CN104327846B - 一种含刚性结构罗丹明的Hg2+比率荧光探针及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于配位化学领域,具体涉及一种基于刚性结构罗丹明的Hg²⁺比率荧光探针分子及其制备方法与应用。本发明以刚性结构罗丹明为母体,用二乙烯三胺和NBD修饰而得螺酰胺形式的比率荧光探针OMRh101-DETA-NBD,其具有如下结构：该探针分子在汞离子与其它多种金属离子共存体系中，表现出抗干扰能力强的选择性高，灵敏度高，响应快，可逆操作等特点，可以很好地应用于环境中汞离子检测。

Description

一种含刚性结构罗丹明的Hg2+比率荧光探针及制备方法

技术领域

本发明涉及一种含刚性结构罗丹明的Hg²⁺比率荧光探针及制备方法，属配位化学领域。

背景技术

金属离子检测在化学、环境科学、生物学、临床诊断和医学等领域中非常重要。一些金属离子如Cu²⁺，Mg²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺等在生命过程中具有非常重要的功能。有些重金属离子如Pb²⁺，Hg²⁺，Cd²⁺等在很低浓度时就对生物具有极强的毒性。所以检测环境或生物体系中的金属离子非常有意义。由于荧光信号非常灵敏，容易检测，其检测的下限浓度较低，近年来，科学家们对以荧光为输出信号的重金属及过渡金属离子化学传感器(重金属及过渡金属离子荧光探针)越来越感兴趣。其设计原理是将识别单元和作为信号单元的荧光团直接或通过空间间隔相连，通过识别单元与金属离子选择性地作用，并将识别信息转换成荧光信号，实现在分子水平上的原位和实时检测。

罗丹明(Rhodamine)类荧光染料具有摩尔消光系数高、光稳定性好、荧光量子产率高、激发波长和发射波长较长等优异的光物理和光化学性能，可以通过对罗丹明的氧杂蒽母体或底环进行修饰以满足不同使用条件(例如:最大吸收波长，最大发射波长，量子产率等)的需要。已成为制备荧光探针的理想材料之一。目前罗丹明类荧光探针主要应用于pH检测、小分子检测和复杂生物体系的研究等领域。

式1罗丹明类重金属及过渡金属离子荧光探针的识别机理.

罗丹明类荧光探针对重金属及过渡金属离子的识别机理主要是基于罗丹明螺环结构的“关-开”机理(式1)。罗丹明螺环结构闭合时在长波长处没有吸收，也不产生荧光，结合重金属及过渡金属离子后，探针的螺环被打开形成氧杂蒽的共轭体系而在长波长处有吸收并产生强荧光。从而实现荧光由“关”到“开”。一些过渡金属离子如Cu²⁺，Fe³⁺是等顺磁性离子，与探针作用时形成的配合物通常对探针的荧光具有极强的淬灭性。而荧光增强型的荧光探针可以消除背景的干扰，比荧光淬灭型的荧光探针有优势。因而具有很好的研究和应用价值。Czarnik等在1997年合成了第一个荧光增强型的Cu²⁺荧光探针分子罗丹明B螺环内酰肼1。直到最近的八年，以罗丹明B或G螺环结构为基础的金属离子荧光探针才有了巨大的发展，分别出现了Cu²⁺，Hg²⁺，Fe³⁺，Cr³⁺，Pb²⁺，Zn²⁺，Pd²⁺，Pt²⁺，Au³⁺等重金属及过渡金属离子荧光探针。

然而大多数罗丹明类金属离子荧光探针只能检测一种发射波长。由于罗丹明荧光染料的吸收和发射光谱的峰形较窄，同时Stokes位移也较小，如果只检测一种发射波长就会因激发散射光的干扰而对荧光检测产生一定的影响。Stokes位移越小，激发光谱和发射光谱的重叠越多，检测的分辨率就越低，荧光探针的检测性能就越差。而基于双荧光发色团的两种不同发射波长的发射强度比例改变的比率荧光探针可以解决罗丹明衍生物Stokes位移小的问题。从而提高检测的分辨率和准确性。

目前基于罗丹明B或G衍生物的重金属及过渡金属离子荧光探针还存在发射波长低于600nm，荧光量子产率有待提高等问题。由于罗丹明B类荧光染料的末端氨基的扭转运动会使S₁-S₀内部转换加剧，导致荧光量子产率相对较低，作为荧光探针检测金属离子时灵敏度就相对较低。而结构刚性的罗丹明101的量子产率接近100％，且吸收波长和发射波长与罗丹明B或G类荧光染料相比均向长波长方向移动。如果在红光区进行金属离子检测，可以大大降低样品本底的干扰。由于散射光强度与波长的四次方成反比，散射光在红光区的干扰也会大大减少，检测结果就会更加准确。因此，在罗丹明结构101的基础上，发展具有更长波长(红光区)，Stokes位移大，量子产率高的重金属及过渡金属离子比率荧光探针具有重要的理论与实际意义。如果能设计合成具有两种不同发射波长罗丹明的比率荧光探针，并在红光区用荧光光谱法实现对一些重金属离子进行高灵敏度和高分辨率地识别，将具有重要的科学意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测Hg²⁺的刚性结构罗丹明比率荧光探针，实现荧光光谱法对水溶液中Hg²⁺高灵敏度和高分辨率的识别检测；目的之二在于提供该探针的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的:

所述的检测Hg²⁺的刚性结构罗丹明比率荧光探针，命名为OMRh101-DETA-NBD，其结构式如下所示:

其制备流程如下:

具体制备方法如下：

步骤一：

将刚性结构罗丹明(OMRh101)与二乙烯三胺(DETA，)在醇溶剂中搅拌回流至充分反应。冷却反应混合物，除去醇溶剂，用二氯甲烷溶解，用水洗涤，油层用无水硫酸钠干燥，除去二氯甲烷，得到中间物OMRh101-DETA。刚性结构罗丹明(OMRh101)与二乙烯三胺摩尔比优选1:2～10。

步骤二：

将中间物OMRh101-DETA与4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD-Cl)混合于二氯甲烷中，加入三乙胺作缚酸剂，氮气气氛下室温搅拌，反应完全后除去溶剂，用乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂，经硅胶柱色谱分离得到探针OMRh101-DETA-NBD。结构式如下：

在步骤一中间物OMRh101-DETA的制备过程中，所述加热回流是指将混合溶液在80～90℃油浴下回流20～24小时。

在步骤二荧光探针OMRh101-DETA-NBD的制备过程中，中间物OMRh101-DETA的摩尔数小于等于NBD-Cl的摩尔数。

在步骤二荧光探针OMRh101-DETA-NBD的制备过程中，所用缚酸剂的摩尔数等于中间产物OMRh101-DETA的摩尔数。

在步骤二荧光探针OMRh101-DETA-NBD的制备过程中，反应完全指混合液常温下反应24小时。

该荧光探针分子具有两种不同发射波长，在汞离子与其它多种金属离子共存体系中，在红光区用荧光光谱法能实现高灵敏度和高分辨率地识别，抗干扰能力强，选择性好，灵敏度高，响应快，其在602nm处的荧光强度在3分钟之内能达到最大值，对汞离子最低检测限为94nM，并且能实现荧光探针分子的可逆操作。将该荧光探针应用于水溶液中汞离子的比率荧光检测，可以定性、定量检测水溶液中汞离子浓度，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为在CH₃CN：H₂O＝3:1的溶液中，向10μM本发明探针溶液中逐渐加入汞离子的吸收光谱。

图2为在CH₃CN：H₂O＝3:1的溶液中，向10μM本发明探针溶液中逐渐加入汞离子的发射光谱，激发波长470nm。

图3为在CH₃CN：H₂O＝3:1的溶液中，汞离子低浓度条件下，10μM本发明探针在602nm处的荧光强度与汞离子浓度的线性关系图。

图4为在CH₃CN：H₂O＝3:1的溶液中，汞离子低浓度条件下，10μM本发明探针在602nm处的荧光强度与540nm处的荧光强度之比与汞离子浓度的线性关系图。

图5为在CH₃CN：H₂O＝3:1的溶液中,在本发明探针(10μM)中加入80μM汞离子在602nm处的荧光强度随时间的响应图。

图6为在CH₃CN：H₂O＝3:1的溶液中,本发明探针(10μM)对各种金属离子(70μM)的响应(黑色),本发明探针(10μM)对各种金属离子(70μM)+Hg²⁺(70μM)的荧光响应(灰色),本发明探针(10μM)对汞离子(70μM)的响应(白色),激发波长470nm。

具体实施方式

以下参照附图,给出本发明的具体实施方式,用来对本发明进行进一步说明。实施例1

所有试剂和材料均为市售品。氢谱用400MHzVarian核磁仪检测，化学位移是对比TMS得出。质谱用LC-MSD-Trap-SL系统检测，元素分析用FlashEA1112元素分析仪检测。

1、中间物OMRh101-DETA的制备

在250mL的单口圆底烧瓶中加入2.0g的刚性结构罗丹明(OMRh101),16mL的二乙烯三胺，50mL的乙醇做溶剂，将混合液搅拌回流20～24h，将反应液冷却到室温后，用旋转蒸发仪旋蒸除去溶剂，然后用50ml二氯甲烷作溶剂将旋蒸得到的固体溶解完全之后，加水50ml×3进行萃取，取二氯甲烷层，并用无水硫酸钠干燥，再用旋转蒸发仪旋蒸除去溶剂，真空干燥，得到1.12g中间物OMRh101-DETA，产率为62.2％，备用.¹HNMR(DMSO-d₆,δ,ppm),8.70(s,2H),6.764(d,J＝8.0Hz,2H),6.073(d,J＝4.0Hz,2H),4.01-4.04(m,1H)，3.19-3.35(m,6H),2.83-2.97(m,10H),1.99(s,2H),1.66(d,J＝4.0Hz,8H),1.35(s,12H),1.20(s,12H).ESI-MS:(m/z)计算值:687.96，发现值:[M-1]⁺：687.4。元素分析值:C₄₄H₅₇N₅O₂,C76.82,H8.35,N10.18.发现值:C76.91,H8.52,N10.07.

2、荧光探针OMRh101-DETA-NBD的制备

在100mL的三口圆底烧瓶中加入0.175g(0.75mmol)的第一步产物OMRh101-DETA，0.52g的NBD-Cl,20mL的无水处理的二氯甲烷做溶剂，室温下搅拌反应，加5滴三乙胺催化。薄层色谱追踪反应，24h左右反应完全，将反应液旋蒸至剩余少量溶剂，加少量的硅胶，拌匀，晾干。将产物进行柱色谱分离，洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚＝1:1，3:2，2:1，4:1梯度淋洗。得到0.30g产品，产率为56.5％。¹HNMR(CDCl₃,δ,ppm)8.46(d,J＝12Hz,1H),7.99～8.01(m,1H),7.44～7.55(m,3H),7.09～7.11(m,1H),6.19(s,2H),5.31(s,1H),3.41(s,1H),3.27(t,J＝8Hz,2H),3.05～3.15(m,8H),2.98(t,J＝8Hz,2H),2.34(t,J＝8Hz,2H),1.78(t,J＝8Hz,4H),1.26(s,10H),0.96(s,6H),0.86(s,6H),ESI-MS:(m/z)计算值:850.45，发现值:[M+1]⁺,851.4，[M-1]⁺,849.3。元素分析值:C₅₀H₅₈N₈O₅,C70.56,H6.87,N13.17,发现值:C70.69,H6.91,N13.11.

应用例1

(1)本发明探针溶液的配制

用乙腈，水配成CH₃CN：H₂O＝3:1体积比的混合溶剂，称取适量本发明荧光探针OMRh101-DETA-NBD配成10μM的探针溶液，常温避光保存。

(2)各种金属离子溶液的配制:

Mg²⁺,Co²⁺,Ni²⁺,Cu²⁺,Cr³⁺,Hg²⁺,Fe³⁺溶液由相应的盐酸盐制备，Pb²⁺,Ba²⁺,Al³⁺,Ag⁺,Cd²⁺,Hg²⁺,Mn²⁺,Zn²⁺溶液由相应的硝酸盐制备。分别称取一定量的金属盐，溶于100ml蒸馏水中，配制成1mM的溶液，避光保存备用。

(3)荧光光谱测试方法：

用移液管移取3ml本发明荧光探针OMRh101-DETA-NBD溶液放入1cm荧光池中，用微量进样器将不同体积的金属离子溶液加入其中满足不同的浓度要求。在测试之前充分混合静置2分钟。所有的检测物的激发波长设置为470nm。用CaryEclipse型荧光仪检测。

(4)紫外光谱测试方法

用移液管移取3ml本发明荧光探针OMRh101-DETA-NBD溶液放入1cm比色皿中，用微量进样器将不同体积的汞离子溶液加入其中满足不同的浓度要求。在测试之前充分混合静置2分钟。用TU1901型紫外-可见分光光度计检测。

(5)结果分析

a、汞离子对本发明探针的紫外光谱的影响

如图1，在CH₃CN：H₂O＝3:1的混合溶剂中，本发明探针OMRH101-DETA-NBD在471nm处有明显的吸收峰(归因于NBD发色团的吸收峰)，加入Hg²⁺后本发明探针OMRH101-DETA-NBD吸收峰先红移到了489nm，继续加入Hg²⁺，本发明探针在579nm出现吸收峰(归因于刚性结构罗丹明的吸收峰)并逐渐增强。表明本发明探针在Hg²⁺作用下实现了探针由闭环结构向开环结构的转变。溶液颜色发生明显的变化，由近无色变成红色，可以实现裸眼识别。向本发明探针汞溶液加入KI，602nm处的荧光强度迅速降低，同时540nm处的荧光增强，溶液颜色由红色变为无色，由于Hg²⁺与I^-更容易结合生成HgI₂,[HgI₄]^2-,说明这种识别反应具有可逆性，可以实现荧光探针分子的可逆操作。

b、汞离子对本发明探针的荧光光谱的影响

如图2，在CH₃CN：H₂O＝3:1的混合溶剂中，本发明探针OMRH101-DETA-NBD在540nm处有较弱的荧光峰(归因于NBD发色团的荧光峰)，而在602nm处几乎无荧光，随着Hg²⁺的加入，本发明探针在602nm出现荧光峰(归因于刚性结构罗丹明的荧光峰)并逐渐增强，而在540nm处荧光峰呈降低趋势。这都归因于Hg²⁺加入后引起罗丹明结构由闭环发生开环，能量由NBD转移到罗丹明结构，发生了荧光共振能量传递。加入10倍于荧光探针浓度的Hg²⁺，其荧光强度增加40倍。在602nm处的荧光强度与2×10^-6～2.5×10^-5mol/l的Hg²⁺浓度成线性关系(如图3)，回归方程I＝7.96+4.78×10⁵[Hg²⁺]，相关系数R＝0.996，检出限94nM。602nm处的荧光强度与540nm处的荧光强度之比与2×10^-6～3×10^-5mol/l的Hg²⁺浓度成线性关系(如图4)，回归方程I₆₀₂/I₅₄₀＝0.40587+2.48×10⁴[Hg²⁺],相关系数R＝0.997,因此可以实现对汞离子的比率荧光检测。在CH₃CN：H₂O＝3:1的混合溶剂中,本发明探针OMRH101-DETA-NBD对Hg²⁺的响应速度非常快，向本发明探针的溶液中加入Hg²⁺后，602nm处的荧光强度在3分钟之内达到了最大值(如图5)。为了检验此荧光探针的选择性,我们检测了Mg²⁺,Co²⁺,Ni²⁺,Cu²⁺,Cr³⁺,Hg²⁺,Fe³⁺，Pb²⁺,Ba²⁺,Al³⁺,Ag⁺,Cd²⁺,Mn²⁺,Zn²⁺对的Hg²⁺影响。在相同的条件下,得到含Hg²⁺和其它阳离子(7摩尔当量)的本发明探针在602nm处的荧光强度与540nm处的荧光强度之比(如图6)，此对比试验说明本发明探针对于Hg²⁺的灵敏度几乎不受同时存在的其他金属离子的影响。在365nm光照射下,本发明探针(10μM)溶液(CH₃CN：H₂O＝3:1)的发光显微弱绿色，而向探针(10μM)中加入Hg²⁺(100μM)的发光显很亮的红色。可见提高了检测的分辨率。

将该荧光探针应用于水溶液中汞离子的比率荧光检测，能很好地实现水溶液中Hg²⁺高灵敏度和高分辨率的识别检测，优于现有技术。

Claims (2)

1.一种含刚性结构罗丹明的Hg²⁺比率荧光探针分子，其特征在于，所述比率荧光探针结构式如下所示：

。

2.制备如权利要求1所述的含刚性结构罗丹明的Hg²⁺比率荧光探针分子的方法，其特征在于，通过如下步骤实现:

（1）将刚性结构罗丹明OMRh101与二乙烯三胺在醇溶剂中搅拌回流至充分反应；冷却反应混合物，除去醇溶剂，用二氯甲烷溶解，用水洗涤，油层用无水硫酸钠干燥，除去二氯甲烷，得到中间物OMRh101-DETA；

（2）将中间物OMRh101-DETA与4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD-Cl)混合于二氯甲烷中，加入三乙胺催化剂，氮气气氛下室温搅拌，反应完后除去溶剂，用乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂，经硅胶柱色谱分离得到产物OMRh101-DETA-NBD；

在步骤（1）中间物OMRh101-DETA的制备过程中，所述回流是指将混合溶液在80-90^oC油浴下回流20-24小时；

在步骤(2)荧光探针OMRh101-DETA-NBD的制备过程中，反应完全指混合液常温下反应24小时。