CN102127421A

CN102127421A - 一种铜离子和汞离子荧光分子探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102127421A
Application number: CN2010106010704A
Authority: CN
Inventors: 袁跃华; 田茂忠; 朱永军; 白云峰; 冯锋; 郭永; 孟双明
Original assignee: Shanxi Datong University
Current assignee: Shanxi Datong University
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2011-07-20

Abstract

本发明涉及一种铜离子和汞离子荧光分子探针及其制备方法和应用。本发明主要针对现有技术中检测铜离子或汞离子的荧光分子探针存在检测离子单一、多数荧光分子探针的灵敏度低、选择性差和对pH值敏感等问题。本发明荧光分子探针的制备包括以下步骤：1)取1份罗丹明B溶解在乙醇中，室温下加入2～5份水合肼，搅拌回流1～2小时，冷却，过滤沉淀；2)取1份沉淀加入50～500份体积比为3∶1的甲醇/二氯甲烷的混合溶剂中，再加入2～6份质量分数为40～60％的甲醛水溶液，在氮气保护下，室温搅拌6～8小时，减压蒸去溶剂，硅胶色谱分离得到荧光分子探针。本发明具有荧光量子产率高，对溶剂极性不敏感，并且化学/光稳定性好等优点。

Description

一种铜离子和汞离子荧光分子探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种铜离子和汞离子荧光分子探针，具体涉及一种基于罗丹明染料的铜离子和汞离子荧光分子探针及其制备方法及该荧光分子探针在精细化工领域中识别和检测中的应用。

背景技术

铜是生物体中基本的微量元素之一，在不同的生理过程中铜作为催化辅助因子起着很重要的作用，如线粒体的呼吸、铁的吸收、大量酶的氧化还原过程(包括超氧化歧化酶、酪氨酸酶等)等。但是，在生物体内摄入过量的铜也会产生毒性，能引起Wilson’s、Menkes和Alzheimer’s等神经性疾病。由于人类长期大量对铜的过度使用，铜也成为环境中的一种重要污染物，但和其它有毒重金属相比，铜对生物体的毒性相对较低，美国环保局(EPA)规定饮用水中铜离子的最高限为20μM。由于铜对人类的生存和发展具有重要意义，所以检测铜离子，尤其是跟踪其在化学反应和生命活动中的作用过程就变成一件很有意义的事情。

汞污染主要来源于海洋和火山喷发、金矿开采、废物焚烧等。微生物可以把排放到环境中的Hg²⁺转化为甲基汞，然后通过食物链在生物体内蓄积，进入人体后，会损伤肾功能，毒性极大。因此，Hg²⁺的检测也有着非常重要的意义。

目前，有多种测定铜离子和汞离子的方法，在众多方法中，荧光分析法有很多优点：荧光检测灵敏度高(可实现单分子检测)、选择性好、成本低、易操作、适用面广、对亚微粒可以实现可视的亚纳米空间分辨和亚毫秒时间分辨，故通过荧光信号输出铜离子和汞离子识别事件已备受科学家们重视。

近年来有许多铜离子和汞离子荧光分子探针的报道。但由于这两种离子对荧光都具有极强的猝灭性，因此大多数报道的铜离子和汞离子荧光分子探针是荧光猝灭型的。由于探针识别客体时荧光猝灭不仅不利于高通量信号输出，而且其它猝灭过程也易引起干扰，所以，开发高灵敏、高选择性的荧光增强型铜离子和汞离子荧光分子探针具有重要的应用价值和广阔的发展前景。罗丹明染料衍生物无色、没有荧光，但它的螺酰胺环开环会产生鲜艳的玫瑰色和强的荧光。最近，基于这种开环识别的机理已被用来制备荧光增强型铜离子和汞离子荧光分子探针。有关罗丹明类铜离子荧光分子探针代表性的报道是Czarnik A W等研究的铜离子荧光分子探针和Tong A J等研究的铜离子荧光分子探针等。有关罗丹明类汞离子荧光分子探针代表性报道的是Tae J等研究的汞离子荧光分子探针和Zheng H等研究的汞离子荧光分子探针等。但是，他们报道的分子探针都只能检测铜离子或汞离子中的一种，且对溶剂的极性和pH值条件要求较高。

发明内容

本发明主要针对现有技术中检测铜离子或汞离子的荧光分子探针存在检测离子单一、多数荧光分子探针的灵敏度低、选择性差和对pH值敏感等问题，而提供一种可同时检测铜离子和汞离子、高灵敏度、高选择性和对pH值不敏感的铜离子和汞离子荧光分子探针。

本发明的另一目的是提供该荧光分子探针的制备方法和应用。

本发明荧光分子探针，具有以下结构式：

具体制备方法包括以下步骤：

1)取1份罗丹明B溶解在乙醇中，室温下加入2～5份水合肼，搅拌回流1～2小时，冷却，过滤沉淀；

2)取1份沉淀加入50～500份体积比为3∶1的甲醇/二氯甲烷的混合溶剂中，再加入2～6份质量分数为40～60％的甲醛水溶液，在氮气保护下，室温搅拌6～8小时，减压蒸去溶剂，硅胶色谱分离得到荧光分子探针；

其中，所述的份数均为质量份数。

反应方程式为：

为表明本发明荧光分子探针的结构，本发明作了如下分析：

元素分析C₂₉H₃₂N₄O₂：H，6.88；C，74.33；N，11.96；实验测得：H，6.93；C，74.26；N，11.63；在氘代氯仿中核磁共振氢谱信号为(化学位移，单位ppm)：7.91(d，J＝7.2Hz，1H)，7.46-7.49(m，2H)，7.05(d，J＝7.6Hz，1H)，6.48-6.52(m，4H)，6.25(s，2H)，3.68(s，2H)，3.37(q，J＝7.2Hz，8H)，1.13(t，J＝7.2Hz，12H)；电喷雾软电离正离子质谱信号为质荷比为469.2，根据分析数据可以判断该物质为本发明荧光分子探针。

本发明分子探针可用于检测铜离子和汞离子，具体应用方法如下：

铜离子含量测定：首先按照1～9∶1的体积比将水和乙腈混合均匀，室温下静置1～60分钟，然后加入本发明分子探针使分子探针浓度为1μM，制成标准溶剂，然后用制成的标准溶剂配制成铜离子浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90和100μM的铜离子标准溶液，采用Lambda35荧光分光光度计，在激发波长为510nm，发射波长为565nm时分别测定不同铜离子浓度时的荧光强度，作成标准曲线，然后在待测样品中同样加入本发明荧光分子探针，使其浓度为1μM，采用相同的方法测定待测样的荧光强度，然后根据标准曲线计算出待测样中的铜离子浓度。

汞离子含量测定：首先按照1～9∶1的体积比将水和乙醇混合均匀，室温下静置1～60分钟，然后加入本发明分子探针使分子探针浓度为1μM，制成标准溶剂，然后用制成的标准溶剂配制成汞离子浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90和100μM的汞离子标准溶液，采用Lambda35荧光分光光度计，在激发波长为510nm，发射波长为572nm时分别测定不同汞离子浓度时的荧光强度，作成标准曲线，然后在待测样品中同样加入本发明荧光分子探针，使其浓度为1μM，采用相同的方法测定待测样的荧光强度，然后根据标准曲线计算出待测样中的汞离子浓度。

本发明还做了以下验证：

一、加入铜离子前后本发明荧光分子探针荧光强度的变化：

样1：按照3∶1的体积比将水和乙腈混合均匀，室温下静置30分钟，加入本发明荧光分子探针浓度为1μM，采用Lambda35荧光分光光度计测定该探针的荧光强度为1.3(发射波长在565nm处)；

样2：按照3∶1的体积比将水和乙腈混合均匀，室温下静置30分钟，加入本发明荧光分子探针浓度为1μM，将铜离子标准液加入上述混合液中，配制成铜离子浓度为50μM的待测样品，采用Lambda35荧光分光光度计测定该探针的荧光强度为606(发射波长在565nm处)。

测定结果表明铜离子可以显著增强本发明荧光分子探针的荧光强度。

二、加入汞离子前后本发明荧光分子探针荧光强度的变化：

样3：按照3∶1的体积比将水和乙醇混合均匀，室温下静置30分钟，本发明荧光分子探针浓度为1μM，采用Lambda35荧光分光光度计测定该探针的荧光强度为2.1(发射波长在572nm处)；

样4：按照3∶1的体积比将水和乙醇混合均匀，室温下静置30分钟，加入本发明荧光分子探针浓度为1μM，将汞离子标准液加入上述混合液中，配制成汞离子浓度为50μM的待测样品，采用Lambda35荧光分光光度计测定该探针的荧光强度为636(发射波长在572nm处)。

测定结果表明汞离子可以显著增强本发明荧光分子探针的荧光强度。

三、常见金属离子对铜离子的干扰：

样5，按照3∶1的体积比将水和乙腈混合均匀，室温下静置30分钟，加入本发明分子探针浓度为1μM，Cu²⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Mn²⁺，Cd²⁺，Cr³⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Ag⁺，Pb²⁺，Zn²⁺，Fe³⁺和Hg²⁺浓度均为50μM，采用Lambda35荧光分光光度计，激发波长为510nm，最大发射波长为565nm时测定不同金属离子的荧光强度，结果见图1，从图中可以看出常见金属离子对铜离子干扰很小，汞离子对铜离子的干扰也很小。

四、常见金属离子对汞离子的干扰：

样6，按照3∶1的体积比将水和乙醇混合均匀，室温下静置30分钟，加入本发明分子探针浓度为1μM，Hg²，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Mn²⁺，Cd²⁺，Cr³⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Ag⁺，Pb²⁺，Zn²⁺，Fe³⁺，Cu²⁺浓度均为50μM，采用Lambda35荧光分光光度计，激发波长为510nm最大发射波长为572nm时测定不同金属离子的荧光强度，结果见图2，从图中可以看出常见金属离子对汞离子干扰很小，铜离子对汞离子的干扰也很小。

本发明荧光分子探针与现有技术相比具有以下有益效果：

第一，本发明荧光分子探针在测试中的激发波长和发射波长都在可见区，其荧光量子产率高，对溶剂极性不敏感，并且化学/光稳定性好。

第二，本发明荧光分子探针的设计是基于罗丹明螺酰胺环“关-开”原理，分子探针在乙腈/水溶液体系中识别铜离子前后荧光强度大幅度增大，对铜离子可以很好地识别，常见金属离子(Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Mn²⁺，Cd²⁺，Cr³⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Ag⁺，Pb²⁺，Zn²⁺，Fe³⁺，Hg²⁺)对其检测干扰很小；但是，此分子探针在乙醇/水溶液体系中识别汞离子前后荧光强度大幅度增大，对汞离子可以很好地识别，常见金属离子(Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Mn²⁺，Cd²⁺，Cr³⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Ag⁺，Pb²⁺，Zn²⁺，Fe³⁺，Cu²⁺)对其检测干扰很小。

第三，本发明荧光分子探针对pH不敏感，可以在很宽的pH范围内(pH 5.0～10.5)对铜离子和汞离子实施检测。

附图说明

图1是常见金属离子对铜离子的荧光发射光谱干扰图；

图2是常见金属离子对汞离子的荧光发射光谱干扰图。

具体实施方式

实施例1

1)取1千克罗丹明B溶解在30千克乙醇中，室温下加入2千克水合肼，搅拌回流1小时，冷却，过滤沉淀；

2)取1千克沉淀加入50千克体积比为3∶1的甲醇/二氯甲烷的混合溶剂中，再加入2千克质量分数为40％的甲醛水溶液，在氮气保护下，室温搅拌6小时，减压蒸去溶剂，硅胶色谱分离得到荧光分子探针。

具体应用：

铜离子含量检测：按照1∶1的体积比将水和乙腈混合均匀，室温下静置1分钟，然后将本实施例分子探针加入上述混合溶液中，并使其浓度为1μM，制成标准溶剂，然后用制成的标准溶剂配制浓度为0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90和100μM的铜离子标准溶液，采用Lambda35荧光分光光度计，在激发波长为510nm，发射波长为565nm时分别测定不同铜离子浓度时溶液的荧光强度，作成标准曲线。然后模拟实际条件用自来水配制成铜离子浓度为10μM的待测样品(10个)，并在待测样品中同样加入本实施例荧光分子探针，使其浓度为1μM，采用相同的方法测定待测样的荧光强度，然后根据标准曲线计算出待测样中的铜离子浓度为9.87μM，标准偏差是1.6。

汞离子含量测定：按照1∶1的体积比将水和乙醇混合均匀，室温下静置1分钟，然后将本实施例分子探针加入上述混合溶液中，并使其浓度为1μM，制成标准溶剂，然后用制成的标准溶剂配制浓度为0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90和100μM的汞离子标准溶液，采用Lambda35荧光分光光度计，在激发波长为510nm，发射波长为572nm时分别测定不同汞离子浓度时溶液的荧光强度，作成标准曲线，然后模拟实际条件用自来水配制成汞离子浓度为15μM的待测样品(10个)，并在待测样品中同样加入本实施例荧光分子探针，使其浓度为1μM，采用相同的方法测定待测样的荧光强度，然后根据标准曲线计算出待测样中的汞离子浓度为15.31μM，标准偏差是3.1。

实施例2

1)取1千克罗丹明B溶解在40千克乙醇中，室温下加入4千克水合肼，搅拌回流1.5小时，冷却，过滤沉淀；

2)取1千克沉淀加入200千克体积比为3∶1的甲醇/二氯甲烷的混合溶剂中，再加入4千克质量分数为50％的甲醛水溶液，在氮气保护下，室温搅拌7小时，减压蒸去溶剂，硅胶色谱分离得到荧光分子探针。

具体应用：

铜离子含量检测：按照3∶1的体积比将水和乙腈混合均匀，室温下静置30分钟，然后将本实施例分子探针加入上述混合溶液中，并使其浓度为1μM，制成标准溶剂，然后用制成的标准溶剂配制浓度为0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90和100μM的铜离子标准溶液，采用Lambda35荧光分光光度计，在激发波长为510nm，发射波长为565nm时分别测定不同铜离子浓度时溶液的荧光强度，作成标准曲线，然后模拟实际条件用自来水配制成铜离子浓度为10μM的待测样品(10个)，并在待测样品中同样加入本实施例荧光分子探针，使其浓度为1μM，采用相同的方法测定待测样的荧光强度，然后根据标准曲线计算出待测样中的铜离子浓度为10.15μM，标准偏差是2.1。

汞离子含量测定：按照3∶1的体积比将水和乙醇混合均匀，室温下静置30分钟，然后将本实施例分子探针加入上述混合溶液中，并使其浓度为1μM，制成标准溶剂，然后用制成的标准溶剂配制浓度为0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90和100μM的汞离子标准溶液，采用Lambda35荧光分光光度计，在激发波长为510nm，发射波长为572nm时分别测定不同汞离子浓度时溶液的荧光强度，作成标准曲线，然后模拟实际条件用自来水配制成汞离子浓度为15μM的待测样品(10个)，并在待测样品中同样加入本实施例荧光分子探针，使其浓度为1μM，采用相同的方法测定待测样的荧光强度，然后根据标准曲线计算出待测样中的汞离子浓度为15.13μM，标准偏差是1.7。

实施例3

1)取1千克罗丹明B溶解在50千克乙醇中，室温下加入5千克水合肼，搅拌回流2小时，冷却，过滤沉淀；

2)取1千克沉淀加入500干克体积比为3∶1的甲醇/二氯甲烷的混合溶剂中，再加入6千克质量分数为60％的甲醛水溶液，在氮气保护下，室温搅拌8小时，减压蒸去溶剂，硅胶色谱分离得到荧光分子探针。

具体应用：

铜离子含量检测：按照9∶1的体积比将水和乙腈混合均匀，室温下静置60分钟，然后将本实施例分子探针加入上述混合溶液中，并使其浓度为1μM，制成标准溶剂，然后用制成的标准溶剂配制浓度为0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90和100μM的铜离子标准溶液，采用Lambda35荧光分光光度计，在激发波长为510nm，发射波长为565nm时分别测定不同铜离子浓度时溶液的荧光强度，作成标准曲线，然后模拟实际条件用自来水配制成铜离子浓度为10μM的待测样品(10个)，并在待测样品中同样加入本实施例荧光分子探针，使其浓度为1μM，采用相同的方法测定待测样的荧光强度，然后根据标准曲线计算出待测样中的铜离子浓度为10.33μM，标准偏差是3.5。

汞离子含量测定：按照9∶1的体积比将水和乙醇混合均匀，室温下静置60分钟，然后将本实施例分子探针加入上述混合溶液中，并使其浓度为1μM，制成标准溶剂，然后用制成的标准溶剂配制浓度为0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90和100μM的汞离子标准溶液，采用Lambda35荧光分光光度计，在激发波长为510nm，发射波长为572nm时分别测定不同汞离子浓度时溶液的荧光强度，作成标准曲线，然后模拟实际条件用自来水配制成汞离子浓度为15μM的待测样品(10个)，并在待测样品中同样加入本实施例荧光分子探针，使其浓度为1μM，采用相同的方法测定待测样的荧光强度，然后根据标准曲线计算出待测样中的汞离子浓度为14.79μM，标准偏差是3.3。

Claims

1.一种铜离子和汞离子荧光分子探针，其特征是具有以下结构式：

2.权利要求1所述铜离子和汞离子荧光分子探针的制备方法，其特征是包括以下步骤：

2)取1份沉淀加入50～500份体积比为3∶1的甲醇/二氯甲烷的混合溶剂中，再加入2～6份质量分数40～60％的甲醛水溶液，在氮气保护下，室温搅拌6～8小时，减压蒸去溶剂，硅胶色谱分离得到荧光分子探针；

其中，所述的份数均为质量份数。

3.根据权利要求1所述的铜离子和汞离子荧光分子探针的应用，其特征是用于铜离子含量的测定，具体应用方法如下：

铜离子含量的测定：首先按照1～9∶1的体积比将水和乙腈混合均匀，室温下静置1～60分钟，然后加入本发明分子探针使分子探针浓度为1μM，制成标准溶剂，然后用制成的标准溶剂配制成铜离子浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90和100μM的铜离子标准溶液，采用Lambda35荧光分光光度计，在激发波长为510nm，发射波长为565nm时分别测定不同铜离子浓度时的荧光强度，作成标准曲线，然后在待测样品中同样加入本发明荧光分子探针，使其浓度为1μM，采用相同的方法测定待测杆的荧光强度，然后根据标准曲线计算出待测样中的铜离子浓度。

4.根据权利要求1所述的铜离子和汞离子荧光分子探针的应用，其特征是用于汞离子含量的测定，具体应用方法如下：

首先按照1～9∶1的体积比将水和乙醇混合均匀，室温下静置1～60分钟，然后加入本发明分子探针使分子探针浓度为1μM，制成标准溶剂，然后用制成的标准溶剂配制成汞离子浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90和100μM的汞离子标准溶液，采用Lambda35荧光分光光度计，在激发波长为510nm，发射波长为572nm时分别测定不同汞离子浓度时的荧光强度，作成标准曲线，然后在待测样品中同样加入本发明荧光分子探针，使其浓度为1μM，采用相同的方法测定待测样的荧光强度，然后根据标准曲线计算出待测样中的汞离子浓度。