CN103232466A - 4-羟基取代苯基亚胺型罗丹明6g荧光分子探针的制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化合物(I)4-羟基取代苯基亚胺型罗丹明6G荧光分子探针的制备方法与用途。该化合物I具有罗丹明类荧光染料的优点，同时化合物I在强酸性环境中会发射强的荧光，并且溶液颜色发生由无色到橙红色变化。所以，化合物I具有对氢离子高选择性的裸眼显色识别和荧光识别探针的用途。

Description

4-羟基取代苯基亚胺型罗丹明6G荧光分子探针的制备方法与用途

本发明是在天津师范大学开发基金（基金号为52XK1102）的资助下进行的。

技术领域

本发明属于化学传感技术应用领域，涉及化合物I1-(4-羟基苯)亚胺乙基-N ’-(罗丹明6G-酰肼)的制备方法，及化合物I对氢离子高选择性的裸眼显色识别和荧光识别探针的用途。

背景技术

在生理学、药物学、环境学等体系中，对pH值的测定有非常重要的价值。电化学法是早期人们测量pH值的常用方法, 但在测量中遇到了很多问题，比如传统玻璃电极的阻抗高、易破损以及不宜用于含氟溶液中pH的测定等。其次, 玻璃电极由于体积较大, 不适用于样品的原位处理分析及微环境和生物活体的在线检测。与之对比，荧光光谱法具有自身独特的优点：灵敏度高、选择性强、反应快速及操作性强等，因此，设计合成能应用于各种体系，具有各种性能的pH荧光分子探针成为了人们的研究需求。

本专利的化合物I具有亚胺C＝N双键结构，根据罗丹明6G内酰胺螺环化合物的“闭合-无色”、“开环-有色及产生荧光”的特点，可以对氢离子进行荧光识别。实验表明，化合物I具有对氢离子高选择性的裸眼显色识别和荧光识别探针的用途，并且不受金属离子干扰。

本发明人设计的如上所述具有I结构特征的化合物是未见报道的新化合物。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了具有结构式I的化合物及其制备方法。

本发明的第二个目的是提供了包含化合物I用于对氢离子高选择性裸眼显色识别以及荧光识别探针的用途。

为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容：

具有结构式I的化合物1-(4-羟基苯)亚胺乙基-N ’-(罗丹明6G-酰肼)：

本发明进一步公开了化合物1-(4-羟基苯)亚胺乙基-N ’-(罗丹明6G-酰肼)的制备方法，它是按如下的步骤进行：

(1) 原料罗丹明6G酰肼的制备：

在乙醇溶液中，罗丹明6G和80% 的水合肼在室温下混合搅拌，然后将混合物加热回流，当溶液由猩红色变为澄清的橙色时，反应完毕，冷却至室温，减压旋蒸除去溶剂，所得固体用蒸馏水洗涤3次即得产物。其中罗丹明6G和80% 水合肼的摩尔比为1.0 : 12.5 。

(2) 目标化合物的合成

将上述制备的罗丹明6G酰肼和对羟基苯乙酮在甲醇溶液中混合，再加入几滴冰乙酸作催化剂，将混合体系加热回流至完全反应，待反应完成后降至室温，将烧瓶中的混合体系倒入盛有冰水混合物的烧杯中，用三乙胺调节溶液至pH = 8，抽滤，并用甲醇洗涤沉淀2-3次，二氯甲烷萃取滤液，将无水硫酸镁放入萃取液中，干燥并静置过夜，减压旋蒸除去多余溶剂，所得粗产品经柱色谱分离，得到结构式为I的化合物1-(4-羟基苯)亚胺乙基-N ’-(罗丹明6G-酰肼)。其中罗丹明6G酰肼和对羟基苯乙酮的摩尔比为1.2：1.0 。

本发明进一步公开了化合物I在制备作为对氢离子高选择性裸眼显色识别以及荧光识别探针方面的应用。

本发明所设计的化合物

的分子结构特征在于在I的结构中，罗丹明6G的氧杂蒽内酰胺螺环化合物的“闭合-无色”、“开环-有色及产生荧光”的特点，对氢离子进行荧光识别。实验表明，化合物I具有对氢离子高选择性的裸眼显色识别和荧光识别探针的用途。

本发明公开化合物I与现有技术相比所具有的积极效果为：

(1) 制备过程安全，合成简单；

(2) 化合物

具有罗丹明6G内酰胺螺环结构，螺环的“闭合-无色”、“开环-有色及产生荧光”的特点，能够对氢离子进行荧光识别；

(3) 该荧光探针检测灵敏,在浓度为10 μM时即能够实现对氢离子的荧光识别，而Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Cd²⁺、Ba²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Bi³⁺ 等14种离子在相同条件下未发生识别响应，说明该荧光探针对氢离子具有高选择性识别。

附图说明：

图1为化合物I的结构式；

图2为10 μM化合物I的四氢呋喃 : 水 = 4 : 6 (v : v) 的溶液pH = 1.1-12.9的紫外吸收光谱，其中，横坐标表示波长，纵坐标Abs是吸收强度；

图3为10 μM化合物I的四氢呋喃 : 水 = 4 : 6 (v : v) 的溶液pH = 1.1-12.9的荧光发射光谱，其中，横坐标表示波长，纵坐标 F.I. 是荧光发射强度；

图4为10μM化合物I的四氢呋喃 : 水 = 4 : 6 (v : v) 的溶液pH = 1.1-12.9 及不同金属离子的紫外吸收，其中，横坐标表示波长，纵坐标Abs是吸收强度；

图5为10 μM化合物I的四氢呋喃 : 水 = 4 : 6 (v : v) 的溶液pH = 1.1-12.9 及不同金属离子的荧光发射光谱，其中，横坐标表示波长，纵坐标 F.I. 是荧光发射强度；

图6为化合物

的质谱图；

图7为10 μM化合物I的四氢呋喃 : 水 = 4 : 6 (v : v) 溶液在10 μM苯甲酸存在和空白(图中右侧)自然光下的成像对比；

图8为10 μM化合物I的四氢呋喃 : 水 = 4 : 6 (v : v) 溶液在10 μM苯甲酸存在和空白(图中右侧)紫外灯下的成像对比。

具体实施方式：

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。为了简单和清楚，以下论述中对公知的技术方法的描述、溶液的配制过程不再赘述。其中的原料罗丹明6G有市售。

实施例1.

化合物

的合成：

(1) 原料罗丹明6G酰肼的合成

将1.0 g罗丹明6G用20 mL乙醇溶解，加入100 mL的烧瓶中，在室温下向混合体系加入1.6 mL80% 的水合肼，搅拌30分钟，然后将混合物加热回流，当溶液由猩红色变为澄清的橙色时，反应完毕，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，得产物0.9 g,产率89.5% 。

(2) 目标化合物的合成

向100 mL烧瓶中加入0.5 g罗丹明6G酰肼和0.1 g对羟基苯乙酮，加3 mL甲醇将固体溶解，再滴加2-3滴冰乙酸，将混合体系加热回流至完全反应，待反应完成后降至室温，将烧瓶中的混合体系倒入盛有冰水混合物的烧杯中，用三乙胺调节溶液至pH = 8，抽滤，并用甲醇洗涤沉淀2-3次，二氯甲烷萃取滤液，无水硫酸镁放入萃取液中，干燥并静置过夜，减压旋蒸除去多余溶剂，所得粗产品经柱色谱分离(乙酸乙酯 : 石油醚 = 3 : 5 v : v)，得到目标化合物0.3 g,产率81.7% ，mp : 234-235℃。

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.823 (s, 1H), 7.542 (s, 2H), 7.434 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.043 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 6.708 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.223 (s, 4H), 5.018 (s, 2H), 3.472 (s, 1H), 3.101 (t, 4H), 2.058 (s, 3H), 1.866 (s, 6H), 1.192 (t, 6H)。

¹³C-NMR (CDCl₃,101MHz) δ: 169.103, 168.261, 160.036, 151.887, 15 1.830,147. 917, 141.958, 133.098, 131.693, 130.779, 128.965, 127.943, 124.205, 123.090, 118.681, 118.253, 106.094, 96.113, 66.743, 37.951, 24.521, 18.183, 17.523, 14.643

以上反应过程的合成路线如下：

实施例2.

化合物

的合成：

(1) 原料罗丹明6G酰肼的合成

将5.0 g罗丹明6G用100 mL乙醇溶解，加入250 mL的烧瓶中，在室温下向混合体系加入8 mL80% 的水合肼，搅拌30分钟，然后将混合物加热回流，当溶液由猩红色变为澄清的橙色时，反应完毕，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，得产物3.9 g,产率82.1% 。

(2) 目标化合物的合成

向100 mL烧瓶中加入2.0 g罗丹明6G酰肼和0.5 g对羟基苯乙酮，加12 mL甲醇将固体溶解，再加入0.2 mL冰乙酸，将混合体系加热回流至完全反应，待反应完成后降至室温，将瓶中的混合体系倒入盛有冰水混合物的烧杯中，用三乙胺调节溶液至pH = 8，抽滤，并用甲醇洗涤沉淀2-3次，二氯甲烷萃取滤液，无水硫酸镁放入萃取液中，干燥并静置过夜，减压旋蒸除去多余溶剂，所得粗产品经柱色谱分离(乙酸乙酯 : 石油醚 = 3 : 5 v : v），得到目标化合物1.6 g，产率81.5%，mp: 233-235℃。

实施例3.

化合物

的合成：

(1) 原料罗丹明6G酰肼的合成

将8.0 g罗丹明6G用150 mL乙醇溶解，加入250 mL的烧瓶中，在室温下向混合体系加入12.8 mL 80% 的水合肼，搅拌30分钟，然后将混合物加热回流，当溶液由猩红色变为澄清的橙色时，反应完毕，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，得产物6.0 g,产率77.3%。

(2) 目标化合物的合成

向100 mL烧瓶中加入5.0 g罗丹明6G酰肼和1.3 g对羟基苯乙酮，加30 mL甲醇将固体溶解，再加入0.5 mL冰乙酸，将混合体系加热回流至完全反应，待反应完成后降至室温，将烧瓶中的混合体系倒入盛有冰水混合物的烧杯中，用三乙胺调节溶液至pH = 8，抽滤，并用甲醇洗涤沉淀2-3次，二氯甲烷萃取滤液，无水硫酸镁放入萃取液中，干燥并静置过夜，减压旋蒸除去多余溶剂，所得粗产品经柱色谱分离(乙酸乙酯 : 石油醚 = 3 : 5 v : v)，得到目标化合物3.6 g,产率69.2%，mp : 233~235℃。

实施例4.

化合物I的识别性能：

首先是使用化合物I对氢离子进行识别。

(一) 用化合物配制10 mL浓度为1.0 × 10 ^-3 mol·L^-1的四氢呋喃 : tris-HCl = 4 : 6(v : v)，pH = 7.5的溶液作为储备液。

(二) 配制四氢呋喃 : 水 = 4 : 6(v : v) pH分别为1.1, 2.0, 3.1, 4.0, 5.1, 6.1,

6.9, 8.1, 9.0, 10.0, 11.0, 12.1, 12.9的溶液。

通过紫外光谱和荧光光谱确定该化合物可以识别强酸溶液中的氢离子。

具体操作是：

取上述配制的0.1 mL化合物的溶液,分别用上述配制的13种不同pH值的溶液稀释至10 mL,测定化合物

的13种不同pH值溶液的紫外光谱、荧光光谱。

化合物的紫外吸收和荧光发射与溶液pH的关系见图2和图3。荧光测试表明，化合物

的紫外吸收和荧光发射对溶液的pH值有很强的依赖性，在四氢呋喃 : 水 = 4 : 6(v : v)的溶液中，pH = 4.0-12.9范围内几乎无紫外吸收和荧光发射，pH=3.1时有微弱的紫外吸收和荧光发射， pH=1.1和2.0时，出现较强的以535 nm峰值的紫外吸收和559nm峰值的荧光发射光谱。同时由于与氢离子相互作用，化合物

的内酰胺螺环结构发生开环，溶液由无色变为橙红色，因此，化合物

可以作为识别强酸溶液中氢离子、检测溶液pH值的pH荧光分子探针。

实施例5.

化合物I对氢离子识别时，Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Cd²⁺、Ba²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Bi³⁺ 14 种金属离子的干扰排除：

按照实施例4方法配制化合物I及上述14 种被测试金属离子的溶液。首先配置浓度为1.0 × 10^-3 mol·L^-1的储备液，测试时将化合物I、金属离子溶液稀释至10 mL、1.0 × 10^-5 mol·L^-1的溶液,并分别测定化合物

与Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Cd²⁺、Ba²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Bi³⁺ 金属离子溶液的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。化合物

与氢离子、被测试金属离子的紫外光谱、荧光光谱关系见图4和图5。测试表明，化合物

与14 种金属离子的溶液高pH值的溶液的紫外吸收光谱、荧光发射光谱强度很弱，随pH降低，紫外吸收光谱、荧光发射光谱的强度显著增强，pH = 1.1-3.1的溶液分别出现以535 nm峰值的紫外吸收和559 nm峰值的荧光发射光谱，同时化合物

的pH = 1.1-3.1的溶液由无色变为橙红色，而其他pH的溶液没有颜色变化，而且，金属离子的存在不干扰对氢离子的识别。因化合物

对氢离子的识别具有很好的选择性。

实施例6.

苯甲酸由于可延长保质期,防腐效果好,并且价格低廉,通常作为防腐剂被广泛地用于调味品中。但苯甲酸本身具有一定毒性,如果滥用或过量使用,会危害人们的身体健康[吴玉娟，固相萃取-液相色谱法测定糕点中脱氢乙酸、苯甲酸、山梨酸的方法研究.[J].福建分析测试，2007；04]。在我国,由于调味品生产企业众多,规模偏小,添加控制水平不高,经常发生苯甲酸超标的情况。因此，对调味品中苯甲酸的测定非常重要。常用的苯甲酸测定方法有中和法、紫外分光光度、气相色谱法等。但以上方法各有其缺点，如测定误差较大，操作复杂等。

本专利所合成的化合物

能用来检测食品中的防腐剂苯甲酸的含量，与苯甲酸作用时，化合物

中的螺环发生开环，[Wang, J., Qian, X .,Cui, J. Detecting Hg²⁺ Ions with an ICT Fluorescent Sensor Molecule: Remarkable Emission Spectra Shift and Unique electivity, J.Org. Chem., 2006, 71, 4308-4311.] 同时发生裸眼可以观测到的溶液由无色到橙红色的变化，此方法操作简单，灵敏性高。

Claims (3)

1.具有结构式 的化合物1-(4-羟基苯)亚胺乙基-N ’-(罗丹明6G-酰肼)

。

2.权利要求1所述化合物1-(4-羟基苯)亚胺乙基-N ’-(罗丹明6G-酰肼)的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

(1) 原料罗丹明6G酰肼的制备：

在乙醇溶液中，罗丹明6G和80% 的水合肼在室温下混合搅拌，然后将混合物加热回流，当溶液由猩红色变为澄清的橙色时，反应完毕，冷却至室温，减压旋蒸除去溶剂，所得固体用蒸馏水洗涤3次即得产物；其中罗丹明6G和80% 水合肼的摩尔比为1.0 : 12.5；

(2) 目标化合物的合成

将上述制备的罗丹明6G酰肼和对羟基苯乙酮在甲醇溶液中混合，再加入几滴冰乙酸作催化剂，将混合体系加热回流至完全反应，待反应完成后降至室温，将混合体系倒入冰水中，用三乙胺调节溶液至pH = 8，抽滤，并用甲醇洗涤沉淀2-3次，二氯甲烷萃取滤液，无水硫酸镁放入萃取液中，干燥并静置过夜，减压旋蒸除去多余溶剂，所得粗产品经柱色谱分离，得到结构式为I的化合物1-(4-羟基苯)亚胺乙基-N ’-(罗丹明6G-酰肼)；其中罗丹明6G酰肼和对羟基苯乙酮的摩尔比为1.2：1.0 。

3.权利要求1所述化合物1-(4-羟基苯)亚胺乙基-N ’-(罗丹明6G-酰肼)在制备作为对氢离子高选择性裸眼显色识别以及荧光识别探针方面的应用。

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