CN106383110B

CN106383110B - 基于纳米金标记适体传感器的ota化学发光检测方法

Info

Publication number: CN106383110B
Application number: CN201610814199.0A
Authority: CN
Inventors: 严喜鸾; 肖义陂; 刘杰
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Shaoxing Sanxun Technology Co ltd
Priority date: 2016-09-09
Filing date: 2016-09-09
Publication date: 2019-05-24
Anticipated expiration: 2036-09-09
Also published as: CN106383110A

Abstract

本发明提供了一种基于纳米金标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，该技术以OTA适体作为固定相，固定于磁性微球表面，并以纳米金作为标记物，通过将报告序列修饰在纳米金粒子表面，从而标记到适体传感器上。基于核酸适配体的高亲和性，利用OTA与报告序列竞争结合OTA适体的竞争关系，且OTA结合适配体的能力强报告序列，从而得到了待测OTA浓度与传感器上所接报告序列量的负相关关系。以报告序列上所连接的纳米金作为检测探针，利用纳米金催化鲁米诺体系产生化学发光信号的原理，建立适体传感器上所连接的纳米金的用量与化学发光强度的对应关系，从而得出OTA浓度与化学发光强度的量化关系，间接实现OTA的定量分析检测。

Description

基于纳米金标记适体传感器的OTA化学发光检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，进一步涉及核酸适配体技术，具体涉及一种基于纳米金标记适体传感器的OTA化学发光检测方法。

背景技术

赭曲霉毒素A(OTA)是一种具有很强毒性的真菌毒素，其毒性在真菌毒素家族中位列第二位，仅次于黄曲霉毒素。OTA在自然界分布广泛，不仅污染谷物粮食，还严重污染动物性食品，对人类构成极大的威胁。鉴于食品安全问题关乎整个社会的安危，是受到国家及人民高度关注的大问题，建立OTA的高灵敏简便快速分析方法越发受到科研人员的重视。

目前，很多基层食品检测部门较多采用薄层层析法进行OTA的定量检测，这也是较早的一种OTA的检测方法，但其存在灵敏度较差、检测周期长、所需试剂较多、重现性差等缺点，已然不能满足现阶段对OTA的检测要求。另外，常见的OTA检测方法还有高效液相色谱-荧光检测法、毛细管电泳-二极管阵列检测法、液相-质谱联用法、固相萃取荧光检测法等，但这些方法通常对样品中毒素纯度做了较高要求，且所使用的相关设备价格昂贵，故存在检测周期长、成本高等一些缺点，导致无法满足大批量样本快速筛查的需要。另外，OTA作为一种小分子物质，其分子量为403.82，是典型的半抗原，故有基于OTA免疫抗体分子作为识别元件的免疫检测方法，例如免疫传感、酶联免疫法等。这些方法虽然灵敏度高、特异性好，但也存在一定的局限性，比如抗体分子制备周期长、成本较高、稳定性差、易失活及易受pH、温度等环境因素影响而变性，故在不同程度上限制了免疫方法检测OTA的开展。

近年来，核酸适配体技术在分析化学尤其是微量物质的定量检测中展现出了突出的技术优势。核酸适配体是通过SELEX技术体外筛选出来的能够特异性结合目标配体的寡聚核苷酸片段。以其特有的高亲和力和特异性，可作为识别探针和生物传感器，与蛋白质类抗体相比，核酸适体不仅能高效、特异性地识别和结合各种生物目标分子，还具有易标记、易合成、性质稳定等优势。然而，要获得可行的检测方法，建立高效的适配体传感器是关键所在，首先适体传感器在分子水平上应当满足实验所选择的发光体系的要求，采用何种标记物，标记物在传感器上的连接方法等都需要进行针对性设计；此外，选择何种分离载体和捕获探针可以完整收集信号物质并实现与信号物质含量成规律的发光反应，也需要根据发光体系、标记物、适配体等物质的性质进行设计；除此之外，发光体系的选择关乎最终检测结果与被检测物质真实含量之间的关系，因此也是影响检测效果的重要因素。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种基于纳米金标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，以解决现有技术中OTA检测方法灵敏性差、结果不稳定的技术缺陷。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于纳米金标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，包括以下步骤：

1)取纳米金溶液与巯基化的报告序列混合后共孵育，固液分离弃上清，得到DNA-AuNPs复合物；

2)通过氨羧反应将氨基修饰的OTA适体固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-OTA适体复合物；

3)将过量的磁性微球-OTA适体复合物与待测样品混合，充分反应；

4)将步骤3)所得产物与过量的DNA-AuNPs复合物混合，反应后取固相，即得到纳米金标记的适体传感器；

5)将步骤4)所述纳米金标记的适体传感器与鲁米诺试剂混匀，而后检测发光信号CL值。

作为优选，步骤1)中混合后溶液中纳米金的终浓度为7～9nM、巯基化的报告序列终浓度为2～4μM；所述共孵育的条件是于室温条件下避光静置14～18h。

作为优选，所述共孵育后，加入磷酸缓冲液至终浓度为8～12mM，加入NaCl至终浓度0.1M，而后继续于室温条件下避光静置35～45h，再在13000～15000r/min的转速条件下离心25～35min。

作为优选，离心后弃沉淀，利用含有0.2M NaCl的10mM磷酸缓冲液洗涤，离心弃上清，重复三次。

作为优选，步骤2)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的OTA适体用量比为3:(1～2)(μg:pmol)的比例加入氨基修饰的OTA适体，于35～39℃震荡反应40～60min。

作为优选，步骤2)还包括以下操作：于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用PBST缓冲溶液洗涤。

作为优选，步骤2)还包括以下操作：利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的PVP溶液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，即得到磁性微球-OTA适体复合物。

作为优选，步骤3)的反应条件是：在35～39℃条件下震荡40～60min。

作为优选，步骤4)包括以下操作：将过量的磁性微球-OTA适体复合物与待测样品混合，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，即得到纳米金标记的适体传感器。

作为优选，步骤5)包括以下操作：取步骤4)所述纳米金标记的适体传感器悬浮于磷酸缓冲液中，向其中加入含有0.1mol/L NaCl、0.01mol/L HCl、25mmol/L Br₂的水溶液，于室温下反应8～12min，而后于55～65℃下保持15～25min，而后加入含有10^-6mol/L鲁米诺、1mol/L NaOH的水溶液，而后检测发光信号CL值。

作为优选，以上技术方案中所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。

作为优选，所述检测发光信号CL值，是利用BPCL微弱化学发光仪实现的。

在以上技术方案中，所述磷酸缓冲液又称为磷酸盐缓冲液，可依据本领域的一般技术常识选择常规的配方实施本发明；所述咪唑缓冲液同样可选用常规配方。所述PBST缓冲液可以是含有137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄·12H₂O，2mM KH₂PO₄，0.05％Tween20的水溶液，其pH是7.2～7.6。

在以上技术方案中，纳米金溶液可以利用其常规方法制备，当然也可以通过以下方法制备获得：取100mL 0.01％的氯金酸(HAuCl₄·4H₂O)于250mL三口烧瓶中，置于集热式磁力加热搅拌器中搅拌并加热煮沸10min；随后立即向煮沸的氯金酸溶液中加入3.0mL1.0％的柠檬酸三钠，继续加热搅拌，溶液颜色由淡黄偏透明色逐渐变为深蓝色，最终变为酒红色。最后继续加热搅拌5min，然后冷却至室温。将制备好的纳米金溶液置于阴暗处，于室温下保存备用。

所制备的纳米金可以通过紫外可见分光光度计和透射电子显微镜对其进行表征。首先，将纳米金溶胶稀释一倍，通过紫外可见分光光度计测定所制纳米金在400～700nm波长范围内的紫外可见吸收光谱；然后，将纳米金溶胶滴在碳支持膜铜网上，自然晾干后，通过透射电子显微镜观察纳米金粒子的形貌特征、粒度分布及粒径大小。

在以上技术方案中，所述巯基化的报告序列是指序列如下所示的核酸-巯基复合物：5’-CACCCACACCCGATC-SH-3’；该物质可自试剂销售公司定制、购得。所述氨基修饰的OTA适体是序列如下所示的核酸-氨基复合物：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-NH2-3’，该物质同样可自试剂销售公司定制、购得。所述过量的磁性微球-OTA适体复合物，是指固定于磁性微球上的OTA适体与OTA的特异性结合反应中，前者量较多、使结合反应完成后仍存在未结合有OTA的磁性微球-OTA适体复合物游离于体系中的情形；具体的磁性微球-OTA适体复合物用量可根据对待测样品中OTA含量的估算来确定，当然亦可参照本发明实施例中磁性微球-OTA适体复合物用量来实施本发明。所述充分反应是指固定于磁性微球上的OTA适体与OTA的特异性结合完全。所述过量的DNA-AuNPs复合物，是指固定在纳米金上的报告序列与固定在磁性微球上的、未与OTA结合的OTA适体之间的杂交反应中，前者量较多、使杂交反应完成后未结合有OTA的磁性微球-OTA适体复合物均结合上报告序列的情形；具体的DNA-AuNPs复合物用量可通过估算体系中未结合有OTA的磁性微球-OTA适体复合物含量来确定，当然亦可参照本发明实施例中DNA-AuNPs复合物用量来实施本发明。

在利用本发明方法执行检测时，可以先利用该方法对一组具有浓度梯度且已知浓度的OTA标准溶液进行检测，以绘制出OTA浓度与发光信号CL值之间的线性关系，而后再对待测样品执行检测，将检测结果带入上述线性关系以获得实际检测值。其中标注曲线的绘制是利用本发明方法绘制的，而其中注入浓度梯度的选择、图表模式的选择、误差的校正等可以依照本领域的一般技术常识确定。

本发明提供了一种基于纳米金标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，该技术方案以OTA适体作为固定相，固定于磁性微球表面，并以纳米金作为标记物，通过将报告序列修饰在纳米金粒子表面，从而标记到适体传感器上。基于核酸适配体的高亲和性，利用OTA与报告序列竞争结合OTA适体的竞争关系，且OTA结合适配体的能力强报告序列，从而得到了待测OTA浓度与传感器上所接报告序列量的负相关关系。以报告序列上所连接的纳米金作为检测探针，利用纳米金催化鲁米诺体系产生化学发光信号的原理，建立适体传感器上所连接的纳米金的用量与化学发光强度的对应关系，从而得出OTA浓度与化学发光强度的量化关系，间接实现OTA的定量分析检测，而且大大提高了检测灵敏度。

附图说明

图1是本发明检测方法的原理示意图。

图2是本发明实施例1中的标准曲线图。

图3是本发明实施例1中对本发明检测方法的特异性考察实验结果。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

在以下技术方案中，巯基化的报告序列是指序列如下所示的核酸-巯基复合物：5’-CACCCACACCCGATC-SH-3’；

氨基修饰的OTA适体是序列如下所示的核酸-氨基复合物：

5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-NH2-3’；二者均购于上海生工生物有限公司。

实施例1

1实验原理

本发明通过在磁性微球表面构建OTA适配体传感器，以羧基磁性微球作为固定载体，并利用磁性分离技术实现了适配体传感器与其它异相的分离。另外，该技术方案还通过在纳米金粒子表面修饰报告序列，利用OTA适体与报告序列的互补杂交，将纳米金粒子作为标记物标记在磁性微球表面。此外，根据纳米金粒子被氧化后形成的AuCl₄ ^-催化鲁米诺体系发生化学发光这一化学发光检测原理，以及在该传感模式下，OTA浓度与磁性微球表面标记的纳米金粒子数量的负相关性，从而得到了OTA浓度与化学发光信号的量化关系，实现了OTA的定量分析检测，实验原理如图1所示。首先，本发明利用氨羧结合反应，将氨基化OTA适体固定在羧基磁性微球表面；然后分别向各组加入不同浓度OTA和等量且过量的DNA-AuNPs，由于OTA适体与OTA特异性结合，导致部分OTA适体空间构型发生变化，不能与纳米金粒子表面修饰的报告序列互补杂交，从而使得磁性微球表面标记的纳米金粒子数量变少，相应的化学发光信号值减小。当没有OTA存在时，磁性微球表面固定OTA适体均没有发生构型改变，与报告序列互补杂交，使得磁性微球表面标记的纳米金粒子数量最多，相应的化学发光信号值最大。当OTA浓度逐渐增大时，磁性微球表面越来越多的OTA适体发生构型改变，使得通过报告序列与OTA适体互补杂交而标记在磁性微球表面的纳米金数量逐渐减少，相应测得的化学发光信号值也逐渐较小。因此，OTA浓度与化学发光信号值呈负相关关系。然而，随着OTA浓度的增加，加入不同浓度OTA的组别对比空白对照组(不加OTA)所引起的化学发光信号值的变化量(ΔCL)逐渐增大。因此，OTA浓度与ΔCL呈正相关关系，从而实现了OTA的定量分析检测。

2实验方法

2.1纳米金的制备及表征

本实验采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备纳米金粒子。实验前，所有玻璃仪器用王水浸泡半小时以上，然后用超纯水冲洗数次。取100mL 0.01％的氯金酸(HAuCl₄·4H₂O)于250mL三口烧瓶中，置于集热式磁力加热搅拌器中搅拌并加热煮沸10min；随后立即向煮沸的氯金酸溶液中加入3.0mL 1.0％的柠檬酸三钠，继续加热搅拌，溶液颜色由淡黄偏透明色逐渐变为深蓝色，最终变为酒红色。最后继续加热搅拌5min，然后冷却至室温。将制备好的纳米金溶液置于阴暗处，于室温下保存备用。

本实验采用紫外可见分光光度计和透射电子显微镜对上述制备的纳米金进行表征。首先，将纳米金溶胶稀释一倍，通过紫外可见分光光度计测定所制纳米金在400～700nm波长范围内的紫外可见吸收光谱；然后，将纳米金溶胶滴在碳支持膜铜网上，自然晾干后，通过透射电子显微镜观察纳米金粒子的形貌特征、粒度分布及粒径大小。

2.2 DNA-AuNPs的制备

取上述制备好的纳米金溶液10mL，离心浓缩至2.5mL，使溶液中的纳米金浓度由2nM浓缩至8nM；将1OD巯基化报告序列溶解于2.5mL纳米金溶液中，使报告序列浓度为3μM，于室温下阴暗处静置16h，使巯基化报告序列充分与金纳米粒子作用；随后分别加入pH7.4的0.2M磷酸缓冲溶液和1M NaCl溶液，使其最终浓度分别为10mM和0.1M，继续于阴暗处静置40h；最后，将DNA-AuNPs溶液于14000r/min的转速下离心30min，移去上清液，用pH7.4的0.2M NaCl-10mML磷酸缓冲溶液洗涤红色油状沉淀，再通过离心分离，重复三次，从而除去未修饰到纳米金表面的多余报告序列。所制备的DNA-AuNPs分散在1.25mL 0.3M NaCl-10mM磷酸缓冲溶液中，4℃保存备用。后续实验用PBS溶液稀释成不同倍数。

2.3纳米金适体传感器制备

取60μg羧基磁性微球于1.5mL离心管中，磁性分离，弃上清液。用100μLpH6.0的0.1M咪唑缓冲溶液洗涤磁性微球，重复三次；使磁性微球重新悬浮于100μL含EDC的咪唑缓冲溶液中，在37℃下震荡活化20min；加入30pmol氨基OTA适体，37℃下震荡反应50min，使OTA适体通过氨羧反应固定于磁性微球表面；通过磁性分离去除上清液，磁性微球用100μLPBST缓冲溶液重复洗涤三次，加入100μL 10％PVP溶液，于37℃下震荡反应50min，封闭磁性微球表面的空白位点；通过磁性分离去除上清液，用100μL PBST缓冲溶液重复洗涤磁性微球三次，分别向各管中加入不同浓度的OTA，37℃下震荡反应50min，使OTA与OTA适配特异性结合；磁性分离去除上清液，用100μL PBST缓冲溶液重复洗涤磁性微球三次，加入100μL 1:67稀释倍数制备好的DNA-AuNPs，37℃下震荡反应50min，使纳米金表面修饰的报告序列与磁性微球表面多余的未与OTA特异性结合的适配体互补杂交，从而将纳米金标记到磁性微球表面；磁性分离去除上清液，磁性微球用100μL PBST缓冲溶液重复洗涤三次；加入50μLPBS缓冲溶液，使制备好的OTA适配体传感器悬浮其中，待化学发光检测。

2.4化学发光检测

向上述OTA适配体传感器悬浮液中加入50μL溴水混合物(0.1mol/L NaCl-0.01mol/L HCl-25mmol/L Br₂)，于室温下反应10min，使金纳米粒子完全反应溶，然后置于60℃下加热20min；最后，取90μL OTA适配体传感器悬浮液转移至玻璃测量瓶中，迅速加入100μL10^-6mol/L鲁米诺-1mol/L NaOH混合溶液，混匀并立即放入化学发光检测器中测定。化学发光信号由BPCL微弱化学发光仪检测，由仪器所连电脑终端显示并记录，化学发光强度以输出信号峰值定量。

2.5纳米金适体传感器化学发光检测OTA性能评价

本发明通过对自酿葡萄酒样本进行加标回收试验，从而评价本方法的准确性及精密度。实验选用了C18固相萃取小柱对葡萄酒中的OTA进行提取净化，C18小柱使用前分别用2mL乙腈和2mL水活化。先取5mL葡萄酒样品加入5mL水，分别按照1、5、10ng/mL水平添加OTA标准品，混合作为上样液进行上样；再分别用10mL水淋洗，2mL甲醇-冰乙酸(99.5：0.5，v/v)进行洗脱，控制流速1mL/min；最后，洗脱液在50℃下用氮气吹干，再用1mL甲醇溶解，0.45μm有机滤膜过滤，滤液即为待测液。随后用本方法对待测液进行化学发光检测，计算加标样品回收率。

另外，本发明还选取了两种食品中常见的真菌毒素AFB1和ZEN以及两种与OTA结构类似的物质WF、NAP对本方法的选择特异性进行考察。实验分别取10ng/mL OTA及与其等物质量浓度的AFB1、ZEN、WF、NAP采用本方法进行分析检测，并观察分别加入AFB1、ZEN、WF、NAP后化学发光信号值的变化。

3实验结果

3.1标准曲线的建立

在优化实验条件下(60μg羧基磁性微球，30pmol氨基OTA适体，1:100的DNA-AuNPs)，利用该传感器对一系列不同浓度的OTA进行化学发发光检测，建立化发光标准曲线。结果如图2所示，OTA浓度在0.01～20ng/mL范围内，ΔCL信号值与OTA浓度的对数值呈现非常好线性关系(Y＝55752.8X-52051.9，r²＝0.9922)，最低检测限为0.01ng/mL。

3.2纳米金适体传感器性能评价

在优化实验条件下(60μg羧基磁性微球，30pmol氨基OTA适体，1:100的DNA-AuNPs)，选用AFB1、ZEN、Warfarin、NAP这四种分析物，对纳米金适体传感器进行特异性考察。实验选择分别在纳米金适体传感器中添加与10ng/mLOTA等水平的以上四种分析物，再进行化学发光检测。结果如图3所示，添加了OTA的对照组CL信号值大幅度下降，ΔCL信号值很高；而添加了AFB1、ZEN、Warfarin、NAP的组别CL信号值基本不变，则ΔCL信号值几乎为零。推测是OTA适体无法识别并特异性结合这四种分析物。由此可知，本发明所设计的纳米金适体传感器对OTA有良好的选择特异性。

另一方面，本发明对自酿葡萄酒进行加标回收实验，来评价纳米金传感器的精密度。实验分别在葡萄酒中添加了三个不同浓度的OTA(1、5、10ng/mL)，采用C18固相萃取小柱进行提取净化，然后通过纳米金适体传感器进行化学发光检测。结果如表1所示，平均回收率在104.1％～112.7％之间，重复三次测定，相对标准偏差在5.9％～8.7％之间。由此可知，本发明所设计的纳米金传感器具有较好的精密度，可行性较强，可用于实际样品中OTA的定量分析。

表1葡萄酒中OTA的加标回收率

4实验结论

本发明通过利用核酸适配体技术及磁性分离技术，在磁性微球表面组建OTA适体传感器。以纳米金作为检测标记物，利用其对鲁米诺化学发光体系的催化活性，实现的OTA的定量分析检测。在优化实验条件下(60μg羧基磁性微球，30pmol氨基OTA适体，1:100的DNA-AuNPs)，OTA浓度在0.01～20ng/mL范围内，化学发光信号下降幅度(ΔCL信号值，Y)与所测OTA浓度(X)之间存在良好的线性关系(Y＝55752.8X-52051.9，r²＝0.9922)，最低检测限为0.01ng/mL。葡萄酒样本的平均加标回收率在104.1％～112.7％之间，重复三次测定，相对标准偏差在5.9％～8.7％之间。本方法具有高精密度及高特异性，可用于实际样品中OTA的高灵敏度快速分析。本发明所设计的纳米金适体传感器，为OTA的分析检测提供一种新的思路，也为分析检测领域开拓了一个新的平台。

实施例2

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)中混合后溶液中纳米金的终浓度为8nM、巯基化的报告序列终浓度为3μM；所述共孵育的条件是于室温条件下避光静置16h。

所述共孵育后，加入磷酸缓冲液至终浓度为10mM，加入NaCl至终浓度0.1M，而后继续于室温条件下避光静置40h，再在14000r/min的转速条件下离心30min，而后弃沉淀，利用含有0.2M NaCl的10mM磷酸缓冲液洗涤，离心弃上清，重复三次。

步骤2)包括以下操作：取磁性微球，利用0.1M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于37℃震荡孵育20min，而后以磁性微球与氨基修饰的OTA适体用量比为2:1(μg:pmol)的比例加入氨基修饰的OTA适体，于37℃震荡反应50min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，而后取固相加入10％的PVP溶液，于37℃条件下震荡50min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，即得到磁性微球-OTA适体复合物。

步骤3)的反应条件是：在37℃条件下震荡50min。

步骤4)包括以下操作：将过量的磁性微球-OTA适体复合物与待测样品混合，于37℃条件下震荡50min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，即得到纳米金标记的适体传感器。

步骤5)包括以下操作：取步骤4)所述纳米金标记的适体传感器悬浮于磷酸缓冲液中，向其中加入含有0.1mol/L NaCl、0.01mol/L HCl、25mmol/L Br₂的水溶液，于室温下反应10min，而后于60℃下保持20min，而后加入含有10^-6mol/L鲁米诺、1mol/L NaOH的水溶液，而后检测发光信号CL值。

实施例3

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)中混合后溶液中纳米金的终浓度为7nM、巯基化的报告序列终浓度为2μM；所述共孵育的条件是于室温条件下避光静置14h。

所述共孵育后，加入磷酸缓冲液至终浓度为8mM，加入NaCl至终浓度0.1M，而后继续于室温条件下避光静置35h，再在13000r/min的转速条件下离心25min。

步骤2)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35℃震荡孵育15min，而后以磁性微球与氨基修饰的OTA适体用量比为3:1(μg:pmol)的比例加入氨基修饰的OTA适体，于35℃震荡反应40min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，而后取固相加入82％的PVP溶液，于35℃条件下震荡40min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，即得到磁性微球-OTA适体复合物。

步骤3)的反应条件是：在35℃条件下震荡40min。

步骤4)包括以下操作：将过量的磁性微球-OTA适体复合物与待测样品混合，于35℃条件下震荡40min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，即得到纳米金标记的适体传感器。

步骤5)包括以下操作：取步骤4)所述纳米金标记的适体传感器悬浮于磷酸缓冲液中，向其中加入含有0.1mol/L NaCl、0.01mol/L HCl、25mmol/L Br₂的水溶液，于室温下反应8min，而后于55℃下保持15min，而后加入含有10^-6mol/L鲁米诺、1mol/L NaOH的水溶液，而后检测发光信号CL值。

实施例4

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)中混合后溶液中纳米金的终浓度为9nM、巯基化的报告序列终浓度为4μM；所述共孵育的条件是于室温条件下避光静置18h。

所述共孵育后，加入磷酸缓冲液至终浓度为12mM，加入NaCl至终浓度0.1M，而后继续于室温条件下避光静置45h，再在15000r/min的转速条件下离心35min。

步骤2)包括以下操作：取磁性微球，利用0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于39℃震荡孵育25min，而后以磁性微球与氨基修饰的OTA适体用量比为3:2(μg:pmol)的比例加入氨基修饰的OTA适体，于39℃震荡反应60min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，而后取固相加入12％的PVP溶液，于39℃条件下震荡60min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，即得到磁性微球-OTA适体复合物。

步骤3)的反应条件是：在39℃条件下震荡60min。

步骤4)包括以下操作：将过量的磁性微球-OTA适体复合物与待测样品混合，于39℃条件下震荡60min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，即得到纳米金标记的适体传感器。

步骤5)包括以下操作：取步骤4)所述纳米金标记的适体传感器悬浮于磷酸缓冲液中，向其中加入含有0.1mol/L NaCl、0.01mol/L HCl、25mmol/L Br₂的水溶液，于室温下反应12min，而后于65℃下保持25min，而后加入含有10^-6mol/L鲁米诺、1mol/L NaOH的水溶液，而后检测发光信号CL值。

实施例5

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)中混合后溶液中纳米金的终浓度为7.5nM、巯基化的报告序列终浓度为3.4μM；所述共孵育的条件是于室温条件下避光静置15h。

所述共孵育后，加入磷酸缓冲液至终浓度为11mM，加入NaCl至终浓度0.1M，而后继续于室温条件下避光静置38h，再在13500r/min的转速条件下离心28min。

步骤3)的反应条件是：在38℃条件下震荡44min。

步骤5)包括以下操作：取步骤4)所述纳米金标记的适体传感器悬浮于磷酸缓冲液中，向其中加入含有0.1mol/L NaCl、0.01mol/L HCl、25mmol/L Br₂的水溶液，于室温下反应9min，而后于56℃下保持19min，而后加入含有10^-6mol/L鲁米诺、1mol/L NaOH的水溶液，而后检测发光信号CL值。

实施例6

一种基于纳米金标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于包括以下步骤：

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.基于纳米金标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取纳米金溶液与巯基化的报告序列混合，混合物中纳米金的终浓度为7～9nM、巯基化的报告序列终浓度为2～4μM，混合后于室温条件下避光静置14～18h，而后加入磷酸缓冲液至终浓度为8～12mM，加入NaCl至终浓度0.1M，而后继续于室温条件下避光静置35～45h，再在13000～15000r/min的转速条件下离心25～35min，得到DNA-AuNPs复合物；

2)取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的OTA适体用量比为3μg:(1～2)pmol的比例加入氨基修饰的OTA适体，于35～39℃震荡反应40～60min，得到磁性微球-OTA适体复合物；

3)将过量的磁性微球-OTA适体复合物与待测样品混合，在35～39℃条件下震荡40～60min；

5)取步骤4)所述纳米金标记的适体传感器悬浮于磷酸缓冲液中，向其中加入含有0.1mol/L NaCl、0.01mol/L HCl、25mmol/L Br₂的水溶液，于室温下反应8～12min，而后于55～65℃下保持15～25min，而后加入含有10^-6mol/L鲁米诺、1mol/L NaOH的水溶液，而后检测发光信号CL值。

2.根据权利要求1所述的基于纳米金标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于离心后弃沉淀，利用含有0.2M NaCl的10mM磷酸缓冲液洗涤，离心弃上清，重复三次。

3.根据权利要求1所述的基于纳米金标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤2)还包括以下操作：于35～39℃震荡反应40～60min后，取固相利用PBST缓冲溶液洗涤。

4.根据权利要求3所述的基于纳米金标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤2)还包括以下操作：利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的PVP溶液，于35～39℃条件下震荡40～60min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，即得到磁性微球-OTA适体复合物。