CN103242328A - 对N-乙酰氨基苯基罗丹明6GpH荧光分子探针及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化合物(I)对N-乙酰氨基苯基罗丹明6GpH荧光分子探针及其制备方法与用途。化合物Ⅰ在氢离子作用下，探针分子I中的罗丹明6G内酰胺螺环由闭合状态发生开环，溶液颜色发生由无色到橙红色变化，并伴有荧光发射，并且，在一定波长的激发光的作用下有荧光产生。化合物Ⅰ具有对氢离子高选择性裸眼显色识别以及荧光识别探针的用途。

Description

对N-乙酰氨基苯基罗丹明6GpH荧光分子探针及其制备方法与用途

本发明是在天津师范大学开发基金（基金号为52XK1102）的资助下进行的。 

技术领域

本发明属于化学传感技术应用领域，涉及化合物1-(4-乙酰胺基苯)亚胺乙基-N’-(罗丹明6G-酰肼)的制备方法，及化合物I对氢离子高选择性的裸眼显色识别和荧光识别探针的用途。 

背景技术

在工业生产中，体系的pH值对物质的反应性能有很大的影响，另外，在生物体系中，细胞和细胞器的许多重要生理过程也与pH密切相关，因此pH值的测定具有十分重要的意义。目前测定pH的方法很多，如比色法、电极法及光学传感器等。比色法的灵敏度较低，不能满足对生命体系内微小pH变化的检测，因此无法应用到生命体系进行活体细胞造影，电极法在pH的测量中也遇到了很多问题，如传统玻璃电极的阻抗高, 易破损以及不宜用于含氟溶液中pH值的测定, 且在高碱性环境中有"钠误差"等，同以上两种方法相比，pH荧光探针分析方法具有选择性好、灵敏度高、试样量小、简便快捷等特点，在分析化学，特别是在分子生物学、生物分析化学、细胞生物学、医学等领域中有较广泛的应用。 

本专利所发明的化合物I是一种基于罗丹明6G的pH荧光分子探针，具有亚胺C＝N双键结构，此化合物依据罗丹明6G内酰胺螺环化合物的“闭合-无色”、“开环-有色及产生荧光”的特点，可以对氢离子进行荧光识别。实验表明，化合物I具有对氢离子高选择性的裸眼显色识别和荧光识别探针的用途，并且不受金属离子干扰。 

本发明人设计的如上所述具有I结构特征的化合物是未见报道的新化合物。 

发明内容

本发明的第一个目的是提供了具有结构式I的化合物及其制备方法。 

本发明的第二个目的是提供了包含化合物I用于对氢离子高选择性裸眼显色识别以及荧光识别探针的用途。 

为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容： 

具有结构式I的化合物1-(4-乙酰胺基苯)亚胺乙基-N’-(罗丹明6G-酰肼)：

本发明进一步公开了化合物1-(4-乙酰胺基苯)亚胺乙基-N’-(罗丹明6G-酰肼)的制备方法，化合物I的制备按如下步骤进行：

(1) 原料罗丹明6G酰肼的制备

在乙醇溶液中，罗丹明6G和80% 的水合肼在室温下混合搅拌，然后将混合物加热回流，当溶液由猩红色变为澄清的橙色时，反应完毕，冷却至室温，旋蒸，除去溶剂，所得固体用蒸馏水洗涤3次即得产物。其中罗丹明6G : 80% 水合肼的摩尔比为1.0 : 12.5；

(2) 原料对乙酰胺基苯乙酮的合成

室温下，在100 mL烧瓶中将对氨基苯乙酮和乙酸酐混合，并加入冰醋酸作催化剂，将混合体系加热回流至完全反应，待混合体系冷却至室温后，将混合物倒入盛有冰盐的烧杯中，充分搅拌，抽滤即得产物。

(3) 目标化合物的合成 

将上述制备的罗丹明6G酰肼和对乙酰胺基苯乙酮在甲醇溶液中混合，再加入几滴冰乙酸作催化剂，将混合体系加热回流至完全反应，待反应完成后降至室

温，将烧瓶中的混合体系倒入盛有冰水混合物的烧杯中，用三乙胺调节溶液至pH = 8，抽滤，并用蒸馏水洗涤沉淀2-3次，所得粗产品经柱色谱分离，得到结构式为I的化合物1-(4-乙酰胺基苯)亚胺乙基-N’-(罗丹明6G-酰肼)。其中罗丹明6G酰肼和对乙酰胺基苯乙酮的摩尔比为1.3 : 1.0。

本发明进一步公开了化合物I作为对氢离子高选择性裸眼显色识别以及荧光识别探针方面的应用。 

本发明所设计的化合物

的分子结构特征在于在I的结构中，罗丹明6G的氧杂蒽内酰胺螺环处于闭合状态，溶液无色，当化合物

与氢离子作用时，螺环打开，同时溶液由无色变为橙红色并伴有荧光发射。因此，化合物

可以对氢离子进行荧光识别。实验表明，化合物I具有对氢离子高选择性的裸眼显色识别和荧光识别探针的用途。 

本发明所公开的化合物I与现有技术相比所具有的积极效果为： 

(1)   制备过程安全，合成简单；

(2)   具有高灵敏度，高选择性及快速反应性等优点；

(3)   该荧光分子探针在检测氢离子时不受Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Cd²⁺、Ba²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Bi³⁺ 等离子的干扰。

附图说明： 

图1为化合物I的结构式；

图2为10 μM化合物I的四氢呋喃 : 水 = 4 : 6 (v : v) 的溶液pH = 1.1-12.9的紫外吸收光谱，其中，横坐标表示波长，纵坐标Abs是吸收强度；

图3为10 μM化合物I的四氢呋喃 : 水 = 4 : 6 (v : v) 的溶液pH = 1.1-12.9的荧光发射光谱，其中，横坐标表示波长，纵坐标 F.I. 是荧光发射强度；

图4为10 μM化合物I的四氢呋喃 : 水 = 4 : 6 (v : v) 的溶液pH = 1.1-12.9 及不同金属离子的紫外吸收，其中，横坐标表示波长，纵坐标Abs是吸收强度；

图5为10 μM化合物I的四氢呋喃 : 水 = 4 : 6 (v : v) 的溶液pH = 1.1-12.9 及

不同金属离子的荧光发射光谱，其中，横坐标表示波长，纵坐标 F.I. 是荧光发射强度；

图6为化合物的质谱图；

图7为10 μM化合物I的四氢呋喃 : 水 = 4 : 6 (v : v) 溶液在10 μM谷氨酸存在和空白(图中右侧)自然光下的成像对比；

图8为10 μM化合物I的四氢呋喃 : 水 = 4 : 6 (v : v) 溶液在10 μM谷氨酸存在和空白(图中右侧)紫外灯下的成像对比。

具体实施方式： 

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。为了简单和清楚，以下论述中对公知的技术方法的描述、溶液的配制过程不再赘述。其中的原料罗丹明6G有市售。

实施例1. 

化合物的合成：

(1) 原料罗丹明6G酰肼的合成

将1.5 g罗丹明6G用30 mL乙醇溶解，加入100 mL的烧瓶中，在室温下向混合体系加入2.4 mL 80% 的水合肼，搅拌30分钟，然后将混合物加热回流，当溶液由猩红色变为澄清的橙色时，反应完毕，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，得产物1.3 g,产率87.5% 。

(2) 原料对乙酰胺基苯乙酮的合成 

向100 mL烧瓶中加入1.0 g对氨基苯乙酮，室温下滴加0.7 mL乙酸酐和0.3 mL冰醋酸，混合体系加热回流至完全反应，待混合体系冷却至室温后，将混合物倒入盛有冰盐的烧杯中，充分搅拌，抽滤得粉红色固体1.0 g,产率74.0% 。

(3) 目标化合物的合成 

向100 mL烧瓶中加入1.0 g罗丹明6G酰肼和0.3 g对乙酰胺基苯乙酮，加6 mL甲醇将固体溶解，再滴加4-6滴冰乙酸，将混合体系加热回流至完全反应，待反应完成后降至室温，将烧瓶中的混合体系倒入盛有冰水混合物的烧杯中，用三乙胺调节溶液至pH = 8，抽滤，并用蒸馏水洗涤沉淀2-3次，所得粗产品经柱色谱分离(甲烷 : 甲醇 = 20 : 1 v : v)，得到目标化合物0.8 g，产率83.7% 。mp : 179-181℃。

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 10.343 (s, 1H), 7.838 (t, 1H), 7.571 (t, 4H), 7.501 (d, 2H, J =8 .8 Hz), 7.080 (t, 1H), 6.241 (d, 4H, J = 4.8 Hz), 5.024 (t, 2H), 3.110 (t, 4H), 2.096 (s, 3H), 2.044 (s, 3H), 1.874(s, 6H), 1.197(t,6H)。 

¹³C NMR (CDCl₃, 101 MHz) δ(ppm): 169.108，168.261，160.036，151.887，151.830，147.917，141.958，133.098, 131.693, 130.779, 128.965, 127.948，124.205, 123.090, 118.681, 118.253, 106.094, 96.113, 66.748, 37.951, 24.521, 18.183, 17.523, 14.648。 

MS (ESI-MS)，m/z，588.4 [M+H]⁺ 。 

以上反应过程的合成路线如下： 

                    

实施例2.

化合物

的合成：

(1) 原料罗丹明6G酰肼的合成

将6.0 g罗丹明6G用120 mL乙醇溶解，加入250 mL的烧瓶中，在室温下向混合体系加入9.6 mL 80 %的水合肼，搅拌30分钟，然后将混合物加热回流，当溶液由猩红色变为澄清的橙色时，反应完毕，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，得产物4.6 g,产率79.2% 。

(2) 原料对乙酰胺基苯乙酮的合成 

向100 mL烧瓶中加入1.5 g对氨基苯乙酮，室温下滴加1.0 mL乙酸酐和0.4

mL冰醋酸，混合体系加热回流至完全反应，待混合体系冷却至室温后，将混合物倒入盛有冰盐的烧杯中，充分搅拌，抽滤得粉红色固体1.4g，产率71.3% 。

(3) 目标化合物的合成 

向100 mL烧瓶中加入3.0 g罗丹明6G酰肼和1.0 g对乙酰胺基苯乙酮，加18 mL甲醇将固体溶解，再加入0.3 mL冰乙酸，将混合体系加热回流至完全反应，待反应完成后降至室温，将瓶中的混合体系倒入盛有冰水混合物的烧杯中，用三乙胺调节溶液至pH = 8，抽滤，并用蒸馏水洗涤沉淀2-3次，所得粗产品经柱色谱分离(二氯甲烷:甲醇=20 : 1 v : v)，得到目标化合物2.5 g,，产率74.5% mp : 179-181℃。

实施例3 

化合物的合成：

(1) 原料罗丹明6G酰肼的合成

将10.0 g罗丹明6G用188 mL乙醇溶解，加入250 mL的烧瓶中，在室温下向混合体系加入16.0 mL 80 % 的水合肼，搅拌30分钟，然后将混合物加热回流，当溶液由猩红色变为澄清的橙色时，反应完毕，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，得产物7.0 g,产率72.0 %。

(2) 原料对乙酰胺基苯乙酮的合成 

向100 mL烧瓶中加入3.0 g对氨基苯乙酮，室温下滴加2.1 mL乙酸酐和0.75 mL冰醋酸，混合体系加热回流至完全反应，待混合体系冷却至室温后，将混合物倒入盛有冰盐的烧杯中，充分搅拌，抽滤得粉红色固体2.7 g，产率69.1 %。

(3) 目标化合物的合成 

向100 mL烧瓶中加入6.0 g罗丹明6G酰肼和1.9 g对乙酰胺基苯乙酮，加36 mL甲醇将固体溶解，再加入0.6 mL冰乙酸，将混合体系加热回流至完全反应，待反应完成后降至室温，将烧瓶中的混合体系倒入盛有冰水混合物的烧杯中，用三乙胺调节溶液至pH = 8，抽滤，并用蒸馏水洗涤沉淀2-3次，所得粗产品经柱色谱分离(二氯乙烷 : 甲醇=20 : 1 v : v)，得到目标化合物4.0 g，产率63.0 % mp : 179-181℃。

实施例4. 

化合物I的对氢离子识别性能：

用化合物

配制10 mL浓度为1.0 × 10^-3 mol·L^-1的四氢呋喃：tris-HCl = 4 : 6 (v : v)，pH = 7.5的溶液作为储备液。配制四氢呋喃 : 水 = 4 : 6 (v : v)，pH分别为1.1，2.0，3.1，4.0，5.1，6.1，6.9，8.1，9.0，10.0，11.0，12.1，12.9的溶液。通过紫外光谱、荧光光谱确定该化合物可以识别强酸溶液中的氢离子。

具体操作是： 

化合物

的紫外吸收和荧光发射与溶液pH的关系见图2和图3。取上述配制的0.1 mL化合物

的溶液,分别用上述配制的13种不同pH值的溶液稀释至10 mL、1.0 × 10^-5 mol·L^-1,分别测定化合物

的13种不同pH值溶液的紫外光谱、荧光光谱。

紫外光谱、荧光光谱与不同pH值的关系见图2和图3。测试表明，化合物

的中性和碱性溶液紫外吸收光谱、荧光发射光谱的强度很弱；随pH降低、体系中氢离子浓度增大，紫外吸收光谱、荧光发射光谱的强度显著增强，pH = 1.1-3.1的溶液的紫外吸收在530 nm出现最大吸收，荧光发射光谱在560 nm出现峰值，同时，化合物

的pH = 1.1-3.1的溶液由无色变为橙红色，而其他pH的溶液没有颜色变化。因此，化合物

对氢离子具有很好的选择性。 

实施例5. 

化合物I对氢离子识别时，Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Cd²⁺、Ba²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Bi³⁺ 14 种金属离子的干扰排除：

按照实施例4 方法配制化合物I、上述14 种被测试金属离子的溶液。首先配置浓度为1.0 × 10^-3 mol·L^-1的储备液，测试时将化合物I、金属离子溶液稀释至10 mL、1.0 × 10^-5 mol·L^-1的溶液,分别测定化合物

与Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Cd²⁺、Ba²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Bi³⁺ 金属离子溶液的紫外吸收光谱、荧光发射光谱。化合物 与氢离子、被测试金属离子的紫外光谱、荧光光谱关系见图4和图5。测试表明，化合物与14 种金属离子的溶液的紫外吸收光谱、荧光发射光谱强度很弱，随pH降低，紫外吸收光谱、荧光发射光谱的强度显著增强，pH = 1.1-3.1的溶液分别出现以530 nm峰值的紫外吸收和560 nm峰值的荧光发射光谱，同时，化合物的pH = 1.1-3.1的溶液由无色变为橙红色，而其他pH的溶液没有颜色变化，而且，金属离子的存在不干扰对氢离子的识别。因此，在被测试金属离子存在下，化合物

对氢离子的识别具有很好的选择性。

实施例6. 化合物I的实际应用 

近年来，随着科学技术的进步与发展，以多学科交叉的综合方法解决实际问题变得越来越重要。例如，生物科学需要对体系的pH值进行精确测量，传统的测量方法如用玻璃电极测定pH值、利用酚酞等颜色变化的指示剂测定pH值等都存在着种种不足，例如灵敏度差、稳定性差、干扰因素多等，因此限制了它们在实际中的应用。

利用有机化合物的紫外吸收光谱和荧光发射光谱性质，以荧光分子光谱方法检测体系的pH值，与传统方法相比，具有高灵敏度、高选择性、反应时间快而受到普遍的重视。目前，已有pH荧光分子探针的报道，但对于大多数pH荧光分子探针来说，一个很大的问题就是检测的范围通常都是很宽的(最多可有7-8个pH单位)[田茂忠，王君玲等，基于氟硼荧染料的强酸性pH荧光探针，中国， 101424641A. 2009, 5]，[董育斌，刘启奎等，一种宽泛响应范围的pH荧光探针及其合成方法，中国，101607945A.2009, 12]，这就会导致探针的灵敏度很低，而且很多探针也比较容易受到金属离子干扰[Tian, M. Z., Peng, X. J., Fan, J. L., et al. A Fluorescent sensor for pH based on rhodamine fluorophore, Dyes and Pigments, 2012; 95: 112-115]。另外，这些探针主要是针对生物体系而设计的，因此都只能用于生理pH检测(pH = 6 - 8)。而实际上也有很多的环境是强酸性的，比如人体胃液、溶酶体和核酶体等。因此设计合成不受金属离子干扰的、窄响应范围的、激发波长在可见光区、强酸性环境中的pH荧光分子探针就成为了人们的研究需求。 

本专利所合成的化合物

能用来检测谷氨酸，当化合物

与谷氨酸作用时，溶液由无色变为可以裸眼观测到的橙红色。 

Claims (3)

1.具有结构式                                                

的化合物1-(4-乙酰胺基苯)亚胺乙基-N’-(罗丹明6G-酰肼)

    

       

。

2.权利要求1所述化合物1-(4-乙酰胺基苯)亚胺乙基-N’-(罗丹明6G-酰肼)的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

(1) 罗丹明6G酰肼的制备

在乙醇溶液中，罗丹明6G和80% 水合肼在室温下混合搅拌，然后将混合物加热回流，当溶液由猩红色变为澄清的橙色时，反应完毕，冷却至室温，减压旋蒸除去溶剂，所得固体用蒸馏水洗涤3次即得产物，其中罗丹明6G : 80% 水合肼的摩尔比为1.0 : 12.5；

(2) 乙酰胺基苯乙酮的合成

室温下，在100 mL烧瓶中将对氨基苯乙酮和乙酸酐混合，并加入冰醋酸作催化剂，将混合体系加热回流至完全反应，待混合体系冷却至室温后，将混合物倒入冰盐水中，充分搅拌，抽滤即得产物；

(3) 目标化合物的合成

将上述制备的罗丹明6G酰肼和对乙酰胺基苯乙酮在甲醇溶液中混合，再加入几滴冰乙酸作催化剂，将混合体系加热回流至完全反应，待反应完成后降至室温，将烧瓶中的混合体系倒入冰水中，用三乙胺调节溶液至pH = 8，抽滤，并用蒸馏水洗涤沉淀2-3

次，所得粗产品经柱色谱分离，得到结构式为I的化合物1-(4-乙酰胺基苯)亚胺乙基-N’-(罗丹明6G-酰肼)；其中罗丹明6G酰肼和对乙酰胺基苯乙酮的摩尔比为1.3 : 1。

3.权利要求1所述化合物1-(4-乙酰胺基苯)亚胺乙基-N’-(罗丹明6G-酰肼)在制备作为对氢离子高选择性裸眼显色识别以及荧光识别探针方面的应用。

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