CN104568905A - 基于sers微流平台的三维码生物检测芯片及制备、检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于SERS微流平台的三维码生物检测芯片及制备、检测方法，所述生物检测芯片包括由下至上设置的玻璃基底、生物识别分子和微流控通道，所述生物识别分子以条状形式分布在玻璃基底上，与条状生物识别分子垂直的方向平行贴合排列多条微流控通道，在微流控通道中先后通入待测样品和SERS探针。通过对各检测区域SERS光谱的采集可以定量分析待测样品，得到各组分的含量。本发明可以实现对大量待测样品中的多个不同组分进行快速、高灵敏、自动化地定量分析检测。
Description
技术领域
本发明涉及光谱学和生物分析领域，具体涉及基于表面增强拉曼散射和微流控的三维码高通量生物检测芯片的设计与应用。
背景技术
随着基因组和蛋白质组学的快速发展，生物医学检测、新型药物开发以及环境监测等领域对于大量生物分子的检测提出了多元与高通量的技术需求。如何实现对大量样品中的不同组分进行方便、快速、高灵敏的分析检测是急需解决的难题。
微流控芯片(芯片实验室)将多种单元模块在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成，能够大幅缩短样品处理时间，显著提高检测灵敏度，降低成本和消耗。微流控芯片可以在很小的面积上集成多个单元模块，其小型化、集成化的特点为高通量检测提供了一个有力的工具。
作为近几年兴起的一种光学探测技术，表面增强拉曼散射(SERS)光谱技术利用表面等离子激元波的增强作用，突破了拉曼散射信号强度弱的缺点，使得利用拉曼散射进行物质分析检测从理论上的可能上升为实际操作中的可行。SERS能够提供丰富的光谱信息，提高检测灵敏度，克服了荧光成像中存在的光漂白、光淬灭等问题，目前已成功应用于物质结构分析、生物化学检测、环境污染监测、食品安全等领域。
目前广泛应用的二维码高通量生物检测系统，存在结构复杂、操作繁琐、信息量不足的等缺点。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术不足，本发明提供一种基于SERS微流平台的三维码生物检测芯片及制备、检测方法，实现对大量待测样品中的多个不同组分进行快速、高灵敏、自动化地定量分析检测。
技术方案：为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种基于SERS微流平台的三维码生物检测芯片，其特征在于：包括由下至上设置的由玻璃基底、生物识别分子和微流控通道构成的芯片结构以及SERS探针；所述生物识别分子以条状形式分布在玻璃基底上，与条状生物识别分子垂直的方向平行贴合排列多条微流控通道，所述微流控通道用于通入不同的待测样品以及SERS探针，通过采集SERS光谱对待测样品进行定量分析检测。一种基于SERS微流平台的三维码生物检测芯片的制备及检测方法，具体步骤如下：
(1)以金属纳米粒子为基底，在不同基底表面上标记不同的拉曼分子，并修饰有不同的生物识别分子，制备成用于识别不同组分的SERS探针；
(2)对玻璃基底进行表面处理，用微流直通道将不同的生物识别分子修饰在玻璃基底上，形成一维条形码基底；
(3)与步骤(2)中的一维条形码垂直方向平行贴合设置多条微流控通道，在每条微流控通道中通入不同的待测样品，待测样品中的待测分子被玻璃基底上的生物识别分子捕获，在空间上实现分离，从而以二维码阵列的形式分布于基底上；
(4)将SERS探针通入微流控通道，用拉曼光谱仪依次采集以二维码阵列形式分布的各单元的SERS光谱，得到三维码，通过对三维码进行解码即可识别待测样品中所含生物分子的种类并测得其含量。
发明首先借助于平行排列的微流控通道和生物识别分子(如抗体、适体等)将不同待测样品中的不同组分在空间上进行分离，形成二维的阵列结构。二维的阵列结构中X、Y坐标分别反应了待测样品的序号和不同的组分。然后，用SERS探针识别待测样品中的各个组分，通过采集每个坐标单元上的SERS光谱(第三维坐标信息)定量分析各组分的含量。
进一步的，所述金属纳米粒子为金核银壳纳米棒，其表面标记的拉曼分子为易于通过化学键插入或静电作用吸附到金属纳米粒子表面的拉曼标记物，修饰的生物识别分子为能够与待测样品特异性结合并能够通过化学键连接到金核银壳纳米棒表面的生物活性分子。
有益效果：本发明的优点如下：
1、本发明利用三维码解码的方法可同时读取不同样品中不同生物分子的含量，信息容量大；
2、本发明生物检测芯片制备和检测方法简单，适用范围广(可用于检测蛋白质、DNA、药物等)。
附图说明
附图1为本发明基于SERS微流平台的三维码生物检测芯片的结构示意图。
附图2为待测样品的三维码扫描结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
如附图1所示，一种基于SERS微流平台的三维码生物检测芯片，包括由下至上设置的玻璃基底、生物识别分子、微流控通道和SERS探针，所述生物识别分子以条状形式分布在玻璃基底上，与条状生物识别分子垂直的方向平行贴合排列多条微流控通道，在微流控通道中通入SERS探针，所述微流控通道用于通入不同的待测样品。
一种基于SERS微流平台的三维码生物检测芯片的制备及检测方法，具体步骤如下：
步骤(1)以金属纳米粒子为基底，在不同基底表面上标记不同的拉曼分子，并修饰有不同的生物识别分子，制备成用于识别不同组分的SERS探针；
步骤(2)对玻璃基底进行表面处理，用微流直通道将不同的生物识别分子修饰在玻璃基底上，形成一维条形码基底；
步骤(3)与步骤(2)中的一维条形码垂直方向平行贴合设置多条微流控通道，将待测样品通入微流控通道，待测样品中的待测分子被玻璃基底上的生物识别分子捕获，在空间上实现分离，从而以二维码阵列的形式分布于基底上；
步骤(4)将SERS探针通入微流控通道，用拉曼光谱仪依次采集以二维码阵列形式分布的各单元的SERS光谱，得到三维码，通过对三维码进行解码即可识别待测样品中所含生物分子的种类并测得其含量。发明首先借助于平行排列的微流控通道和生物识别分子(如抗体、适体等)将不同待测样品中的不同组分在空间上进行分离，形成二维的阵列结构。二维的阵列结构中X、Y坐标分别反应了待测样品的序号和不同的组分。然后，用SERS探针识别待测样品中的各个组分，通过采集每个坐标单元上的SERS光谱(第三维坐标信息)定量分析各组分的含量。附图2中柱形的高度代表SERS信号的强度，即定量分析待测样品得到的各组分的含量。
其中，所述金属纳米粒子为金核银壳纳米棒，其表面标记的拉曼分子为易于通过化学键插入或静电作用吸附到金属纳米粒子表面的拉曼标记物，修饰的生物识别分子为能够与待测样品特异性结合并能够通过化学键连接到金核银壳纳米棒表面的生物活性分子。
具体实施例：实施例1以金核银壳纳米棒为基底制备SERS探针，利用抗体与抗原之间的特异性反应，实现高通量的蛋白质检测。实施例2以金核银壳纳米棒为基底制备SERS探针，利用抗体与药物之间的特异性反应，实现高通量的药物筛选。
实施例1：以金核银壳纳米棒为基底制备SERS探针，利用抗体与抗原之间的特异性反应，实现高通量的蛋白质检测。
1)制备SERS探针。
首先制备金种子，室温下将2.5ml 0.2M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液与1.5ml1.0mM四氯金酸溶液混合，剧烈搅拌并加入0.6ml 0.01M冰镇的硼氢化钠溶液，2分钟后停止搅拌即得棕黄色的种子溶液。然后配制生长溶液，室温下在50ml 0.2M CTAB溶液中依次加入如下试剂：2～4ml 4mM硝酸银溶液，5ml 15mM四氯金酸溶液，45ml去离子水，缓慢搅拌均匀。随后加入1.5ml～3ml 0.08M抗坏血酸至溶液变为无色。最后加入1ml种子溶液，静置10～20min即得金纳米棒溶液。所得金纳米棒尺寸约15nm×45nm。
取上述溶液10ml离心清洗两次以除去表面的CTAB，分散回8-10ml水中，搅拌并依次加入0.4g CTAB，16-20mL去离子水，0.6mL 0.1M抗坏血酸，0.4-0.8mL硝酸银溶液，1.5mL 0.1M氢氧化钠，得到深红色溶液，离心一次，去除上清液并重新分散至8-10mL水中。
然后加入拉曼分子搅拌12h后，加入3ml 10mg/ml聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)，搅拌1h后，离心一次分散到10ml 5％戊二醛溶液中，搅拌1h后，离心一次分散到10ml水中加入0.1mL 1mg/mL抗体溶液，反应2h后离心清洗并加入0.1mL 1％牛血清蛋白，离心清洗并去除上清液并分散至1mL去离子水中。
2)玻璃片表面修饰抗体。
玻璃片置于现配的食人鱼溶液(98％的浓硫酸和30％的过氧化氢水溶液以体积比3:1混合)中，超声1h后用去离子水清洗，接着用氩气吹干并置于130℃的烘箱中1h。为了给基底的表面修饰上氨基，将玻璃片置浸泡在0.5％的聚乙烯二胺溶液中2h，清洗并吹干。同时，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流通道依次用75％乙醇溶液、去离子水、0.05％吐温20溶液清洗，并用去离子水冲洗烘干。然后，将PDMS通道与玻璃基底贴合在一起并在各独立通道中通入浓度为0.1mg/mL的不同抗体溶液，1h后将PDMS通道剥离并用1％牛血清蛋白溶液封闭30min，用去离子水清洗吹干，得到条形码形状的玻璃基底。
3)免疫反应
取另一片干净的PDMS微流控通道与步骤(2)中得到的固定有抗体的玻璃基底上贴合(与步骤(2)中微流直通道的方向垂直)。用注射器倒吸的方法将5μL SERS探针混合物(与待测生物分子对应的多种SERS探针等体积混合而成)、0.5μL清洗液、5μL待测样品依次装载到导管中，不同的液体用空气隔开。然后，用注射泵将导管中的液体依次通入微流控芯片中。每个样品分别装载在一个导管中，多个注射器同时使用检测不同待测样品。
4)三维码采集与解码
用拉曼光谱仪依次采集二维平面上各个单元的SERS光谱，得到三维码，通过对三维码进行解码即可测得每个待测样品中不同抗原(蛋白质)的含量。
实施例2：以金核银壳纳米棒为基底制备SERS探针，利用抗体与抗原之间的特异性反应，实现高通量的药物检测。：
1)制备SERS探针。
首先制备金种子，室温下将2.5ml 0.2M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液与1.5ml1.0mM四氯金酸溶液混合，剧烈搅拌并加入0.6ml 0.01M冰镇的硼氢化钠溶液，2分钟后停止搅拌即得棕黄色的种子溶液。然后配制生长溶液，室温下在50ml 0.2M CTAB溶液中依次加入如下试剂：2～4ml 4mM硝酸银溶液，5ml 15mM四氯金酸溶液，45ml去离子水，缓慢搅拌均匀。随后加入1.5ml～3ml 0.08M抗坏血酸至溶液变为无色。最后加入1ml种子溶液，静置10～20min即得金纳米棒溶液。所得金纳米棒尺寸约15nm×45nm。
取上述溶液10ml离心清洗两次以除去表面的CTAB，分散回8-10ml水中，搅拌并依次加入0.4g CTAB，16-20mL去离子水，0.6mL 0.1M抗坏血酸，0.4-0.8mL硝酸银溶液，1.5mL 0.1M氢氧化钠，得到深红色溶液，离心一次，去除上清液并重新分散至8-10mL水中。
然后加入拉曼分子搅拌12h后，加入3ml 10mg/ml聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)，搅拌1h后，离心一次分散到10ml 5％戊二醛溶液中，搅拌1h后，离心一次分散到10ml水中加入0.1mL 1mg/mL抗体溶液，反应2h后离心清洗并加入0.1mL 1％牛血清蛋白，离心清洗并去除上清液并分散至1mL去离子水中。
2)玻璃片表面修饰抗体。
玻璃片置于现配的食人鱼溶液(98％的浓硫酸和30％的过氧化氢水溶液以体积比3:1混合)中，超声1h后用去离子水清洗，接着用氩气吹干并置于130℃的烘箱中1h。为了给基底的表面修饰上氨基，将玻璃片置浸泡在0.5％的聚乙烯二胺溶液中2h，清洗并吹干。同时，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流通道依次用75％乙醇溶液、去离子水、0.05％吐温20溶液清洗，并用去离子水冲洗烘干。然后，将PDMS通道与玻璃基底贴合在一起并在各独立通道中通入浓度为0.1mg/mL的不同抗体溶液，1h后将PDMS通道剥离并用1％牛血清蛋白溶液封闭30min，用去离子水清洗吹干，得到条形码形状的玻璃基底。
3)免疫反应
取另一片干净的PDMS微流控通道与步骤(2)中得到的固定有抗体的玻璃基底上贴合(与步骤(2)中微流直通道的方向垂直)。用注射器倒吸的方法将5μL SERS探针混合物(与待测生物分子对应的多种SERS探针等体积混合而成)、0.5μL清洗液、5μL样品依次装载到导管中，不同的液体用空气隔开。然后，用注射泵将导管中的液体依次通入微流控芯片中。每个待测样品分别装载在一个导管中，多个注射器同时使用检测不同待测样品。
4)三维码采集与解码
用拉曼光谱仪依次采集二维平面上各个单元的SERS光谱，得到三维码，通过对三维码进行解码即可测得每个待测样品中不同药物的含量。
三维码技术是一种新型的编码方式，相比于目前广泛使用的二维码，三维码具有更大的信息容量和更好的安全性，因而具有更广阔的应用前景。在高通量的蛋白质、DNA、药物筛选领域具有很好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种基于SERS微流平台的三维码生物检测芯片，其特征在于：包括由下至上设置的由玻璃基底、生物识别分子和微流控通道构成的芯片结构以及SERS探针；所述生物识别分子以条状形式分布在玻璃基底上，与条状生物识别分子垂直的方向平行贴合排列多条微流控通道，所述微流控通道用于通入不同的待测样品以及SERS探针，通过采集SERS光谱对待测样品进行定量分析检测。
2.一种基于SERS微流平台的三维码生物检测芯片的制备及检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)以金属纳米粒子为基底，在不同基底表面上标记不同的拉曼分子，并修饰有不同的生物识别分子，制备成用于识别不同组分的SERS探针；
(2)对玻璃基底进行表面处理，用微流直通道将不同的生物识别分子修饰在玻璃基底上，形成一维条形码基底；
(3)与步骤(2)中的一维条形码垂直方向平行贴合设置多条微流控通道，在每条微流控通道中通入不同的待测样品，待测样品中的待测分子被玻璃基底上的生物识别分子捕获，在空间上实现分离，从而以二维码阵列的形式分布于基底上；
(4)将SERS探针通入微流控通道，用拉曼光谱仪依次采集以二维码阵列形式分布的各单元的SERS光谱，得到三维码，通过对三维码进行解码即可识别待测样品中所含生物分子的种类并测得其含量。
3.根据权利要求2所述一种基于SERS微流平台的三维码生物检测芯片的制备及检测方法，其特征在于：所述金属纳米粒子为金核银壳纳米棒，其表面标记的拉曼分子为易于通过化学键插入或静电作用吸附到金属纳米粒子表面的拉曼标记物，修饰的生物识别分子为能够与待测样品特异性结合并能够通过化学键连接到金核银壳纳米棒表面的生物活性分子。
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