CN102183505A - 一种阵列型微流控表面增强拉曼散射专用检测芯片的分析系统 - Google Patents

Abstract

本发明研制一套可用于临床的、便携、快速多指标且价格相对低廉的阵列型微流控表面增强拉曼散射专用检测芯片分析系统。本项目设计制作阵列式微流控SERS检测芯片，对血清中多种肿瘤标志物进行表面增强拉曼光谱的同时检测，并建立多种肿瘤标志物的拉曼光谱图库，以模糊处理的方式进行特征数据检索，经过后续的实验验证和修正，建立一套稳定、高效的生物样品检测新方法。

Description

一种阵列型微流控表面增强拉曼散射专用检测芯片的分析系统

技术领域

本研究设计制作阵列型微流控表面增强拉曼散射专用检测芯片的分析系统，用于血清样品中多种肿瘤标志物的表面增强拉曼光谱研究，建立血清中多种肿瘤标志物分子的拉曼光谱库，并建立模糊检测模型，构建模型样机，验证其应用的准确性和可靠性，为进一步推广和应用建立基础。

背景技术

近年来出现的表面增强拉曼散射(SERS)技术，可使信号增强6～10个数量级。SERS标记免疫检测是一种将SERS与标记免疫学相结合，利用SERS的高灵敏度和光谱选择性，结合抗体抗原的特异反应作用而进行的纳米标记免疫分析技术。

SERS标记免疫技术是在生物免疫应答的基础上发展起来的，主要基于类似三明治结构的构建，基底上的固相抗体与标记抗体通过与抗原的结合形成“固相抗体一待测抗原一标记抗体”夹心复合物，通过对标记分子SERS信号的识别进行免疫分析。与其他标记免疫技术相比，它具有其独特的优越性，首先拉曼光谱峰宽度通常比其他光谱如荧光要窄10～100倍；其次拉曼散射受水的影响小；再次SERS信号很少受光致褪色的影响，所以可在一定程度上为获得较好的信号而适当地延长检测时间。另外SERS标记物不会发生自猝灭，可以通过增加标记抗体上标记物的数量来增强SERS信号，提高检测灵敏度，检出限可低达ng至pg，实现了高度特异性的SERS标记免疫检测。

目前研究的肿瘤标志物的特异性不高，每种标志物都有相应的假阳性病例。如果对多个肿瘤标志物进行同时检测，则可以避免假阳性。因为任何肿瘤都会有一种或多种肿瘤标志物发生改变，而不同或同种肿瘤的不同组织类型既可有共同的肿瘤标志物，也可有不同的肿瘤标志物。因此，选择多个特异度较高的肿瘤标志物联合测定，有利于提高检出的阳性率。

目前已经得到临床证实的多种肿瘤标志物，预计有上千种肿瘤标志物，本发明面向临床设计32x 32阵列SERS检测芯片，在设计的标志物上要比现有的多肿瘤标志物蛋白芯片检测仪(C12，12种肿瘤标志物)及正在研制的其他蛋白芯片检测仪高出一至两个数量级，在设计性能上，通过筛选多家肿瘤标志物抗体、控制检测试剂质量，并利用激光拉曼光谱独有的特异性，降低假阳性的检出率。

目前，市场上已经出现了商品化的蛋白芯片，如英国RANDOX公司的8种肿瘤标志的蛋白芯片，上海数康生物科技有限公司的多肿瘤标志物蛋白质芯片检测系统，其原理都是基于酶联免疫化学发光方法，检测过程中容易受到血清中复杂成分的干扰。本研究采用的SERS标记免疫方法，不仅可以检测血清中肿瘤标志物，还可以提供血清中其他常见成份的组成与结构信息，血清中的复杂物质不会掩盖待测物的SERS信号。

发明内容：

本发明研制一套可用于临床的、便携、快速多指标且价格相对低廉的阵列型微流控表面增强拉曼散射专用检测芯片分析系统。本项目设计制作阵列式微流控SERS检测芯片，对血清(也可包括其他体液，如腹水、胆汁、尿液等)中多种肿瘤标志物进行表面增强拉曼光谱的同时检测，并建立多种肿瘤标志物的拉曼光谱图库，以模糊处理的方式进行特征数据检索，经过后续的实验验证和修正，建立一套稳定、高效的生物样品检测新方法。

我们在以下四个方面取得创新性进展：

(1)实现多层多通道阵列的微流控芯片设计与制做，每个通道留有三个样品和试剂注入孔，以实现不同分子注入不同的检测试剂。

(2)在不同通道上偶联抗体后，通过分别注射对应抗原和抗原混合物，检测偶联不同方法制备的抗体后每个通道的表面增强拉曼散射信号响应的特异性，优化选择具有最佳信号响应的抗体。

(3)得到血清各种组分的拉曼光谱，建立基于本研究体系的表面增强拉曼散射光谱的特征分子谱图库。

(4)对血清中特征分子谱图库数据进行滤波与特征化标记，建立模糊检索模型，测试谱图检索与分析软件的适用性。

本研究基于表面增强拉曼光谱技术，在多个微流控通道内，建立SERS衬底或基底，设计与制作可以同时检测多种血清肿瘤标志物的微流控芯片，在芯片的每个通道的SERS衬底或基底上偶连不同的血清肿瘤标志物抗体，通过一次检测，同时得到多种血清肿瘤标志物的拉曼光谱信息。

一种阵列型微流控表面增强拉曼散射SERS专用检测芯片分析系统，其特征在于该系统包括下述步骤：

(1)制做具有多层结构、多通道阵列的微流控芯片，并在芯片的每个通道上进行不同的金属纳米材料一免疫标记，在芯片的封装前进行特异性SERS衬底的预处理。

(2)在步骤1制备好的微流控芯片上进行光刻，溅射金属薄膜，剥离反应区之外的金属；初步制作6*6点阵或10*10点阵或32*32点阵的反应区；进行分子自组装，在不同通道的SERS衬底或基底上偶联不同的肿瘤标志物抗体；其中上述金属薄膜为金或银，自组装分子采用巯基醇或巯基酸，抗体偶联采用NHS/EDC方法。

(3)测试每个通道的SERS信号响应，选取特异性的肿瘤标志物拉曼谱图。

(4)根据步骤3的检测结果，建立血清中多种肿瘤标志物的拉曼指纹图谱库，进行多变量分析，并建立模糊检索模型。

具体实施方式

1.1实验方法：

(1)通过计算机模拟设计多通道阵列式微流控芯片，模拟结果通过后，采用硅片上制做图案，进行PDMS烧铸，正胶光刻后，溅射金属层，剥离非图形区，在金属表面进行分子自组装，通过点样或通道上独立的溶剂通道，分别在每个通道上偶连不同的肿瘤标志物抗体(包括金属胶体连接抗体)。封装。

(2)向封装后的阵列芯片的每个通道分别注入其抗体对应的肿瘤标志物分子，检测SERS信号强度。

(3)将多种混合抗原分子同时注入各个通道，检测SERS响应信号的特异性。

(4)将普通血清与添加特征检测分子的血清注入各个通道，记录SERS响应信号。

(5)分析单一肿瘤标志物分子、多种混合肿瘤标志物分子、血清中特征分子的SERS光谱信号，建立SERS光谱数据库，编写光谱的模糊检索程序及应用软件界面。

1.2设计参数：

拉曼光谱焦斑：85um

点样直径：90-100um

点样用量：1nL

对于32x32阵列，需要图形面积为6.4mmx6.4mm。

盖玻片面积：20mmx20mm，点样直径设为90um时，可制做100x100的检测阵列。

1.3实验步骤：

(1)模拟、设计、制作多通道阵列式微流控芯片，并进行初步的抗体偶连实验；

(2)测试多通道阵列式微流控芯片的适用性，测试SERS信号响应；

(3)向试验结果理想的SERS微流控系统中注射模型血清样品，得到基于单个肿瘤标志物的血清样品SERS谱图；

(4)向微流控系统中注射血清样品，得到复杂体系下血清样品中肿瘤标志分子的光谱数据，并与模型血清样品进行比对和修正，建立拉曼光谱数据库，并重复相关实验，得到标准的多种肿瘤标志分子的SERS谱图数据库；

(5)对拉曼光谱数据库进行分析处理，编写模糊检索软件，并与临床医院合作，验征模型的准确性和可行性。

Claims (1)

1.一种阵列型微流控表面增强拉曼散射SERS专用检测芯片分析系统，其特征在于该系统包括下述步骤：

(1)制做具有多层结构、多通道阵列的微流控芯片，并在芯片的每个通道上进行不同的金属纳米材料-免疫标记，在芯片的封装前进行特异性SERS衬底的预处理。

(2)在步骤1制备好的微流控芯片上进行光刻，溅射金属薄膜，剥离反应区之外的金属；初步制作6*6点阵或10*10点阵或32*32点阵的反应区；进行分子自组装，在不同通道的SERS衬底上偶联不同的肿瘤标志物抗体；其中上述金属薄膜为金或银，自组装分子采用巯基醇或巯基酸，抗体偶联采用NHS/EDC方法。

(3)测试每个通道的SERS信号响应，选取特异性的肿瘤标志物拉曼谱图。

(4)根据步骤3的检测结果，建立血清中多种肿瘤标志物的拉曼指纹图谱库，进行多变量分析，并建立模糊检索模型。