CN109884009B

CN109884009B - 一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素a的检测方法

Info

Publication number: CN109884009B
Application number: CN201910147148.0A
Authority: CN
Inventors: 许惠凤; 朱希; 余丽双; 王丽丽; 张诗琪
Original assignee: Fujian University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Fujian University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2019-02-27
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2039-02-27
Also published as: CN109884009A

Abstract

本发明涉及一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，该方法利用目标物赭曲霉素A诱导介孔硅球释放钌联吡啶以及荧光硅量子点与钌联吡啶之间具有荧光能量转移的特点，构建荧光比率型传感器对赭曲霉素A进行检测；其中，所述介孔硅球为适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球，所述适配体的序列为：5’‑GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAG CATCGGACA‑3'。该检测方法无需对识别OTA的适配体序列进行标记，不仅节约了检测的成本，更避免了因对适配体标记所引起的亲和能力的下降。

Description

一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法

技术领域

本发明涉及一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法。

背景技术

赭曲霉素A(OTA)是真菌类物质在生长过程中分泌的次生代谢产物，对人类和动物具有肾毒性、肝毒性、神经毒性、免疫毒性和致畸性等危害。而且，OTA的化学稳定性很好，在体内代谢速度很慢。考察到这一系列危害，OTA被视为一种潜在的致癌物质。因此，开发高性能的检测手段用于农产品中OTA的检测具有重要的意义。研究者设计出了诸多方法，如荧光、比色、化学发光，电化学等，实现对OTA的定量检测。其中，荧光技术具有高灵敏、肉眼可视、操作简便等优点，受到科研工作者的广泛兴趣。各种荧光纳米材料，包括无机量子点，上转化材料和金属纳米簇等，作为荧光探针，用于开发各种荧光传感器用于OTA的检测。在这些荧光传感器中，荧光信号多数都是来自于单一发射波长的荧光光源，而这种单一信号的荧光方法很容易受到各种外界因素的干扰。

为了解决这一问题，一些研究人员开发出了一种比率型荧光传感器。所谓的比率型荧光传感器，需要有两种不同波长的荧光光源，它们强度的比值能够用于待测物的定量检测。目前，用于OTA检测的比率型荧光传感器需要有毒的无机量子点，这可能引起环境的污染并危害我们的健康；同时，大多数比率型荧光传感器需要官能团修饰的适配体，这增加了实验成本，并有可能影响适配体的亲和力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全无污染、免标记型的目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，利用目标物赭曲霉素A诱导介孔硅球释放钌联吡啶以及荧光硅量子点与钌联吡啶之间具有荧光能量转移的特点，构建荧光比率型传感器对赭曲霉素A进行检测；

其中，所述介孔硅球为适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球，所述适配体的序列为：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：1)采用了对环境无污染的硅量子点作用荧光源，利用硅量子点与钌联吡啶之间具有荧光能量转移的特点，构建了一种比率型荧光传感器对OTA进行检测；2)无需对识别OTA的适配体序列进行标记，不仅节约了检测的成本，更避免了因对适配体标记而引起的亲和能力的下降；3)采用目标物介导钌联吡啶的释放而产生比率型荧光的检测，在一定程度上减小了外界环境对检测体系的干扰。

附图说明

图1是利用目标物介导的比率型荧光传感器用于OTA的检测原理图。

图2是本发明的检测方法对不同浓度OTA检测后所得的OTA标准曲线。

图3是本发明的检测方法用于检测常见毒素的响应图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，利用目标物赭曲霉素A诱导介孔硅球释放钌联吡啶以及荧光硅量子点与钌联吡啶之间具有荧光能量转移的特点，构建荧光比率型传感器对赭曲霉素A进行检测；

其中，所述介孔硅球为适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球，所述适配体的序列为：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'。该适配体序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

本发明利用目标物诱导介孔硅球中钌联吡啶的释放和荧光硅量子点与钌联吡啶间的相互作用，提供一种检测灵敏、快速且便捷的比率型荧光方法对OTA检测。其检测原理如图1所示。

所述的目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，它包括以下步骤：

步骤一：制备水溶性硅量子点；

步骤二：制备适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球；

步骤三：配制不同浓度的赭曲霉毒素A标准溶液；

步骤四：绘制荧光强度比值与赭曲霉毒素A浓度的标准曲线并获得荧光强度比值与赭曲霉毒素A浓度的线性回归方程：

将不同浓度的赭曲霉毒素A标准溶液分别加入到适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球中，在37℃下振荡10-80min后(其中，最优的振荡反应时间为1h)，分别离心，再在离心所得的上清液中，分别加入水溶性硅量子点，且145μL的上清液中加入5μL的水溶性硅量子点；之后利用荧光光度计在400～680nm下对上述加有水溶性硅量子点的上清液进行检测，并分别记录这些上清液在442nm与625nm处的荧光强度，进而获得这两个波长下荧光强度的比值，根据赭曲霉毒素A标准溶液的浓度以及相应的荧光强度比值，绘制出荧光强度比值与赭曲霉毒素A浓度的标准曲线；根据所得的标准曲线，进一步获得荧光强度比值与赭曲霉毒素A浓度的线性回归方程；

步骤五：待测液检测：将待测液加入到适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球中，在37℃下振荡10-80min(最优的振荡反应时间为1h)；接着离心后，将5μL的水溶性硅量子点加入到145μL离心所得的上清液中，利用荧光光度计在400～680nm下对加有水溶性硅量子点的上清液进行检测，并记录该上清液在442nm与625nm处的荧光强度，获得这两个波长下荧光强度的比值，将该荧光强度的比值代入步骤四所得的线性回归方程中，经计算得待测液的赭曲霉毒素A浓度。

其中，步骤一制备水溶性硅量子点的具体方法为：将柠檬酸三钠、3-氨丙基三乙氧基硅烷分散在充满氮气的蒸馏水，振荡均匀；混合液转移入聚四氟乙烯反应釜中，在170-190℃下密闭加热4-6小时；之后，转入3kDa的透析袋中透析过夜后，定容备用；

步骤二制备适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球的具体方法为：

(1)介孔硅球的合成：将四乙氧基硅烷、乙醇、水以及氨水混合，在室温下搅拌2-3小时得到介孔硅球；

(2)氨基功能化的介孔硅球的制备：将步骤(1)所得的介孔硅球干燥后分散在乙醇中，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌过夜，离心分离后得到氨基功能化的介孔硅球；

(3)配制适配体溶液；

(4)适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球的制备：步骤(2)所得的氨基功能化的介孔硅球与钌联吡啶水溶液混合，振荡放置24小时；之后再将配制好的适配体溶液加入体系中，反应4-5小时；接着，混合物用缓冲溶液清洗3-4次后，分散在缓冲溶液中，得到了适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球；

其中，所用的缓冲溶液包括10mM Tris-HAc、50mM NaCl以及10mM MgCl₂，且pH为7.4；

步骤(3)配制适配体溶液的方法为：把1OD的适配体放入超高速离心机以10000-15000rpm离心5-10min，加入280μL的蒸馏水，充分混匀配成浓度为10μM适配体母液；之后将该适配体母液放入金属恒温加热器中，在90℃下解链5min；拿出，缓慢降至室温，备用；之后用移液枪取20μL 10μM解链后的适配体母液，加入180μL蒸馏水，充分振荡混匀，稀释为1μM适配体溶液，备用；用移液枪移取20μL 1μM适配体溶液，加入180μL 20mM Tris-HCl缓冲液，充分振荡混匀，稀释为100nM适配体溶液；

其中，所述适配体序列为：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'；所述Tris-HCl缓冲液包括100mM NaCl、5.0mM KCl以及5.0mM MgCl₂，且pH为7.4。

步骤(4)中氨基功能化的介孔硅球与钌联吡啶水溶液混合时，所用的钌联吡啶水溶液的浓度为10-30mM。钌联吡啶水溶液的最优浓度为20mM。

赭曲霉毒素A标准溶液的浓度分别为：0，0.5，5，10，30，50，100ng/mL。

下面结合具体实施例，对本发明的内容作更细致地阐述：

实施例一：水溶性硅量子点的制备：

1.5g的柠檬酸三钠和6mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷分散在24mL充满氮气的蒸馏水，振荡均匀。混合液转移入聚四氟乙烯反应釜中，在180℃下密闭加热5小时。转入3kDa的透析袋中透析过夜后，定容至1000mL备用。

实施例二：适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球的制备：

(1)介孔硅球的合成：将0.6mL的四乙氧基硅烷、14mL的乙醇、2mL的水以及0.3mL的氨水混合，在室温下搅拌2小时得到介孔硅球。

(2)氨基功能化的介孔硅球的制备：20mg干燥后的介孔硅球分散在1mL的乙醇中，再加入0.8mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌过夜，离心分离后得到氨基功能化的介孔硅球。

(3)配制适配体溶液：把1OD的适配体放入超高速离心机以10000rpm离心5min，加入280μL的蒸馏水，充分混匀配成浓度为10μM适配体母液；之后将该适配体母液放入金属恒温加热器中，在90℃下解链5min；拿出，缓慢降至室温，备用；之后用移液枪取20μL 10μM解链后的适配体母液，加入180μL蒸馏水，充分振荡混匀，稀释为1μM适配体溶液，备用；用移液枪移取20μL 1μM适配体溶液，加入180μL 20mM Tris-HCl缓冲液，充分振荡混匀，稀释为100nM适配体溶液；

(4)适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球的制备：氨基功能化的介孔硅球与100μL 20mM的钌联吡啶水溶液混合，振荡放置24小时。取100μL100nM配制好的适配体溶液加入体系中，反应4小时。接着，混合物用缓冲液清洗3次后分散在2mL的缓冲液中，得到了适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球。其中，所用的缓冲溶液包括10mM Tris-HAc(pH 7.4)，50mM NaCl以及10mM MgCl₂。

实施例三：配制不同浓度的赭曲霉毒素A标准溶液：用稀释液将赭曲霉毒素A纯品配制为浓度分别为0，0.5，5，10，30，50，100ng/mL的赭曲霉毒素A标准溶液，其中，稀释液为甲醇与水体积比为7：3的溶液。

实施例四：绘制荧光强度比值与赭曲霉毒素A浓度的标准曲线并获得荧光强度比值与赭曲霉毒素A浓度的线性回归方程：

将实施例三所配制的不同浓度的赭曲霉毒素A标准溶液分别加入到适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球中，在37℃下振荡1h后，分别离心，再在离心所得的上清液中，分别加入水溶性硅量子点，且145μL的上清液中加入5μL的水溶性硅量子点；之后利用荧光光度计在400～680nm下对上述加有水溶性硅量子点的上清液进行检测，并分别记录这些上清液在442nm与625nm处的荧光强度，进而获得这两个波长下荧光强度的比值，根据赭曲霉毒素A标准溶液的浓度以及相应的荧光强度比值，绘制出荧光强度比值与赭曲霉毒素A浓度的标准曲线；根据所得的标准曲线，进一步获得荧光强度比值与赭曲霉毒素A浓度的线性回归方程；

其中，浓度为0，0.5，5，10，30，50，100ng/mL的赭曲霉毒素A标准溶液，对应所得625nm和442nm两个波长下荧光强度的比值分别为0.089，0.124，0.168，0.249，0.410，0.608，1.121。上述OTA标准溶液的浓度以及相应的荧光强度比值绘制荧光强度比值与OTA浓度的标准曲线(如图2所示)。根据标准曲线，获得的荧光强度比值与OTA浓度的线性回归方程为y＝0.116+0.01x，相关系数R＝0.9988，其中，y是荧光强度比值，x是OTA标准溶液的浓度。

实施例五：待测液检测：

将待测液加入到适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球中，在37℃下振荡1h；接着离心后，将5μL的水溶性硅量子点加入到145μL离心所得的上清液中，利用荧光光度计在400～680nm下对加有水溶性硅量子点的上清液进行检测，并记录该上清液在442nm与625nm处的荧光强度，获得这两个波长下荧光强度的比值为0.466，将该荧光强度的比值代入步骤四所得的线性回归方程中，经计算得待测液的赭曲霉毒素A浓度为35ng/mL。

其中，计算方法为：0.466＝0.116+0.01x，得x＝35ng/mL。

实施例六：条件优化：

首先，对填充在介孔硅球中钌联吡啶的浓度进行优化，结果得到随着钌联吡啶水溶液的浓度增大，体系的荧光强度逐渐增强，当钌联吡啶水溶液的浓度超过20mM时，荧光强度不再增加，因此，取20mM的钌联吡啶水溶液被作为最佳的填充浓度。

其次，对适配体溶液的浓度进行优化，结果得到随着适配体溶液浓度的增加，钌联吡啶荧光强度逐渐降低。当适配体溶液浓度达到100nM时，荧光强度达到最低值，因此，100nM的适配体溶液被用于封闭钌联吡啶。

最后，发明人考察了适配体与目标物的作用时间。随着反应时间的延长，625nm处荧光强度与442nm处荧光强度的比值逐渐增大，反应时间为1小时的时候，荧光强度的比值达到最大值，最终，将1小时作为最佳反应时间。

实施例七：本发明的检测方法对不同毒素荧光响应情况实验：为验证本发明检测方法的选择性，本发明还考察了在不同毒素存在下，该方法的荧光响应情况(如图3所示)。其中，选择赭曲霉素B(OTB)、OTC、AFB1作为干扰毒素，浓度均为200ng/mL，而OTA的浓度为30ng/mL。从图3中可以看出，该方法仅对目标物OTA有着显著响应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干改变、改进和润饰，这些改变、改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 福建中医药大学

<120> 一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36

Claims

1.一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，其特征在于：利用目标物赭曲霉素A诱导介孔硅球释放钌联吡啶以及荧光硅量子点与钌联吡啶之间具有荧光能量转移的特点，构建荧光比率型传感器对赭曲霉素A进行检测；

其中，所述介孔硅球为适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球，所述适配体的序列为：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'；

所述检测方法，包括以下步骤：

步骤一：制备水溶性硅量子点；

步骤三：配制不同浓度的赭曲霉毒素A标准溶液；

将不同浓度的赭曲霉毒素A标准溶液分别加入到适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球中，在37^◦C下振荡10-80min后，分别离心，再在离心所得的上清液中，分别加入水溶性硅量子点，且145mL的上清液中加入5mL 的水溶性硅量子点；之后利用荧光光度计在400~680 nm下对上述加有水溶性硅量子点的上清液进行检测，并分别记录这些上清液在442nm与625nm处的荧光强度，进而获得这两个波长下荧光强度的比值，根据赭曲霉毒素A标准溶液的浓度以及相应的荧光强度比值，绘制出荧光强度比值与赭曲霉毒素A浓度的标准曲线；根据所得的标准曲线，进一步获得荧光强度比值与赭曲霉毒素A浓度的线性回归方程；

步骤五：待测液检测：将待测液加入到适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球中，在37^◦C下振荡10-80min；接着离心后，将5mL 的水溶性硅量子点加入到145mL离心所得的上清液中，利用荧光光度计在400~680 nm下对加有水溶性硅量子点的上清液进行检测，并记录该上清液在442nm与625nm处的荧光强度，获得这两个波长下荧光强度的比值，将该荧光强度的比值代入步骤四所得的线性回归方程中，经计算得待测液的赭曲霉毒素A浓度。

2.根据权利要求1所述的目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，其特征在于：步骤一制备水溶性硅量子点的具体方法为：将柠檬酸三钠、 3-氨丙基三乙氧基硅烷分散在充满氮气的蒸馏水，振荡均匀；混合液转移入聚四氟乙烯反应釜中，在170-190^◦C下密闭加热4-6小时；之后，转入3 kDa的透析袋中透析过夜后，定容备用。

3.根据权利要求1所述的目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，其特征在于：步骤二制备适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球的具体方法为：

（1）介孔硅球的合成：将四乙氧基硅烷、乙醇、水以及氨水混合，在室温下搅拌2-3小时得到介孔硅球；

（2）氨基功能化的介孔硅球的制备：将步骤（1）所得的介孔硅球干燥后分散在乙醇中，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌过夜，离心分离后得到氨基功能化的介孔硅球；

（3）配制适配体溶液；

（4）适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球的制备：步骤（2）所得的氨基功能化的介孔硅球与钌联吡啶水溶液混合，振荡放置24小时；之后再将配制好的适配体溶液加入体系中，反应4-5小时；接着，混合物用缓冲溶液清洗3-4次后，分散在缓冲溶液中，得到了适配体封闭钌联吡啶填充的氨基功能化的介孔硅球；

其中，所用的缓冲溶液包括10mM Tris-HAc、50mM NaCl以及10mM MgCl₂，且pH为7.4。

4.根据权利要求3所述的目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，其特征在于：步骤（3）配制适配体溶液的方法为：把1 OD的适配体放入超高速离心机以10000 -15000rpm离心5-10 min，加入280 μL的蒸馏水，充分混匀配成浓度为10μM适配体母液；之后将该适配体母液放入金属恒温加热器中，在90℃下解链5 min；拿出，缓慢降至室温，备用；之后用移液枪取20μL 10μM解链后的适配体母液，加入180μL蒸馏水，充分振荡混匀，稀释为1μM 适配体溶液，备用；用移液枪移取20μL 1μM 适配体溶液，加入180μL 20mMTris-HCl缓冲液，充分振荡混匀，稀释为100 nM 适配体溶液；

其中，所述Tris-HCl缓冲液包括100 mM NaCl、5.0 mM KCl以及5.0 mM MgCl₂，且pH 为7.4。

5.根据权利要求3所述的目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，其特征在于：步骤（4）中氨基功能化的介孔硅球与钌联吡啶水溶液混合时，所用的钌联吡啶水溶液的浓度为10-30 mM。

6.根据权利要求1所述的目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，其特征在于：赭曲霉毒素A标准溶液的浓度分别为：0，0.5，5，10，30，50，100ng/mL。