CN111995599B - 一种比率型荧光分子探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种一种比率型荧光分子探针及其制备方法与应用，其结构式如式Ⅰ所示，
Figure DDA0002669504590000011
本发明提供的比率型检测酸碱度的荧光分子探针的制备方法简单，原料便宜易得，合成工艺简单，产率高，适合规模化生产以及推广运用。本荧光探针由于具有激发态分子内质子转移性质，可有效避免自吸收与生物背景荧光的干扰，且比率型的响应可避免由于探针使用浓度、探针分布不均等导致的误差。在实际检测中，本荧光探针响应快速，检测范围宽，灵敏度高，对于样本中常见的共存物质具有高抗干扰性，并对酸碱度的检测具有良好的可重复性，通过对酸碱度的调节可实现多次循环应用。本发明的探针在环境样本、生物样本等多种场景中的酸碱度检测方面具有广阔的应用前景。

Description

一种比率型荧光分子探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于有机合成与分析检测技术领域，具体涉及一种比率型荧光分子探针及其制备方法与应用。
背景技术
环境样本的酸碱度是一项重要的监测指标，例如江河的酸碱度通常在6-8之间，而湖水则主要在7.2-8.5之间。当水体的酸碱度偏离正常范围后，无论是偏酸性还是偏碱性，都会导致水生生物的种群生长受抑，数量减少，严重影响水体的自净能力。因此在环境样本监测中，对酸碱度值的测定具有十分重要的意义。而在医学与生命科学方面，酸碱度也占据重要位置：作为新陈代谢的重要参数之一，在维持细胞的正常生长、增殖以及信号传导等生理过程中起着关键性作用。在生物体各器官、组织以及体液中，酸碱度值的稳定主要通过酸碱稳态的过程来稳定在一定的范围内，例如血液通常维持在弱碱性(酸碱度＝7.365)，这一酸碱度值也在生物学和医学中被广泛接受为生理酸碱度。而当酸碱稳态出现紊乱时，即会导致酸中毒或碱中毒，抑制多种激素与酶的活性，降低组织与机体的正常功能，长期的酸碱紊乱甚至会对各器官造成不可逆的器质性损伤。此外，偏酸性的细胞环境还不利于细胞摄取钙离子，易造成骨质疏松，并与癌症、老年痴呆症等严重疾病密切相关。目前，常见用于酸碱度值检测的方法主要有酸碱度试纸与电化学酸碱度计，前者仅能通过吸光度的变化实现酸碱度的粗略估量，后者主要通过微电极的电压变化实现对酸碱度的检测，仅适用于单点检测，且不能应用于细胞、组织等复杂样本检测。而荧光光谱法则是利用荧光强度或荧光寿命等的变化来实现对酸碱度值的测定，灵敏度高，选择性好，响应速度快。例如申请号为201910103410.1“一种酸性pH探针化合物及其制备方法”中报道了一种荧光强度增强型的荧光探针，在偏酸性的环境内对酸碱度具有良好的响应效果，能够适用于强酸水体的环境。更重要的是，通过与荧光分子探针的共孵育，荧光光谱法能够实时对细胞内酸碱度变化的原位无损监测。如专利201910332192.9“一种比率型红光发射荧光材料及其作为比率型荧光pH探针的应用”中报道了一种比率型荧光酸碱度检测方法，该方法具有较高的光化学稳定性，且比率型响应能够很大程度上减少由于试剂使用浓度或分布不匀而引起的误差，并具有良好的生物相容性。又如专利201610142707.5“一种比率型pH荧光探针及其制备方法与应用”中报道了一种具有双发射带的比率型荧光探针，可应用于化学体系和生物或细胞内酸碱度的检测；但是其合成路线较为复杂，探针的分离纯化难度大。而基于激发态分子内质子转移(Exited-state intramolecular proton transfer,ESIPT)机理的荧光材料合成工艺较为简单，且其过程容易受到环境酸碱度的影响，随着酸碱度的升高，可导致长波长发射的降低，并伴随短波长烯醇式发射的增强，基于此可设计用于酸碱度检测的比率型荧光探针。例如专利201910141848.9“一种检测细胞内pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用”中公开了一种基于羟基型ESIPT的比率型检测的荧光探针，可实现细胞内酸碱度的快速检测，但是其长波长的发射强度要比短波长低得多，极大地限制了其在环境检测的应用。因此，构建新型的ESIPT荧光材料，发展合成工艺简单、对酸碱环境响应区别明显的比率型荧光探针用来检测酸碱度非常具有实际应用前景。
发明内容
本发明提供了一种比率型检测酸碱度的荧光分子探针及其制备方法与应用，本发明的荧光探针具有快速响应、高灵敏度、强抗干扰能力、宽检测范围、可反复使用的优点。
本发明这种比率型检测酸碱度的荧光分子探针，其结构如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002669504570000021
其中：R1为氟、氯、溴、碘中的一种；R2为氢、卤素、烷基、烷氧基、胺基、二甲氨基中的一种。
优选的，所述比率型检测酸碱度的荧光分子探针，其结构是如式Ⅱ所示：
Figure BDA0002669504570000031
。
本发明这种比率型检测酸碱度的荧光分子探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)向圆底烧瓶中加入化合物1和溶剂，室温搅拌条件下向反应溶液中加入化合物2，接着在设定温度和搅拌条件下进行反应，待反应完毕将反应液倾入水中，析出大量黄灰色固体沉淀，调节溶液pH至6～7，溶液进行抽滤，滤渣经洗涤干燥纯化后，得到化合物3，其合成路线如下：
Figure BDA0002669504570000032
(2)向圆底烧瓶中加入步骤(1)制备的化合物3与溶剂，氮气保护、冰水浴条件下滴加对甲基苯磺酰氯，滴加完毕后，在冰水浴下搅拌一段时间，然后再移至设定温度下进行反应，待反应完毕后将反应液倾入水中，调节溶液pH至5～7后析出大量黄色固体沉淀，反应液进行抽滤，滤渣经洗涤干燥纯化后，得到式Ⅰ结构的荧光探针：
Figure BDA0002669504570000033
。
所述步骤1)中，溶剂为冰醋酸、二氯甲烷、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或多种，化合物1与溶剂的摩尔体积比为(1-3):10mmol/mL；化合物1与化合物2的投料摩尔比为1:(1-1.5)；设定温度为20-60℃，反应时间为2-12h。
所述步骤2)中，溶剂为吡啶、哌啶、吗啉、二氯甲烷、乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或混合溶剂，化合物3与溶剂的摩尔体积比为(1-4):10mmol/mL；化合物3与对甲基苯磺酰氯的投料摩尔比为1:(1-5)。冰水浴中搅拌时间为10-60min；后续反应的设定温度为20-60℃，反应时间为2-24h。
所述步骤(1)中，纯化过程为：抽滤，饱和氯化钠水溶液洗涤，环己烷重结晶。
所述步骤(2)中，纯化过程为：柱层析(石油醚/二氯甲烷＝5/1,v/v)。
一种所述荧光分子探针在比率型检测溶液、生物样本和环境样本中酸碱度的应用。
一种比率型荧光酸碱度探针试剂盒，该探针试剂盒中包括所述的荧光分子探针。
一种可循环重复应用的酸碱度检测方法，该方法中包括所述的荧光分子探针。
本发明的机理如下：
Figure BDA0002669504570000041
本发明所述的荧光分子探针具有2-(2’-氨基苯基)苯并噻唑基团，由于氨基经过强吸电子基团对甲基苯磺酰基修饰后，其氨基氢具有较高的酸性，极易与分子内部的苯并噻唑形成分子内氢键。在酸性环境中，由于激发态分子内质子转移过程的进行，烯胺式转换为亚胺式，从而释放出长波长的亚胺式荧光，且酸性的增强可增强该过程，表现为黄色荧光随着酸碱度的降低而逐渐增强；而当酸碱度逐渐向碱性靠拢时，探针上的2’位氨基可被解离形成氮负离子，阻碍激发态分子内质子转移过程，导致长波长的亚胺式荧光降低，短波长的烯胺式荧光增强，表现为黄色荧光随着酸碱度值的升高而降低，蓝色荧光随着酸碱度的升高而增强。因此，根据荧光检测器对这两个波长的荧光强度进行监测，即可实现对酸碱度的比率型检测。
本发明的具有以下优点：
本发明提供的比率型检测酸碱度的荧光分子探针的制备方法简单，原料便宜易得，合成工艺简单，产率高，适合规模化生产以及推广运用。本荧光探针由于具有激发态分子内质子转移性质，可有效避免自吸收与生物背景荧光的干扰，且比率型的响应可避免由于探针使用浓度、探针分布不均等导致的误差。在实际检测中，本荧光探针响应快速，检测范围宽，灵敏度高，对于样本中常见的共存物质具有高抗干扰性，并对酸碱度的检测具有良好的可重复性，通过对酸碱度的调节可实现多次循环应用。本发明的探针在环境样本、细胞组织、生物样本等多种场景中的酸碱度检测方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1实施例1中荧光探针的化学合成路线。
图2实施例1中荧光探针1H-NMR谱图。
图3实施例2中荧光探针的溶剂效应光谱图。
图4实施例4中荧光探针的酸碱度响应荧光图。
图5实施例4中荧光探针的酸碱度响应荧光发射光谱图。
图6实施例4中荧光探针的荧光强度比值-酸碱度值变化曲线。
图7实施例5中荧光探针的抗干扰性考察结果。
图8实施例6中荧光探针的酸碱可逆性测试结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1
荧光探针的合成
本实施例制备的荧光探针结构式中的R1＝Cl，R2＝H。
本实施例的合成技术路线如图1所示，具体包括以下步骤：
化合物3的合成
称取化合物1 5-氯靛红酸酐(1.96g，10mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入40mL乙酸，溶解后室温搅拌下滴入化合物2邻氨基苯硫酚(1.25g，10mmol)，室温搅拌5h，在反应过程中，反应溶液逐渐由灰色浊液变为淡黄色澄清液体；TLC监测反应进程，原料暗点斑逐渐减少，出现相对极性更小的蓝色荧光点。待反应完毕后，将反应液倾入200mL水中，析出黄灰色沉淀，使用1M的氢氧化钠溶液调节体系至近中性(pH＝6～7)后，大量淡黄色色固体沉淀析出，减压抽滤得到淡黄色固体，并用饱和氯化钠水溶液洗涤3次，置于45℃烘箱中烘干，复溶于二氯甲烷后使用环己烷重结晶得到淡黄色固体粉末2.35g，产率90.0％。
荧光分子探针的合成
称取化合物3(1.30g，5mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入20mL吡啶，将反应体系抽真空并用氮气置换三次，冰水浴搅拌，直至固体完全溶解。在氮气保护、冰水浴的条件下加入对甲基苯磺酰氯(1.14g，6mmol)，冰水浴下搅拌20min后，移至室温搅拌3h；对甲基苯磺酰氯加入前体系为黄色澄清液体，加入后反应溶液由黄色变为橘红色，待反应完全后反应溶液又变为黄色；TLC监测反应进程，原料蓝色荧光点逐渐减少，出现相对极性更大的黄色荧光点。待反应完毕后，将反应液倾入200mL水中，滴入1.0M的稀盐酸溶液后析出大量黄色固体沉淀，直至体系调节为弱酸性(pH＝5～7)后，减压抽滤得到黄色固体，并用饱和氯化钠水溶液洗涤3次，置于45℃烘箱中烘干，复溶于二氯甲烷中，采用干法上样，柱层析分离纯化(石油醚/二氯甲烷＝5/1,v/v)，得到白色固体粉末1.79g，即为该例中的荧光分子探针，其结构式如合成路线图1中所示，产率86.3％。
本实施例制备的荧光分子探针的氢谱图，如图2所示，从图中可以看出，荧光探针的2位氨基经过磺酰基取代后酸性得到明显加强，化学位移达到11.47，应对酸碱度的变化具有良好的灵敏度。
实施例2
荧光探针的溶剂效应
称取实施例1制备的荧光分子探针4.15mg溶入到100mL的各种有机溶剂中(正己烷，二氯甲烷，四氢呋喃，乙腈，N,N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，乙醇，甲醇)，得到在不同极性溶剂中浓度为100μM的荧光探针溶液。使用360nm波长的光源激发，测定荧光发射光谱，经过归一化处理后，得到结果如图3所示。
在非极性溶剂中，如正己烷中荧光发射波长最长，最强发射波长位于565nm，其具有的大Stokes位移(205nm)表明其为荧光分子探针的亚胺式发射；而在极性略大的二氯甲烷、四氢呋喃、乙醇中，最强发射波长出现了一定的蓝移(发射峰分别位于555nm、550nm与550nm)；在甲醇中，由于极性的增大与其较强的给质子能力，荧光探针的最强发射波长出现了蓝移(发射峰位于538nm)，且在475nm处出现了肩峰，应是由于较大极性的甲醇分子与荧光探针分子形成了分子间氢键，一定程度上的取代了溶剂分子内部的分子内氢键，从而导致激发态中的ESIPT过程受阻，出现短波长的烯胺式发射；而在大极性溶剂乙腈、N,N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜中，仅表现为单一的短波长荧光发射(发射峰分别位于475nm、470nm与468nm)，这是由于溶剂分子中的极性基团易与荧光探针分子内的氨基形成分子间氢键，导致探针分子的分子内氢键完全被取代，激发态分子内质子转移过程完全受阻。
实施例3
荧光探针储备液的制备
精密称取实施例1制备的荧光分子探针83mg，加入到100mL容量瓶中，加入二甲基亚砜使其充分溶解并定容，摇匀后得到浓度为2mM的探针储备液。
实施例4
荧光探针的酸碱度滴定的光谱性能测试
配制Tris-HCl(10mM,pH＝7.4)缓冲溶液，用0.1M的稀盐酸和0.1M氢氧化钠水溶液调节酸碱度，得到酸碱度梯度为4-12(4，5，5.5，6，6.5，7，7.4，7.8，8.2，8.6，9，10，11，12)的Tris-HCl溶液。取20μL实施例3中所配置的探针储备液分别加入到酸碱度梯度的Tris-HCl溶液，得到4mL探针浓度为10μM的酸碱度响应体系。以360nm为激发光源，测定酸碱度梯度下探针的荧光发射光谱，并以546nm与478nm处的荧光强度作比值，得到荧光强度比值-酸碱度值变化曲线。
从图4可以看出，整个溶液的荧光由酸性条件下的黄色荧光，逐渐过渡为绿色荧光，再到碱性条件下的蓝色荧光。而从荧光发射光谱(图5)可以看出，探针溶液的荧光发射峰有两处，分别是546nm(长波长，亚胺式发射)与478nm(短波长，烯胺式发射)，两峰相差68nm。酸碱度值在4-12范围内时，随着酸碱度升高，探针溶液在546nm处的荧光发射强度逐渐增大，478nm处的荧光发射强度逐渐降低，表明荧光探针的亚胺式发射会随着酸碱度的提高而逐渐受到抑制，烯胺式发射会随着酸碱度的提高得到促进，双波长的变化呈现出荧光探针对酸碱度的比率型响应。这两处荧光强度的比值随溶液酸碱度值变化的趋势曲线如图6所示。
实施例5
探针的抗干扰性考察：
取20μL实施例3中所配置的探针储备液加入到调节pH＝4的Tris-HCl缓冲溶液中，得到4mL探针在酸性条件下的响应溶液；另又取20μL实施例3中所配置的探针储备液加入到调节pH＝9的Tris-HCl缓冲溶液中，得到4mL探针在碱性条件下的响应溶液。通过在上述的响应溶液中分别掺入空白水溶液、钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、锌离子、铜离子、谷胱甘肽、半胱氨酸、双氧水以及次氯酸，浓度均为100μM，探索探针的荧光信号是否会受到外源物质的影响。结果如图7所示。
在pH＝4的酸性环境中，与未掺入的空白对照进行对比，生物样本中高浓度的钠、钾、钙等离子的掺入并没有导致546nm处的荧光强度出现明显改变，环境样本中常见的重金属离子锌、铜等离子也没有导致荧光强度的异常波动，还原性物种谷胱甘肽与半胱氨酸和氧化性物种双氧水和次氯酸也没有影响到探针的荧光强度，这表明探针对酸性环境的响应并没有受到环境内其他因素的明显干扰；而在pH＝9的碱性环境中，各种干扰物质的掺入也没有导致478nm处的荧光强度出现明显变化，表明探针对碱性环境的响应同样没有受到环境内其他因素的明显干扰。
实施例6
可逆性测试：
取20μL实施例3中所配置的探针储备液加入到3980μL的去离子水中，得到4mL浓度为10μM的探针水溶液。先后使用0.1M的稀盐酸和0.1M的氢氧化钠溶液调节酸碱度为4.0与9.0，测定每一次调节酸碱度值后探针的荧光发射光谱，循环7次，计算每张荧光光谱中发射波长在546nm和478nm的荧光强度比值，得到荧光发射峰强度比值-循环次数图像，见图8。
在将溶液从酸性往碱性调节，荧光探针的荧光强度比值出现了明显的升高，而将碱性条件调回为酸性时，荧光强度比值也回复到了最初始的数值，表明所述荧光探针对于酸碱度的检测具有良好的可逆性，且可以在七次循环后依旧保持对酸碱度良好的灵敏度与响应。

Claims (7)

1.一种比率型检测酸碱度的荧光分子探针，其特征在于，结构如式Ⅰ所示：
Figure 826412DEST_PATH_IMAGE002
其中：R1为氟、氯、碘中的一种；R2为氢。
2.根据权利要求1所述比率型检测酸碱度的荧光分子探针，其特征在于，结构式如式Ⅱ所示：
Figure 477974DEST_PATH_IMAGE004
。
3.一种根据权利要求1或2所述的比率型检测酸碱度的荧光分子探针的制备方法，包括以下步骤：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
（1）向圆底烧瓶中加入化合物1和溶剂，室温搅拌条件下向反应溶液中加入化合物2，接着在设定温度和搅拌条件下进行反应，待反应完毕将反应液倾入水中，析出大量黄灰色固体沉淀，调节溶液pH至6~7，溶液进行抽滤，滤渣经洗涤干燥纯化后，得到化合物3，其合成路线如下：
（2）向圆底烧瓶中加入步骤（1）制备的化合物3与溶剂，氮气保护、冰水浴条件下滴加对甲基苯磺酰氯，滴加完毕后，在冰水浴下搅拌一段时间，然后再移至设定温度下进行反应，待反应完毕后将反应液倾入水中，调节溶液pH至5~7后析出大量黄色固体沉淀，反应液进行抽滤，滤渣经洗涤干燥纯化后，得到式Ⅰ结构的荧光探针：
Figure 585607DEST_PATH_IMAGE006
；
所述步骤1）中，溶剂为冰醋酸、二氯甲烷、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或多种，化合物1与溶剂的摩尔体积比为(1-3):10 mmol/mL；化合物1与化合物2的投料摩尔比为1:(1-1.5)；设定温度为20-60 ℃，反应时间为2-12 h；
所述步骤2）中，溶剂为吡啶、哌啶、吗啉、二氯甲烷、乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或混合溶剂，化合物3与溶剂的摩尔体积比为(1- 4) :10 mmol/mL；化合物3与对甲基苯磺酰氯的投料摩尔比为1:(1-5);冰水浴中搅拌时间为10-60min；后续反应的设定温度为20-60 ℃，反应时间为2-24h。
4.根据权利要求3所述的比率型检测酸碱度的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，纯化过程为：抽滤，饱和氯化钠水溶液洗涤，环己烷重结晶。
5.根据权利要求3所述的比率型检测酸碱度的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中，纯化过程为：柱层析法，溶剂为石油醚/二氯甲烷 = 5/1, v/v。
6.一种根据权利要求1或2所述荧光分子探针在非疾病的诊断中比率型检测溶液、生物样本和环境样本中酸碱度的应用。
7.一种比率型荧光酸碱度探针试剂盒，其特征在于，该探针试剂盒中包括权利要求1或2所述的荧光分子探针。
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