CN104031634A - 一种比率荧光纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种比率荧光纳米探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104031634A CN104031634A CN201410217964.1A CN201410217964A CN104031634A CN 104031634 A CN104031634 A CN 104031634A CN 201410217964 A CN201410217964 A CN 201410217964A CN 104031634 A CN104031634 A CN 104031634A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- zine ion
- probe
- fluorescent
- fluorescence
- ratio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 50
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 18
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 47
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims abstract description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 56
- -1 bipyridyl ruthenium Chemical compound 0.000 claims description 15
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- FWLQTOSQDYKDHG-UHFFFAOYSA-N CCCCCCCC[ClH]CCCCCCCNC1=NC2=CC=CC=C2C=C1 Chemical group CCCCCCCC[ClH]CCCCCCCNC1=NC2=CC=CC=C2C=C1 FWLQTOSQDYKDHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000555268 Dendroides Species 0.000 claims description 6
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 claims description 6
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 6
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 3
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 claims description 3
- HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxybutanediamide Chemical compound NC(=O)CCC(=O)NO HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 claims description 2
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 claims description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 abstract description 3
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 abstract 2
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 abstract 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000012890 simulated body fluid Substances 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 2
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- WREVVZMUNPAPOV-UHFFFAOYSA-N 8-aminoquinoline Chemical class C1=CN=C2C(N)=CC=CC2=C1 WREVVZMUNPAPOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGCXGMAHQTYDJK-UHFFFAOYSA-N Chloroacetyl chloride Chemical class ClCC(Cl)=O VGCXGMAHQTYDJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229920006516 PEI-Q Polymers 0.000 description 1
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical class CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000005010 aminoquinolines Chemical class 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 229940027991 antiseptic and disinfectant quinoline derivative Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001601 polyetherimide Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 125000005493 quinolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 1
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本发明涉及生物医学检测和生化分析领域，具体公开了一种表面功能化的二氧化硅荧光纳米粒子用于细胞内外锌离子检测的新荧光探针；所述探针是将接枝氨基喹啉的树枝状聚乙烯亚胺衍生物共价连接在包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子表面，利用比率荧光方法进行细胞内外锌离子的检测。该发明属于对锌离子荧光检测方法的改进，能最大限度地提高检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测和生化分析领域，更具体地，涉及一种比率荧光纳米探针及其制备方法和应用。
背景技术
锌离子是仅次于铁离子之后人体内第二多的过渡金属离子。其在生物过程中主要以二价阳离子的形式存在并且在整个生物体系中发挥着十分重要的作用。研究表明锌离子能够与一些特定的蛋白质结合，作为其结构的辅助因子和催化中心，发挥酶的作用，另外脑功能、基因转移、免疫功能、神经信号传导等生物过程都和锌离子相关。所以锌离子的检测已经成为生物分析的一个重要研究方向，快速灵敏的进行锌离子检测在临床上具有重要意义。
锌离子稳定的 d10电子结构使得许多光谱分析和电化学方法均不适于锌离子的检测，于是荧光分析方法就成为了锌离子检测的最好选择。荧光检测方法具有操作便捷、灵敏度高等优点，已经成为生物体内外各种金属离子检测的一种有力手段。基于光诱导电子转移的喹啉衍生物，由于其pH不敏感，能够与金属配位，光稳定性好等优点被广泛的用于生物体内锌离子检测。然而，大多数喹啉类的荧光探针在锌离子检测过程中往往存在复杂的合成过程，水溶性差，细胞通透性差，检测灵敏度低等缺点，限制了其在生物分析中的应用。另外，传统单发射荧光检测探针，往往易受检测环境、样品处理、仪器设备等因素的影响，其分析的精确性不易控制。
比率荧光测定方法是荧光分析中一个重要的方法，它利用荧光探针的物质响应荧光信号与自身内标荧光的比值来进行待测物的定量分析。这种检测策略以相同背景下测定的荧光强度的比值作为信号参数，能够极大的消除背景荧光对检测信号的干扰，从而提高检测的灵敏度。这种双发射的比率荧光探针对于细胞内物质的传感检测具有十分明显的优势，如能够校正细胞中细胞液粘度、离子效应、pH、光散射等因素对荧光信号的干扰，有效的提高检测的准确性。因此设计合成比率型荧光探针具有很好的应用前景。纳米技术的兴起也极大的推动了新型荧光探针的制备和发展，构建新型纳米荧光探针对Zn2+进行检测已经引起广泛关注。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有锌离子荧光检测方法中喹啉衍生物水溶性差，细胞通透性差，单发射检测方法易受到复杂基质背景干扰，灵敏度不高的缺陷，提供一种基于双发射的比率荧光检测方法。所述方法将接枝氨基喹啉的树枝状聚乙烯亚胺衍生物共价连接在包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子表面，利用氨基喹啉与锌离子特异性识别反应产生的在波长500 nm处的荧光与二氧化硅荧光纳米粒子在波长600 nm处固定不变的荧光的比值进行锌离子的灵敏检测，极大提高检测灵敏度，并可用于细胞中锌离子的实时成像。
本发明首先提供一种比率荧光纳米探针，包括包埋有联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子，和通过共价键与二氧化硅荧光纳米粒子连接的水溶性锌离子识别探针。
所述的水溶性锌离子识别探针是由氨基喹啉类衍生物与树枝状聚乙烯亚胺接枝形成。
所述的氨基喹啉类衍生物为8-氯乙酰基氨基喹啉。
根据需求再提供一种上述的比率荧光纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
S1. 水溶性锌离子识别探针的合成：将氨基喹啉类衍生物、树枝状聚乙烯亚胺与无水碳酸钾混合，搅拌，进行接枝反应，加热在惰性气体保护下进行回流回收；
S2. 包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子的制备；
S3. 比率荧光纳米探针的制备；将步骤S1所得的水溶性锌离子识别探针和步骤S2所得的二氧化硅荧光纳米粒子加入到磷酸缓冲液中，室温反应，即得。
S2中所述的包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子的制备采用油包水的反相微乳法制备。
S3中所述的磷酸缓冲液含有N-羟基琥珀酰亚胺和(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
根据以上材料，再提供一种锌离子荧光检测方法，使用上述的比率荧光纳米探针。
包括以下步骤：
SI. 体液中锌离子的检测：将比率荧光纳米探针加入到离心管中，加入不同浓度的锌离子，再用磷酸缓冲液定容，孵育，在365 nm紫外灯下拍照，并用荧光分光光度计测定其在420-750 nm范围内的荧光光谱，激发波长为370 nm；
SII. 细胞内的锌离子成像：分别用共聚焦显微镜观察不用外源锌粒子和用外源锌离子（50 μM的ZnCl2）处理的细胞，记录绿色荧光通道和红色荧光通道荧光信号的改变和二者比值的变化考察荧光纳米探针对锌离子的响应。
本文所制备的比率荧光纳米探针具有一下特点和优势：
（1）氨基喹啉衍生物作为锌离子识别基团，被接枝在低分子量的树枝状的聚乙烯亚胺（PEI）上面，从而降低了其可能的细胞毒性，提高水分散性以及所制备探针的细胞渗透性。
（2）将锌离子荧光探针接枝在二氧化硅荧光纳米粒子的表面，运用比率荧光的方法进行检测，这种检测方式能消除背景的干扰，提高检测的准确度，使荧光探针更加的稳定。
（3）每个荧光纳米二氧化硅表面都有大量的锌离子识别单元，能够使信号放大，从而能够高效、灵敏地检测锌离子。
附图说明
图1. 基于基于比率荧光纳米探针用于锌离子检测的原理图。
图2. 比率荧光纳米探针对模拟体液中锌离子的响应荧光光谱及标准曲线。
图3. 比率荧光纳米探针对人宫颈癌细胞内的锌离子成像图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
如图1所示，本发明首先通过化学方法合成了8-氯乙酰基氨基喹啉，而后用树枝状聚乙烯亚胺的氨基取代8-氯乙酰基氨基喹啉的氯制备出水溶性锌离子识别探针（PEI-Q），最后我们将这种水溶性的锌离子识别探针通过共价键连接在包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子的表面，从而制得用于锌离子检测的新型比率荧光纳米探针。
（1）8-氯乙酰基氨基喹啉的合成：首先准确称取288 mg 8-氨基喹啉于25 mL圆底烧瓶中，再向其中加入202 mg三乙胺以及10 mL二氯甲烷，室温搅拌一段时间使体系混合均匀。然后在冰浴下将246 mg氯乙酰氯缓慢的滴加到反应体系中，40 min内滴完。最后将反应体系升至室温并使反应24 h。用薄层色谱检测反应完全后，用真空旋转蒸发除去溶剂得到粗产物。再将得到的粗产物用色谱柱（硅胶，PE/EA=3:1 ）提纯，得到为浅白色固体，真空干燥箱40 ℃干燥后备用。
（2）聚乙烯亚胺-氨基喹啉衍生物（PEIQ）的合成：取50 mL的圆底烧瓶，向其中加入44 mg 的 8-氯乙酰基氨基喹啉及20 mL乙腈，待反应物溶解后，再加入500 mg的聚乙烯亚胺和38.4 mg的无水碳酸钾，搅拌一段时间后，加热使体系在氮气保护下回流8 h。薄层色谱用来检测体系反应程度，待原料反应完全，用旋转蒸发除去乙腈得到粗产物。再将得到的粗产物通过共沉淀除去未反应的杂质，纯化后得到黄色油状物，真空干燥后备用。
（3）包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子的制备：向50 mL圆底烧瓶中加入7.5 mL环己烷，1.77 mL TX-100，1.8 mL正己醇和340μL重蒸水。均匀搅拌20 min后，反应体系形成了油包水的微乳体系，然后再向混合物中缓慢滴加80 μL 0.1 mol/L联吡啶钌水合物以及100 μL四甲氧基硅氧烷，反应30 min后，加入60μL 28%氨水使硅氧烷水解。室温下反应24h以后，再加入50 μL 四甲氧基硅氧烷和50 μL CTES，随后再在室温下反应24 h。待反应完成，向反应体系中加入20 mL丙酮破乳，接着超声，涡旋，8000 rmp离心。按照以上方法再用乙醇洗两次，水洗一次后，将得到的二氧化硅荧光纳米粒子分散于重蒸水中待用。
（4）比率荧光纳米探针的制备：将0.1 g羧基化的二氧化硅荧光纳米粒子和0.05 g PEIQ加入到20 mL含5 mM N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和2 mM (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）的浓度为0.01 M的磷酸缓冲液中（pH = 7.4）。随后将反应体系置于室温下反应15 h。反应完成以后，用离心机除去未修饰的PEI衍生物及无机盐，将最终制备的比率荧光纳米探针分离出来，并依次用超纯水洗涤后，分散于PBS中，放置于4 ℃备用。
本发明利用在单一波长激发下，二氧化硅荧光纳米粒子（内标）在发射波长600 nm处的荧光强度和聚乙烯亚胺-喹啉衍生物与锌离子络合物发射的波长500 nm处荧光强度的比值作为检测信号来检测锌离子浓度，这种双发射的比率荧光探针能够消除背景信号的干扰，大大提高锌离子检测的灵敏度。本发明将其用于体外模拟体液中锌离子的检测，并用于细胞内锌离子的实时荧光成像。
（1）模拟体液中锌离子的检测：比率荧光纳米探针用于在PBS中进行锌离子检测的过程：首先，取1.5 mL的离心管，向其中加入2.4 μg的比率荧光纳米探针，然后再向反应体系中加入不同浓度的锌离子，最后用磷酸盐缓冲溶液定容到1.2 mL（使得锌离子的最终浓度为：0，1,2，4，6，10，15，20，30,50，100 μM）。然后混合体系在37 ℃下孵育5 min后，在365 nm紫外灯下拍照，并用荧光分光光度计测定其在420-750 nm范围内的荧光光谱，激发波长为370 nm。
（2）细胞内的锌离子成像。
本发明以人宫颈癌细胞（HeLa细胞）作为细胞模型。用含有10%胎牛血清（FBS，Gibco）、100 U mL-1青霉素及100 μg mL-1链霉素的H-DMEM培养基培养HeLa细胞，培养条件： 37 ℃，5% CO2，两天换液一次。细胞成像：将处在对数期的HeLa细胞接种于6孔的细胞培养皿中（每孔105个细胞 ），当细胞覆盖率到达60-70%左右时，将比率荧光纳米探针悬浮液（10 μg mL-1）加入到6孔板中，37 ℃下孵育3 h后，再向其中加入50μM氯化锌溶液，继续孵育半个小时，之后，弃去培养基，用PBS洗板两次后，将HeLa细胞放在激光共聚焦下观察成像效果。
如图2所示，当没有锌离子存在的情况下，只在波长600 nm附近看到了一个明显的荧光发射光谱。随着锌离子浓度的不断增大，在波长600 nm处的荧光强度基本保持不变，而在波长500 nm处的荧光强度持续增加，该比率荧光纳米探针的荧光比值（F500/F600）不断升高，而且在一定范围内荧光比值还与锌离子的浓度之间线性相关，这种比率荧光纳米探针检测到锌离子的浓度低至0.5 μM，线性范围为1.0-20 μM（R2=0.98）。与其他的喹啉基的分子探针或纳米传感器相比，这种比率荧光纳米探针具有更好的水溶性和更低的灵敏度。
利用荧光显微镜对细胞内锌离子荧光成像进行了研究，如图3所示，当该比率荧光纳米探针与HeLa细胞共同孵育3 h以后，从明场图像中我们看到细胞伸展良好，具有完整的细胞核和细胞膜结构，而在绿色荧光通道中我们几乎没有观察到荧光信号，这主要是由于HeLa细胞内的锌离子浓度过低，相反通过红色荧光通道我们观察到了很强的荧光信号，这是二氧化硅荧光纳米粒子本身的荧光信号。通过荧光通道和明场通道的叠加图片，我们观察到荧光信号定位于细胞核周围的细胞质中的，显示出纳米探针具有优异的膜渗透性和小的细胞毒性。当细胞用外源性锌粒子处理（50 μM的ZnCl2）之后，相比于不经处理的细胞图片，绿色荧光通道显示出非常强的荧光发射，而红色通道荧光基本没有变化，从明场和荧光通道的叠加图像可以看出荧光纳米探针的的荧光发射颜色从红色变成绿色，在HeLa细胞中呈现出黄绿色，这是由于红光与绿光叠加为黄光的缘故，这与在水溶液中观察到的荧光光谱非常一致，这种变化通过观察分离的检测通道更加明显。实验结果表明这种新颖的比率荧光纳米探针显示出细胞内锌离子检测的能力，能够进行双发射的细胞成像检测。
Claims (8)
1.一种比率荧光纳米探针，其特征在于，包括包埋有联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子，和通过共价键与二氧化硅荧光纳米粒子连接的水溶性锌离子识别探针。
2.根据权利要求1所述的比率荧光纳米探针，其特征在于，所述的水溶性锌离子识别探针是由氨基喹啉类衍生物与树枝状聚乙烯亚胺接枝形成。
3.根据权利要求2所述的比率荧光纳米探针，其特征在于，氨基喹啉类衍生物为8-氯乙酰基氨基喹啉。
4.一种根据权利要求1所述的比率荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 水溶性锌离子识别探针的合成：将氨基喹啉类衍生物、树枝状聚乙烯亚胺与无水碳酸钾混合，搅拌，进行接枝反应，加热在惰性气体保护下进行回流回收；
S2. 包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子的制备；
S3. 比率荧光纳米探针的制备；将步骤S1所得的水溶性锌离子识别探针和步骤S2所得的二氧化硅荧光纳米粒子加入到磷酸缓冲液中，室温反应，即得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S2中所述的包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子的制备采用油包水的反相微乳法制备。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S3中所述的磷酸缓冲液含有N-羟基琥珀酰亚胺和(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
7.一种锌离子荧光检测方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的比率荧光纳米探针。
8.根据权利要求7所述的锌离子荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
SI. 体液中锌离子的检测：将比率荧光纳米探针加入到离心管中，加入不同浓度的锌离子，再用磷酸缓冲液定容，孵育，在365nm紫外灯下拍照，并用荧光分光光度计测定其在420-750 nm范围内的荧光光谱，激发波长为370 nm；
SII. 细胞内的锌离子成像:分别用共聚焦显微镜观察不用外源锌离子和用外源锌离子处理的细胞，记录绿色荧光通道和红色荧光通道荧光信号的改变和二者比值的变化考察荧光纳米探针对锌离子的响应。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410217964.1A CN104031634B (zh) | 2014-05-22 | 2014-05-22 | 一种比率荧光纳米探针及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410217964.1A CN104031634B (zh) | 2014-05-22 | 2014-05-22 | 一种比率荧光纳米探针及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104031634A true CN104031634A (zh) | 2014-09-10 |
| CN104031634B CN104031634B (zh) | 2015-11-11 |
Family
ID=51462637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410217964.1A Expired - Fee Related CN104031634B (zh) | 2014-05-22 | 2014-05-22 | 一种比率荧光纳米探针及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104031634B (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104597015A (zh) * | 2015-01-09 | 2015-05-06 | 东南大学 | 锌离子检测用量子点比率荧光探针及其检测方法 |
| CN105510599A (zh) * | 2016-01-07 | 2016-04-20 | 江苏大学 | 一种Ru-SiO2PEI纳米粒子构建的免疫传感器的制备方法及应用 |
| CN106970058A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-07-21 | 苏州尚稷电子科技有限公司 | 一种双荧光发射面的微量物质检测仪及检测方法 |
| CN107677656A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-02-09 | 福州大学 | 一种比率荧光纳米探针及其应用 |
| CN108904801A (zh) * | 2018-07-20 | 2018-11-30 | 中山大学 | 一种多功能纳米囊泡及其制备方法 |
| CN109884023A (zh) * | 2019-05-08 | 2019-06-14 | 烟台大学 | 锌离子检测方法及锌离子检测用发光纳米探针的制备方法 |
| CN109884009A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-06-14 | 福建中医药大学 | 一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素a的检测方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1981047A2 (en) * | 2007-03-30 | 2008-10-15 | TDK Corporation | Photoelectric conversion device |
| CN101864291A (zh) * | 2010-05-26 | 2010-10-20 | 上海大学 | 荧光纳米粒子Ru(bpy)3/SiO2、其制备方法及应用 |
| CN102127421A (zh) * | 2010-12-17 | 2011-07-20 | 山西大同大学 | 一种铜离子和汞离子荧光分子探针及其制备方法和应用 |
-
2014
- 2014-05-22 CN CN201410217964.1A patent/CN104031634B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1981047A2 (en) * | 2007-03-30 | 2008-10-15 | TDK Corporation | Photoelectric conversion device |
| CN101864291A (zh) * | 2010-05-26 | 2010-10-20 | 上海大学 | 荧光纳米粒子Ru(bpy)3/SiO2、其制备方法及应用 |
| CN102127421A (zh) * | 2010-12-17 | 2011-07-20 | 山西大同大学 | 一种铜离子和汞离子荧光分子探针及其制备方法和应用 |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104597015A (zh) * | 2015-01-09 | 2015-05-06 | 东南大学 | 锌离子检测用量子点比率荧光探针及其检测方法 |
| CN104597015B (zh) * | 2015-01-09 | 2017-02-01 | 东南大学 | 锌离子检测用量子点比率荧光探针及其检测方法 |
| CN105510599A (zh) * | 2016-01-07 | 2016-04-20 | 江苏大学 | 一种Ru-SiO2PEI纳米粒子构建的免疫传感器的制备方法及应用 |
| CN105510599B (zh) * | 2016-01-07 | 2017-08-04 | 江苏大学 | 一种Ru‑SiO2 @PEI纳米粒子构建的免疫传感器的制备方法及应用 |
| CN106970058A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-07-21 | 苏州尚稷电子科技有限公司 | 一种双荧光发射面的微量物质检测仪及检测方法 |
| CN107677656A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-02-09 | 福州大学 | 一种比率荧光纳米探针及其应用 |
| CN107677656B (zh) * | 2017-09-27 | 2019-05-10 | 福州大学 | 一种比率荧光纳米探针及其应用 |
| CN108904801A (zh) * | 2018-07-20 | 2018-11-30 | 中山大学 | 一种多功能纳米囊泡及其制备方法 |
| CN109884009A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-06-14 | 福建中医药大学 | 一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素a的检测方法 |
| CN109884009B (zh) * | 2019-02-27 | 2021-03-02 | 福建中医药大学 | 一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素a的检测方法 |
| CN109884023A (zh) * | 2019-05-08 | 2019-06-14 | 烟台大学 | 锌离子检测方法及锌离子检测用发光纳米探针的制备方法 |
| CN109884023B (zh) * | 2019-05-08 | 2019-07-30 | 烟台大学 | 锌离子检测方法及锌离子检测用发光纳米探针的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104031634B (zh) | 2015-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104031634A (zh) | 一种比率荧光纳米探针及其制备方法和应用 | |
| Hu et al. | A signal-amplified ratiometric fluorescence biomimetic sensor based on the synergistic effect of IFE and AE for the visual smart monitoring of oxytetracycline | |
| Liu et al. | Ratiometric fluorescent sensor for visual determination of copper ions and alkaline phosphatase based on carbon quantum dots and gold nanoclusters | |
| Zhao et al. | A dual-potential electrochemiluminescence ratiometric approach based on graphene quantum dots and luminol for highly sensitive detection of protein kinase activity | |
| Liu et al. | A dual-site two-photon fluorescent probe for visualizing lysosomes and tracking lysosomal hydrogen sulfide with two different sets of fluorescence signals in the living cells and mouse liver tissues | |
| CN106905310B (zh) | 一种检测次氯酸的荧光探针及其制备方法和应用 | |
| Li et al. | A mitochondria-targeted fluorescent probe for fast detecting hypochlorite in living cells | |
| CN109762558A (zh) | 一种用于定量检测尿液中PPi含量的比率型荧光探针的制备方法 | |
| EP3096143B1 (en) | Iron(ii) ion detection agent and detection method using same | |
| Chen et al. | Energy transfer-based biodetection using optical nanomaterials | |
| CN110563650B (zh) | 一种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针及其合成方法和应用 | |
| US20150192589A1 (en) | Method using fluorescent turn-on probes for cell-specific detection | |
| Shi et al. | Selective imaging of cancer cells with a pH-activatable lysosome-targeting fluorescent probe | |
| Shi et al. | A novel dual-emission ratiometric fluorescent nanoprobe for sensing and intracellular imaging of Zn2+ | |
| CN109336815B (zh) | 一种检测细胞内质网内次氯酸的双光子荧光探针 | |
| WO2023185543A1 (zh) | 一种双通道可视化多色荧光探针的制备及检测方法 | |
| CN110078665A (zh) | 一种内质网靶向的检测次氯酸的荧光探针和应用 | |
| WO2020007210A1 (zh) | 可用于卵巢癌的一种具有聚集诱导发射效应的水溶性荧光探针和纳米粒及其制备方法和应用 | |
| Han et al. | A ratiometric nanoprobe consisting of up-conversion nanoparticles functionalized with cobalt oxyhydroxide for detecting and imaging ascorbic acid | |
| CN108948081B (zh) | 一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针及其合成方法与应用 | |
| CN106117241A (zh) | 一种检测癌细胞内溶酶体pH的荧光探针 | |
| CN110818646B (zh) | 基于聚集诱导发光小分子荧光探针及其制备方法及应用 | |
| CN110526908B (zh) | 基于2-苯乙烯基吲哚盐类衍生物长波发射可区分检测Cys/Hcy荧光探针及其应用 | |
| CN107674675A (zh) | 检测用叶酸受体靶向碳量子点turn‑on探针的制备方法及其产品和应用 | |
| WO2011033531A1 (en) | A reusable end-capped bipyridine compound useful for selective detection of cyanide anions and process for preparation thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20151111 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |