CN111721751A - 一种检测结直肠恶性肿瘤的装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测肿瘤的装置，所述装置包括：1)基于次黄嘌呤拉曼光谱特征峰的机器学习预测模型；2)用于肿瘤检测的表面增强拉曼光谱数据。本发明次黄嘌呤拉曼光谱特征峰在快速检测肿瘤中的应用，能够便捷并且快速的筛查患者是否患有肿瘤，整个流程简单方便，避免了传统技术复杂且难度高的检测流程，大大提高肿瘤早期发现的几率，有助于肿瘤患者提高救治成功几率。
Description
技术领域
本发明涉及灵敏检测分析领域，具体涉及一种检测结直肠恶性肿瘤的装置。
背景技术
结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。由于其早期症状不明显，经常会被误诊，误诊率高达30％，致使大多数人发现存在异常的时候都已是晚期，从而导致现有情况检测发现的结直肠癌症患者大多为晚期。现有技术对结直肠癌的检测诸如肠镜检测、粪便检测等，不仅检测流程繁杂难度高，对患者来说也是十分麻烦的。因此，亟需一种能够便捷快速早期诊断结直肠癌的方法。
“咖啡环效应”即液滴干燥过程中由于液滴内部的流体力学、表面张力、蒸发、扩散以及毛细力等诸多因素综合作用下导致悬浮在其中的胶体颗粒沉积成环形。1997年芝加哥大学的Deegan等人最先阐述了“咖啡环”的形成机制，他们认为，液滴三相接触线钉扎及液滴不均匀蒸发引起的向外的毛细流动是导致液滴中的不溶性悬浮颗粒在边缘处沉积成环的原因，而正通过这种“咖啡环效应”，不仅导致了悬浮颗粒在液滴边缘处集中成浓缩环，也使血清中的更多分子通过表面张力梯度驱动的流动集中在金纳米颗粒(AuNP)聚集体上，从而产生更加突出和稳定的拉曼信号。
表面增强拉曼法光谱(Surface enhanced Raman spectra,SERS)是一种高灵敏的分析检测技术，是开发快速且易于使用的诊断工具，可用于即时护理或筛查测试中的生物流体，由于其具备独特的振动指纹以及光谱窄线宽的特性，这种检测技术已经成功应用于复杂体系中多个分析物的检测，特别是血清和血浆的无标记SERS光谱，可用作生物标志物发现的代谢指纹方法。然而，传统的SERS存在一定的局限性，并且针对生物的待测样品存在多种选择，诸如血浆、血清或其他添加剂等，使得生物类型的SERS检测面临挑战，如SERS样品选择与基底制作、SERS信号的非均匀性、SERS信号的可重复性等等。针对生物血液待测样品的选择，文献(Alois Bonifacio,Surface-enhanced Raman spectroscopy of bloodplasma and serum using Ag and Au nanoparticles:a systematic study.Analyticaland bioanalytical chemistry,2014,406(9/10):2355-2365.)指出，血液中血清蛋白质阻止了表面增强，只有当从样品中滤出蛋白质时才能快速获得强烈且可重复的光谱，同时也指出，过滤的血清或肝素血浆为优选样品，特别的，常见的血浆抗凝剂EDTA和柠檬酸盐会干扰SERS光谱，这使得利用SERS光谱检测肿瘤具有很大的局限性，难以被推广应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种检测肿瘤的装置，所述装置包括：
1)拉曼光谱分析仪，用于表面增强拉曼光谱数据的采集；
2)分析表面增强拉曼光谱数据的分析装置：
所述分析装置内置数据输入端口，用于接收前述检测装置的检测结果；
所述分析装置内置次黄嘌呤的机器学习模型，用于检测是否有肿瘤。
进一步地，所述肿瘤是结直肠恶性肿瘤。
进一步地，所述机器学习预测模型通过LASSO+预测模型构建。
更进一步地，所述LASSO+预测模型是200-300个健康和肿瘤患者的表面增强拉曼光谱数据，通过LASSO+支持向量机或LASSO+随机森林方法计算得到基于次黄嘌呤特征峰值的预测模型。
更进一步地，所述次黄嘌呤特征峰在波数725cm-1处。
进一步地，所述表面增强拉曼光谱数据的采集，具体包括如下步骤：
a、取贵金属纳米溶胶，加入待测物，混合至形成具有强近场增强效应的纳米颗粒簇；
b、将步骤a所得混合溶液滴于亲水性基底上，干燥，用拉曼光谱仪测量、校正待测物的拉曼光谱信号，即得。
更进一步地，步骤a所述贵金属纳米溶胶与待测物的体积比为0.5～1.5：1，优选1：1。
更进一步地，所述贵金属纳米溶胶是经柠檬酸根稳定的贵金属纳米材料溶胶；所述贵金属纳米材料为金、银或铜的纳米球，纳米片，纳米棒，纳米花或纳米立方体，优选金纳米球，其直径10～100nm。
更进一步地，所述待测物为血浆、加入抗凝剂的血浆、过滤蛋白质后的血清中任意一种。
进一步地，步骤b所述校正是采用亲水性基底自身的特征峰作为内标进行校正，并去除信号背底噪声。
进一步地，所述亲水性基底是经空气等离子处理的面积为1～5cm2的石英片、硅片或载玻片；所述经空气等离子处理至混合溶液与基底的接触角为0～30°；所述石英片无自身的特征峰，硅片自身的特征峰520cm-1。
更进一步地，所述亲水性基底还包括醋酸纤维；所述亲水性基底为醋酸纤维时，混合溶液滴于其上，直接用拉曼光谱仪测量采集信号。
进一步地，步骤b所述干燥为真空干燥，真空度10～1000Pa，温度35℃，所述真空干燥至溶液边缘形成致密的环状沉积物的多层次区域结构。
进一步地，步骤b所述拉曼光谱仪测量温度为20～30℃，激发波长为532nm，633nm或785nm。
本发明还提供了一种前述的装置在制备检测结直肠恶性肿瘤装置中的用途。
本发明相对现有技术具有如下有益效果：
本发明一种检测肿瘤的装置，能够便捷并且快速的筛查患者是否患有肿瘤，整个流程简单方便，避免了传统技术复杂且难度高的检测流程，大大提高肿瘤早期发现的几率，有助于肿瘤患者提高救治成功机率。
本发明通过采用LASSO+支持向量机或LASSO+随机森林的预测模型，可以达到80％以上的精度和灵敏度。此外，将血液测试中SERS和癌胚抗原参数的组合可以将模型预测准确性和灵敏度提高到90％以上，提高了样品检测结果的准确性。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1试验例1中真空干燥处理的基底显微区域图(图分为A-D 4个区域)
图2试验例1中A-D 4个区域分别的拉曼光谱图
图3试验例1中纯金纳米颗粒团聚体的SERS光谱和从带有金纳米颗粒的血清样品获取的常规SERS光谱。
图4试验例1结直肠癌患者与某健康人的表面增强拉曼光谱。
图5试验例1基于表面增强拉曼光谱数据的机器学习分类判别AUC图(A:次黄嘌呤-随机森林模型；B,次黄嘌呤-支持向量机模型)
具体实施方式
实施例1本发明装置检测肿瘤
1)构建机器学习预测模型
a、将200-300个健康和肿瘤患者的SERS光谱数据中的725cm-1峰位处的次黄嘌呤信号值，用支持向量机或随机森林方法构建LASSO+预测模型，
具体步骤为：将次黄嘌呤特征峰，以R软件包“e1071”构建支持向量机模型，或：以R软件包“RandomForest”构建随机森林模型；
b、将200-300个健康和肿瘤患者的SERS光谱数据中的725cm-1信号值，与受试者血清检验癌胚抗原水平建立数据矩阵；
c、将步骤b的数据矩阵带入步骤a的支持向量机模型或随机森林模型中，得机器学习预测模型；
2)采集待诊断患者血浆中的SERS光谱数据，用构建的机器学习预测模型对其进行运算，最终通过模型输出的结果判定是否患癌；
其中，SERS光谱数据的采集方法为：
a、在20μl浓缩后的直径10～100nm的金纳米球溶胶中，加入20μl待测人员血浆进行剧烈震荡，使金纳米球与待测物充分混合，聚集以形成具有强近场增强效应的贵金属局域等离子体结构；
b、将步骤a的混合溶液用移液枪垂直滴至于面积为5cm2的石英片上(石英片是需经等离子体机(220V,40kHz,150W,PT-5S,Sanhe BoDa)空气等离子处理10分钟，以达到待测混合溶液与石英的接触角为0～30°之间)，置于真空烘箱真空度10～1000Pa，温度35℃处理1小时，形成咖啡环效应的多层次区域结构；
c、将步骤b石英片置于拉曼光谱仪下温度为25℃，采用激发波长为532nm,633nm或785nm的入射光进行检测，显微镜对焦于多层次区域结构边缘的区域，即可得到待测物的SERS光谱数据，并去除信号背底噪声，即得。
实施例2本发明装置检测肿瘤
1)构建机器学习预测模型
a、将200-300个健康和肿瘤患者的SERS光谱数据中的725cm-1峰位处的次黄嘌呤信号值，用支持向量机或随机森林方法构建LASSO+预测模型，
具体步骤为：将次黄嘌呤特征峰，以R软件包“e1071”构建支持向量机模型，或：以R软件包“RandomForest”构建随机森林模型；
b、将200-300个健康和肿瘤患者的SERS光谱数据中的725cm-1信号值，与受试者血清检验癌胚抗原水平建立数据矩阵；
c、将步骤b的数据矩阵带入步骤a的支持向量机模型或随机森林模型中，得机器学习预测模型；
2)采集待诊断患者血浆中的SERS光谱数据，用构建的机器学习预测模型对其进行运算，最终通过模型输出的结果判定是否患癌；
其中，SERS光谱数据的采集方法为：
a、在20μl浓缩后的直径10～100nm的金纳米球溶胶中，加入20μl待测人员血浆进行剧烈震荡，使金纳米球与待测物充分混合，聚集以形成具有强近场增强效应的贵金属局域等离子体结构；
b、将步骤a的混合溶液用移液枪垂直滴至于醋酸纤维上，并在醋酸纤维中快速扩散。
c、将步骤b醋酸纤维置于拉曼光谱仪下进行检测(采用激发波长为532nm,633nm或785nm的入射光进行检测)，显微镜主要对焦于混合溶液在醋酸纤维扩散的边缘区域，即可得到待测物的SERS光谱数据，去除信号背底噪声，即得。
实施例3本发明装置检测肿瘤
1)构建机器学习预测模型
a、将200-300个健康和肿瘤患者的SERS光谱数据中的725cm-1峰位处的次黄嘌呤信号值，用支持向量机或随机森林方法构建LASSO+预测模型，
具体步骤为：将次黄嘌呤特征峰，以R软件包“e1071”构建支持向量机模型，或：以R软件包“RandomForest”构建随机森林模型；
b、将200-300个健康和肿瘤患者的SERS光谱数据中的725cm-1信号值，与受试者血清检验癌胚抗原水平建立数据矩阵；
c、将步骤b的数据矩阵带入步骤a的支持向量机模型或随机森林模型中，得机器学习预测模型；
2)采集待诊断患者血浆中的SERS光谱数据，提取其中次黄嘌呤特征峰信息，用构建的机器学习预测模型对其进行运算，最终通过模型输出的结果判定是否患癌；
其中，SERS光谱数据的采集方法为：
a、在20μl浓缩后的直径10～100nm的金纳米球溶胶中，加入20μl待测人员血浆进行剧烈震荡，使金纳米球与待测物充分混合，聚集以形成具有强近场增强效应的贵金属局域等离子体结构；
b、将步骤a的混合溶液用移液枪垂直滴至于面积为5cm2的硅片上(硅片是需经等离子体机(220V,40kHz,150W,PT-5S,Sanhe BoDa)空气等离子处理10分钟，以达到待测混合溶液与硅片的接触角为0～30°之间)，置于真空烘箱真空度10～1000Pa，温度35℃处理1小时，形成咖啡环效应的多层次区域结构；
c、将步骤b硅片置于拉曼光谱仪下温度为30℃，采用激发波长为532nm，633nm或785nm的入射光进行检测，显微镜主要对焦于多层次区域结构边缘的区域，即可得到待测物的SERS特征指纹信号，并使用硅片的特征峰520cm-1作为内标对待测物的拉曼光谱信号进行校正，即得。
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果：
试验例1本发明检测装置的构建和验证
一.临床资料
选取结直肠恶性肿瘤患者132例，健康对照88例，基本信息见表1。
表1临床结直肠恶性肿瘤患者基本信息
注：结直肠恶性肿瘤患者均为活检病理确诊患者，健康对照者无相应症状及病史。
前述表1中，随机选择70％样本用于检测模型构建(训练集)，30％样本用于模型准确性验证(测试集)，将测试集数据代入检测模型中获得预测结果，并与实际病理诊断结果进行对比，以受试者特性曲线(ROC曲线)对模型的诊断效能进行评价。
二、检测装置的构建
1、采集SERS光谱数据
a、取待测人员血浆，将其加入20μl浓缩后的直径10～100nm的金纳米球溶胶中，剧烈震荡，使金纳米球与待测物充分混合，聚集以形成具有强近场增强效应的贵金属局域等离子体结构；
b、将步骤a的混合溶液用移液枪垂直滴至于面积为5cm2的石英片上(石英片是需经等离子体机(220V,40kHz,150W,PT-5S,Sanhe BoDa)空气等离子处理10分钟，以达到待测混合溶液与石英的接触角为0～30°之间)，置于真空烘箱真空度10～1000Pa，温度35℃处理1小时，形成咖啡环效应的多层次区域结构(图1)；
c、将步骤b石英片置于拉曼光谱仪下温度为25℃，采用激发波长为532nm,633nm或785nm的入射光进行检测(图2～4)，显微镜对焦于多层次区域结构边缘的区域，即可得到待测物的SERS光谱数据，并去除信号背底噪声，即得；
2、利用LASSO+支持向量机或LASSO+随机森林方法构建LASSO+预测模型
将步骤1中所采集训练集受试者SERS光谱数据(400cm-1-1800cm-1)中的725cm-1峰位处的次黄嘌呤信号值(该特征峰值是通过LASSO回归运算获得)，以R软件包“e1071”构建支持向量机模型，或：以R软件包“RandomForest”构建随机森林模型，即得LASSO+预测模型；
3、构建次黄嘌呤和癌胚抗原参数组合的机器学习模型
a.将步骤1中所测得SERS光谱数据中725cm-1信号值，与受试者血清检验癌胚抗原水平(用全自动电化学发光免疫分析系统，罗氏检测)进行数据整合，将血清癌胚抗原水平作为变量之一纳入数据矩阵中；
b.将步骤a的数据矩阵带入步骤2建立的支持向量机模型或随机森林模型中构建预测次黄嘌呤-癌胚抗原预测模型，即得。
4.结果判断方法：
a.取70％受试者样本，按照前述步骤1的方法采集SERS光谱数据，通过步骤2和3构建次黄嘌呤和癌胚抗原参数组合的机器学习模型；
b.将剩余30％受试者样本以步骤1方法进行检测，获取所需血清SERS光谱数据，并带入步骤a中构建的预测模型进行运算，所获检测结果若输出结果为0，则判定待检样本健康，若输出结果为1，判定待测样本患结直肠恶性肿瘤。
三、模型准确性验证
1、验证方法
实验方法：取待检样本，按照步骤二中的步骤1进行检测和数据处理，输入步骤二中的步骤3构建的机器学习模型。
判定方法：以病理活检结果作为检测金标准，与构建诊断模型的预测结果进行对比，并绘制受试者特性曲线(ROC曲线)，判定准确性以ROC曲线下面积(AUC)评估，AUC越接近1说明模型准确性越高。
2、验证结果
次黄嘌呤-随机森林模型验证结果ROC曲线图见图5A，实际数据结果见表2。
表2次黄嘌呤-随机森林模型验证实际结果
次黄嘌呤-支持向量机模型验证结果ROC曲线图见图5B，实际数据结果见表3。
表3次黄嘌呤-支持向量机模型验证实际结果
从表2、3及图5可见，在本例中共58名受试者，其中33例为结直肠癌患者，25例为正常对照，机器学习模型判断结果所示：次黄嘌呤-随机森林模型(表2，图5A)正确判定了30例结直肠癌患者，17例健康对照，判定准确率为：81％，诊断敏感度：90.9％，诊断特异度：68％，阳性预测值：78.9％，阴性预测值：89.4％。受试者特性曲线下面积为：0.828。次黄嘌呤-支持向量机模型(表2，图5B)正确判定了29例结直肠癌患者，22例健康对照，判定准确率为：87.9％，诊断敏感度：87.8％，诊断特异度：88％，阳性预测值：90.6％，阴性预测值：84.6％。受试者特性曲线下面积为：0.874。数据验证结果显示，次黄嘌呤-随机森林模型与次黄嘌呤-支持向量机模型均能对结直肠癌患者和健康对照者进行良好判别分类。
综上，本发明检测肿瘤的装置，能够便捷并且快速的筛查患者是否患有肿瘤，整个流程简单方便，避免了传统技术复杂且难度高的检测流程，大大提高肿瘤早期发现的几率，有助于肿瘤患者提高救治成功机率。
Claims (10)
1.一种检测肿瘤的装置，其特征在于：所述装置包括：
1)拉曼光谱分析仪，用于表面增强拉曼光谱数据的采集；
2)分析表面增强拉曼光谱数据的分析装置；
所述分析装置内置数据输入端口，用于接收前述检测装置的检测结果；
所述分析装置内置次黄嘌呤的机器学习模型，用于检测是否患有肿瘤。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述肿瘤是结直肠恶性肿瘤。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述机器学习预测模型通过LASSO+预测模型构建。
4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于：所述LASSO+预测模型是200-300个健康和肿瘤患者的表面增强拉曼光谱数据，通过LASSO+支持向量机或LASSO+随机森林方法计算得到的基于次黄嘌呤特征峰值的预测模型。
5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于：所述次黄嘌呤特征峰在波数725cm-1处。
6.根据权利要求1或4所述的装置，其特征在于：所述表面增强拉曼光谱数据的采集，具体包括如下步骤：
a取贵金属纳米溶胶，加入待测物，混合至形成具有强近场增强效应的纳米颗粒簇；
b将步骤a所得混合溶液滴于亲水性基底上，干燥，用拉曼光谱仪测量、校正待测物的拉曼光谱信号，即得。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于：步骤a所述贵金属纳米溶胶与待测物的体积比为0.5～1.5：1，优选1：1；所述贵金属纳米溶胶是经柠檬酸根稳定的贵金属纳米材料溶胶；所述贵金属纳米材料为金、银或铜的纳米球，纳米片，纳米棒，纳米花或纳米立方体，优选金纳米球，其直径10～100nm；所述待测物为血浆、加入抗凝剂的血浆、过滤蛋白质后的血清中任意一种。
8.根据权利要求6所述的装置，其特征在于：步骤b所述校正是采用亲水性基底自身的特征峰作为内标进行校正，并去除信号背底噪声；所述干燥为真空干燥，真空度10～1000Pa，温度35℃，真空干燥至溶液边缘形成致密的环状沉积物的多层次区域结构；所述拉曼光谱仪测量温度为20～30℃，激发波长为532nm，633nm或785nm。
9.根据权利要求6或8所述的装置，其特征在于：所述亲水性基底是经空气等离子处理至混合溶液与基底的接触角为0～30°的面积为1～5cm2的石英片、硅片或载玻片；所述石英片无自身的特征峰，硅片自身的特征峰520cm-1；和/或，所述亲水性基底还包括醋酸纤维，所述醋酸纤维无自身的特征峰；所述亲水性基底为醋酸纤维时，混合溶液滴于其上，直接用拉曼光谱仪测量采集信号。
10.权利要求1～9任意一项所述的装置在制备检测结直肠恶性肿瘤装置中的用途。
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