44.22, 40.21, 40.00, 39.79, 39.58,12.77。

制得的化合物4光学性质的测定及倒置荧光显微镜下观察化合物4对活细胞L929的染色的操作方法与实施例1相同。

本发明所述的氧杂蒽类染料化合物1-4具备以下特点:

所述化合物在多数有机溶剂中以螺环内酯的结构稳定存在，但对酸较敏感。相反，在中性和酸性的水样介质中以开环的共轭形式存在。

所述新化合物产品毒副性小，原料易得，结构简单，易于制备，易产业化，通过一步反应即可得到。

所述化合物其氧杂蒽的羟基位置和螺环内酯的羧基位置能够很容易被修饰从而得到可用于细胞成像的荧光探针。对其羧基位置的修饰已合成的化合物为其肼衍生物5，其中肼衍生物5能选择性识别重金属汞离子，可根据标准曲线确定汞离子的含量。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法，其特征在于：所述荧光探针为半萘罗丹明类氧杂蒽荧光探针材料1-4，其化学结构式如下所示:

制备步骤如下：

2.根据权利要求1所述pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法，其特征在于：所述2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰)苯甲酸与1,5-二羟基萘、1,7-二羟基萘、2，6-二羟基萘或对羟基苯酚的摩尔比为1:1；2-(4-二乙氨基)-2-羟基苯甲酰)苯甲酸与1,5-二羟基萘、1,7-二羟基萘、2，6-二羟基萘或对羟基苯酚二者的总重量与溶剂甲磺酸的重量比为1:2-5。

3.根据权利要求1所述pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的制备方法，其特征在于：所述反应液与去离子水的体积比为1：7-12；所述反应液与乙酸乙酯的体积比为1：10-15。

4.一种如权利要求1所述pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的应用，其特征在于：利用氧杂蒽荧光染料制备氧杂蒽染料肼化衍生物，用于汞离子的检测。

5.根据权利要求4所述pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的应用，其特征在于：所述氧杂蒽染料肼化衍生物的制备方法，氧杂蒽染料肼化衍生物5化学结构式如下：

，

其制备方法步骤如下：

6.根据权利要求4所述pH稳定氧杂蒽染料荧光探针的应用，其特征在于：所述氧杂蒽染料肼化衍生物用于汞离子含量的荧光分析检测的具体方法是：将氧杂蒽染料肼化衍生物作为荧光探针材料，配制成浓度为5×10^-3 M的溶液，将该探针溶液加到检测对象中，使探针的浓度保持在10×10^-6 M，混合均匀之后，立即用528 nm波长的光激发，测定溶液在609 nm波长的发射光谱强度，根据标准曲线确定Hg²⁺的含量。