CN112946279A - 一种基于油水界面自组装的三明治sers免疫传感器检测宫颈癌患者血清生物标志物方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于油水界面自组装的三明治SERS免疫传感器检测宫颈癌患者血清生物标志物方法，本发明不但可以避免组织活检给病人带来的痛苦与负担，而且可以弥补常规检测方式中存在的不足，且不受到背景荧光的干扰，根据4‑ATP和DTNB特征峰的强度，即可同时对宫颈癌患者血清中SCCA和survivin进行定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于油水界面自组装的三明治SERS免疫传感器检测宫颈癌患者血清生物标志物方法，属于宫颈癌检测技术领域。
背景技术
宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一。据估计，全世界每年有57万妇女被诊断为宫颈癌。在发展中国家，宫颈癌是女性癌症相关死亡的最常见原因。尽管宫颈癌的化疗、放疗和手术治疗取得了很大进展，但宫颈癌的死亡率仍然很高。根据以往的研究，预防措施的改进可以在很大程度上预防宫颈癌的发生和死亡，早期筛查是其中尤为重要的一部分。此外，在低收入国家，只有约20％的妇女接受过宫颈癌筛查，而在高收入国家中这一比例超过60％，这与筛查的高成本密切相关。目前宫颈癌诊断方法主要包括液基薄层细胞检查、宫颈多点活检、醋酸白试验、人乳头瘤病毒检测、碘试验、宫颈巴氏涂片检测和阴道镜检查诊断宫颈癌。但是这些技术需要特殊设备和专门技术人员操作，检查价格昂贵，经济成本较高，从而限制了其在人群中的进一步推广使用。更为重要的是，这些技术属于侵入性检查，被检者检查时较为痛苦，恐惧心理较强，均难以作为宫颈癌人群的初筛手段在大规模人群中应用。因此，研究灵敏度高、特异性强、非侵入性的检查技术在宫颈癌的防治中具有重要的意义。
随着肿瘤分子学的快速发展，科学家发现在病变的早期，在肿瘤组织、血液，以及外周血中，包含各种生物分子，如DNA、microRNA、蛋白质、代谢产物等会随疾病的发生、发展而发生变化，因此也被称为肿瘤标志物。生物标志物来筛选和诊断肿瘤。其中蛋白组学的肿瘤标志物可以便捷地、无创地从血液，唾液和尿液中获得。鳞状细胞癌抗原(squamous cellcarcinoma antigen，SCCA)肿瘤相关抗原TA-4的亚型，是一种糖蛋白。鳞状上皮细胞癌抗原是最早用于诊断鳞癌的肿瘤标志物。可作为子宫颈癌、肺癌、头颈部癌的辅助诊断指标和预后监测指标。Survivin是凋亡抑制基因家族的一员，具有抑制细胞凋亡、调节细胞周期和促进细胞增殖的作用。据研究，SCCA和survivin在宫颈鳞癌中的表达显著增加，但在正常宫颈和慢性宫颈炎中很少表达。在过去的十年中，各种分析方法被应用于蛋白质类生物标记物的检测，包括酶联免疫吸附试验(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)、荧光分析等，这些检测方法用于SCCA和survivin的分析时均能取得较理想的结果。然而，这些技术要么灵敏度较低，要么需要复杂的程序，这在临床分析和实时检测中是一个不小问题。因此，有必要建立一种简单、高灵敏度的方法来检测临床血清样本中的SCCA和survivin。基于纳米材料的表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering，SERS)技术的出现为临床早期诊断的研究提供了新的途径，它在高检测灵敏度、无损数据采集和固有光谱指纹等方面具有独特的优势。SERS主要借助于纳米尺度的粗糙金属的表面达到増强检测信号的现象。当被检测物质接近具有増强效应的纳米材料时，拉曼散射可以增强到大约14个数量级。Zhou等人通过用一个pH灵敏的聚乙烯亚胺连接剂成功地合成了Fe3O4/Au簇/壳纳米颗粒，通过与SERS技术相结合来特异性的检测游离的前列腺特异性抗原。Ozaki等通过层层叠加将蛋白质组装在两层纳米材料之间，构架三明治结构，实现目标蛋白质的直接检测。Wachsmann-Hogiu等利用溉射方法将Ag和Cr沉积在纳米/微米材料表面，制备机械延展性良好的SERS増强基底，实现 6种不同蛋白质的直接检测。然而SERS真正走入临床应用仍存在一些不足，如金属纳米材料的SERS效应差；金属SERS基底价格昂贵，大大增加了检测的成本；而对于非金属基底(硅片、玻璃片等)，则需要进行复杂的修饰过程，并且修饰后也不能保证表面的氨基或者羧基均匀分布，信号的重现性差。
SERS信号的强弱直接与纳米粒子的形状、尺寸相关，因此纳米粒子的制备则是重要的基石。研究发现，各向异性井且具有尖锐边缘的纳米材料比那些对称的结构具有更好的SERS 效应。在相同的条件下，各向异性纳米材料的SERS增强效果比球形纳米颗粒的增强效果要好。在常见形状中，空心纳米材料比填充纳米材料具有更高的表面积而特别受关注，比如金银空心纳米壳(Au/Agalloyhollow nanoshell structures，Au/Ag AHNSs)。金银纳米箱 (Au/Agalloynanoboxes，Au/Ag ANBs)作为一种新型的纳米材料，具有独特的中空、多孔壁结构和良好的尺寸可调性，在生物医学领域具有广阔的应用前景。然而，用于SERS免疫分析的大多数捕获基板主要是在二维基板上制造的，例如玻片或硅片。由于它们的刚性，它们在固定大量纳米颗粒方面受到限制。聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为一种常用的聚硅氧烷，是一种惰性，无毒，不易燃，柔性和光学透明的弹性材料。基于PDMS的等离子体激元基底的SERS效率取决于附着于其上的纳米粒子的尺寸和形状，结合理想的纳米材料可以诱导强等离子体纳米结构的电磁场增强，成为高效SERS检测的理想平台，可达到单分子检测水平。将无序纳米颗粒排列成单层有序密排薄膜是提升SERS基底均一性的有效方法。用纳米技术将单颗粒组装成整体的方法丰富。Singh等通过斜角沉积(OAD)技术将均匀和大面积的倾斜银纳米柱膜沉积到PDMS上。Aksu等报道了在柔性和可折叠基底上进行纳米模板光刻技术(NSL)。然而这些技术通常需要复杂的操作过程，自组装技术因其简便易行而备受关注。液液界面自组装通常是有机相和水相形成两相界面，通过控制纳米单元的表面性质使其在两相界面聚集从而得到组装结构。液-液界面由于具有自下而上自组装成有序的二维和三维的纳米阵列正成为一种强大、无缺陷的平台。
拉曼光谱作为一种新型的无创检测方法，可以反映正常组织到癌变的恶性转化过程中的生化组成和结构的变化，不但可以避免组织活检给病人带来的痛苦与负担，而且可以弥补常规检测方式中存在的不足。然而，该项技术尚处于研究的初级阶段，其用于癌症筛查和诊断的标准尚未统一。且拉曼散射强度易受到背景荧光的干扰，因而在实际的样品检测中还存在一定的制约。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种基于油水界面自组装的三明治SERS 免疫传感器检测宫颈癌患者血清生物标志物方法。
本发明的技术方案如下：
一种基于油水界面自组装的三明治SERS免疫传感器检测宫颈癌患者血清生物标志物方法，其特征是，4-ATP与DTNB均通过Au-S键修饰在Au/AgAHNSs的表面，偶联抗体后形成两种SERS探针；其次，制备含有DMSA和不同浓度SCCA和survivin抗体分子的SERS 疫基底；当探针上的SCCA和survivin抗原分子和基底上的抗体进行特异性结舍，便检测到 4-ATP和DTNB的信号，并且强度的大小是受SCCA和survivin浓度的影响；根据4-ATP和 DTNB特征峰的强度即可同时对宫颈癌患者血清中SCCA和survivin进行定量检测。
具体包括以下步骤：
步骤1)血清标本的采集与处理：
将标本用1000rpm离心10min后，小心并彻底吸取上清液，保存于-80℃冰箱待测。
步骤2)Au/AgAHNSs的合成：
通过种子介导的生长途径合成了Au/Ag AHNSs；
将2mL AgNO3溶液和0.025g K2CO3置于烧瓶中以获得0.5mM的银种子溶液；
接着在剧烈搅拌下，将2mL制备好的THPC快速添加到银种子溶液中；彻底搅拌至少10min后，将0.5mL AA快速注入上述溶液中，溶液颜色从黄色变为蓝色；随后将获得的Au/AgAHNSs离心并重新分散到超纯水中，以去除生长过程中未反应的化学试剂；
将0.01g HAuCl4溶解于100mL水和5mL PVP溶液的混合物中制备0.5mM的HAuCl4溶液；将5mL上述溶液快速滴入银纳米壳溶液中，轻轻搅拌并继续反应2h，然后冷却至室温；通过离心收集产物，并用等量超纯水重新分散。
步骤3)Au/AgANBs的合成：
在空心金纳米笼的制备过程中，首先将90mLHAuCl4溶液加入20mL超纯水中；在750rpm搅拌5min后，接着加入340mL AgNO3，形成乳白色溶液；在强烈搅拌下5min后，向反应溶液中加入80mL AA；搅拌至溶液变成蓝色表明反应完全，合成了空心金纳米笼。
步骤4)Au/AgAHNSs SERS探针的制备：
首先，取制备好的Au/AgAHNSs 10mL，往里面加入50mL的4-ATP己醇溶液或50mL 的DTNB己醇溶液，揽拌反应2h，10000rpm离心10min，去上清后将沉淀的Au/AgAHNSs 再次分散在去离子水中；
然后，将20mL NHS/EDC PBS溶液滴入上述溶液中，在37℃的摇床中培养30min；接着分别加入5mL SCCA抗体溶液和5mL survivin抗体溶液，混合后在37℃反应2h；
最后，加入1mL的1％的BSA溶液进行封闭反应，其中BSA是溶于PBS缓沖液中的；在10000rpm离心10min后，去上清加入10mL的PBS缓冲液中，储存备用。
步骤5)Au/AgANBAs基底的制备：
选用培养皿制作PDMS透明基底，在使用前，先将培养皿置于超纯水、丙酮和乙醇中进行超声清洗，然后将15mL预聚物凝胶和2mL固化剂的混合物浇铸在培养皿表面上，之后把混合物在真空箱中放置30min，除去内部残留的的气泡，在50℃下烘烤1.5h，最后将 PDMS从主体上剥离并切成小块使用；
在培养皿中依次加入4mL Au/Ag ANBs胶体溶液和2mL正己烷，随后逐滴加入2mL乙醇，Au/Ag ANBs在油-水两相界面处自组装形成有金属光泽的单层金银纳米箱阵列；然后，PDMS结构浸入培养皿中，拾起在油-水界面处的单层Au/AgANBAs；随后，将制备好的Au/AgANBAs基底浸入到2mM的DMSA溶液中反应4h，用PBS缓冲液清洗掉未反应的DMSA；
加入含有20mL NHS/EDC的PBS溶液反应30min来活化DMSA表面的羧基集团，用PBS缓冲液进行清洗；将10mL的SCCA抗体和survivin抗体混合溶液添加到Au/Ag ANBAs 基底表面，然后在37℃下培养4h；用PBS缓冲液清洗掉未连接的抗体；最后，将基底浸入到1％的BSA溶液中进行封闭反应，用PBS缓冲液进行清洗；这样，就获得了Au/Ag ANBAs 基底。
步骤6)SCCA和survivin免疫反应测定的过程：
将获得的表面修饰不同浓度SCCA和survivin抗原分子的SERS基底分别浸入到含有 SERS探针的溶液中在37℃下反应4h，接着PBS缓冲液清洗掉未连接的探针，干燥后用于拉曼检测。
本发明不但可以避免组织活检给病人带来的痛苦与负担，而且可以弥补常规检测方式中存在的不足，且不受到背景荧光的干扰，根据4-ATP和DTNB特征峰强度的减弱即可同时对宫颈癌患者痰液中SCCA和survivin进行定量检测。
附图说明
图1：(a)4-ATP/DTNB标记的Au/AgAHNSs SERS探针的合成过程；(b)采用油水界面自组装Au/AgANBAs基底的制备；(c)SERS免疫分析平台同时检测SCCA和survivin；
图2：(a)Au/Ag AHNSs的TEM图像；(b)Au/Ag AHNSs的SEM图像；(c)Au/Ag AHNSs 的SAED模式；(d)Au/Ag AHNSs的HRTEM图像；Au/Ag AHNSs的Au(e)和Ag(f)元素对应的EDS成像；(g)Au/Ag AHNSs的紫外-可见-近红外吸收光谱；(h)两种拉曼信号分子和 SERS探针的SERS光谱；
图3：(a)Au/Ag ANBs的TEM图像；(b)Au/Ag ANBs的SEM图像；(c)Au/Ag ANBs 的SAED模式；(d)Au/AgANBs的HRTEM图像；Au/AgANBs的Au(e)和Ag(f)元素对应的EDS成像；(g)Au/AgANBs的紫外-可见-近红外吸收光谱。(h)两种拉曼信号分子和SERS 探针的SERS光谱；
图4：(a)Au/Ag ANBAs的SEM图像；(b)Au/AgANBAs的SEM截面图；(c)Au/AgANBAs 的FDTD模拟(平面)；(d)Au/AgANBAs的FDTD模拟(截面)；
图5：(a)4-ATP标记的SERS探针制备过程；(b)DTNB标记的SERS探针制备过程； (c)SERS基底制备过程；
图6：(a)Au/Ag ANBAs基底的AFM形貌图；(b)以DTNB在1327cm-1处特征峰到基线的积分峰面积进行mapping作图；(c)Au/Ag ANBAs基底上随机取6个点测量获得的SERS 光谱；(d)相应1327cm-1的特征峰的峰值统计；
图7：(a)吸附不同浓度DTNB的Au/Ag ANBAs衬底的SERS光谱；(b)在1327cm-1处SERS信号强度与DTNB浓度的对数的关系图；(c)放置1天、7天、14天和21天后的 Au/Ag ANBAs基底的SERS光谱图；(d)SERS光谱在1327cm-1处SERS信号的强度；
图8：(a)具有一系列蛋白质干扰的SERS信号的平均光谱；1081cm-1(b)和1327cm-1(c)处SERS强度直方图；(d)在10种独立物质上平行测量得到的SERS信号的平均光谱；1081cm-1(e)和1327cm-1(f)处SERS强度直方图；
图9：在PBS(a)和血清(b)中不同浓度的SCCA和survivin的SERS光谱；在PBS中，对数坐标下SCCA(c)或survivin(d)的剂量-强度曲线；在血清中，对数坐标下SCCA(e)或survivin(f)的剂量-强度曲线；
图10：(a)临床样品的SERS光谱；采用SERS免疫分析平台和ELISA分别检测样品中SCCA(b)和survivin(c)的浓度。
具体实施方式
一、一种基于油水界面自组装的三明治SERS免疫分析平台检测宫颈癌患者血清中SCCA 和survivin的方法
SERS免疫分析平台以及基于该平台来检测SCCA和survivin的设计原理如图1所示。如图1(a)所示，4-ATP与DTNB均通过Au-S键修饰在Au/AgAHNSs的表面，偶联抗体后形成两种SERS探针。其中，4-ATP与DTNB既是交联剂又是拉曼信号分子。其次，制备了含有DMSA和不同浓度SCCA和survivin抗体分子的SERS疫基底，此基底具有很好的SERS 增强效果。当探针上的SCCA和survivin抗原分子和基底上的抗体进行特异性结舍，便检测到4-ATP和DTNB的信号，并且强度的大小是受SCCA和survivin浓度的影响。根据4-ATP 和DTNB特征峰的强度即可同时对宫颈癌患者痰液中SCCA和survivin进行定量检测。
1、血清标本的采集与处理
实验所用血清样品由扬州大学临床医学院提供，样本提供者已签署知情同意书。血清标本分为5组，分别为30例慢性宫颈炎组、30例LSIL组、30例HSIL组和30例宫颈癌组。表1 总结了参加本研究的所有志愿者的详细情况。将标本用1000rpm离心10min后，小心并彻底吸取上清液，保存于-80℃冰箱待测。
表1纳入研究对象的基本特征
| 慢性宫颈炎 | LSIL | HSIL | 宫颈癌 | |
| 平均年龄(岁) | 25 | 33 | 44 | 54 |
| 例数 | 30 | 30 | 30 | 30 |
2、Au/AgAHNSs的合成
通过种子介导的生长途径合成了Au/Ag AHNSs。将2mL AgNO3溶液(1％)和0.025gK2CO3置于烧瓶中以获得0.5mM的银种子溶液。接着在剧烈搅拌下，将2mL制备好的THPC 快速添加到银种子溶液中。彻底搅拌至少10min后，将0.5mL AA(100mM)快速注入上述溶液中，溶液颜色从黄色变为蓝色。随后将获得的Au/Ag AHNSs离心(5000rpm，30min) 并重新分散到超纯水中，以去除生长过程中未反应的化学试剂。将0.01g HAuCl4溶解于100 mL水和5mLPVP溶液(1％)的混合物中制备0.5mM的HAuCl4溶液。将5mL上述溶液快速滴入银纳米壳溶液中，轻轻搅拌并继续反应2h，然后冷却至室温。通过离心(5000rpm，10min)收集产物，并用等量超纯水重新分散。
3、Au/AgANBs的合成
在空心金纳米笼的制备过程中，首先将90mLHAuCl4溶液(25mM)加入20mL超纯水中。在750rpm搅拌5min后，接着加入340mL AgNO3(6mM)，形成乳白色溶液。在强烈搅拌下5min后，向反应溶液中加入80mL AA(0.1M)。搅拌至溶液变成蓝色表明反应完全，合成了空心金纳米笼。
4、Au/AgAHNSs SERS探针的制备
制备SERS探针的过程如图1(a)所示包括Au/AgAHNSs表面拉曼信号分子的修饰，抗体分子的连接及BSA的包被。首先，取制备好的Au/AgAHNSs 10mL，往里面加入50mL的 4-ATP己醇溶液(10-3mol/L)或50mL的DTNB己醇溶液(10-5mol/L)，揽拌反应2h，10000 rpm离心10min，去上清后将沉淀的Au/AgAHNSs再次分散在去离子水中。然后，将20mL NHS/EDC(1:1，10mg/mL)PBS溶液滴入上述溶液中，在37℃的摇床中培养30min。接着分别加入5mL SCCA抗体溶液(0.2mg/mL)和5mL survivin抗体溶液(0.2mg/mL)，混合后在37℃反应2h。最后，加入1mL的1％的BSA溶液进行封闭反应，其中BSA是溶于PBS 缓沖液中的。在10000rpm离心10min后，去上清加入10mL的PBS缓冲液中，储存备用。
5、Au/AgANBAs基底的制备
Au/AgANBAs基底的制备的基本流程如图1(b)所示，选用培养皿制作PDMS透明基底，在使用前，先将培养皿置于超纯水、丙酮和乙醇中进行超声清洗，然后将15mL预聚物凝胶和2mL固化剂的混合物浇铸在培养皿表面上，之后把混合物在真空箱中放置30min，除去内部残留的的气泡，在50℃下烘烤1.5h，最后将PDMS从主体上剥离并切成小块使用。在培养皿中依次加入4mL Au/Ag ANBs胶体溶液和2mL正己烷，随后逐滴加入2mL乙醇， Au/Ag ANBs在油-水两相界面处自组装形成有金属光泽的单层金银纳米箱阵列(Au/Ag alloynanoboxes arrays，Au/Ag ANBAs)。然后，PDMS结构浸入培养皿中，拾起在油-水界面处的单层Au/AgANBAs。随后，将制备好的Au/Ag ANBAs基底浸入到2mM的DMSA溶液中反应4h，用PBS缓冲液清洗掉未反应的DMSA。加入含有20mL NHS/EDC(1:1，10mg/mL) 的PBS溶液反应30min来活化DMSA表面的羧基集团，用PBS缓冲液进行清洗。将10mL 的SCCA抗体和survivin抗体混合溶液(200mg/mL)添加到Au/Ag ANBAs基底表面，然后在37℃下培养4h。用PBS缓冲液清洗掉未连接的抗体。最后，将基底浸入到1％的BSA溶液中进行封闭反应，用PBS缓冲液进行清洗。这样，就获得了Au/Ag ANBAs基底。
6、SCCA和survivin免疫反应测定的过程
金纳米星免疫基底制备的基本流程如图1(c)所示，是将SERS探针和Au/AgANBAs基底结合在一起进行免疫反应测定的过程。将获得的表面修饰不同浓度SCCA和survivin抗原分子的SERS基底分别浸入到含有SERS探针的溶液中在37℃下反应4h，接着PBS缓冲液清洗掉未连接的探针，干燥后用于拉曼检测。
二、本发明的优势
1、Au/AgAHNSs的表征
图2(a)和图2(b)为Au/AgAHNSs的TEM照片和SEM照片。TEM照片显示Au/AgAHNSs 具有表面光滑的中空球形结构，其平均直径为22nm，壁厚为6.5nm。SEM照片显示 Au/AgAHNSs是具有亮边缘和暗中心的立体结构。Au/AgAHNSs的晶体结构由SAED照片(图 2(c))和HRTEM表征(图2(d))。SAED图案显示它们是多晶的，HRTEM显示尖端的晶面间距被测量为0.213nm。图2(e)和图2(f)显示了Au/AgAHNSs的能量色散X射线光谱(EDX) 成像。可以看出，Au/AgAHNSs主要由金元素组成，并含有少量银元素。从表征结果来看， Au/AgAHNSs是一种分布均匀的金银合金。图2(g)为Au/AgAHNSs的紫外-可见-近红外 (UV-vis-NIR)吸收光谱。Au/AgAHNSs在620nm左右显示出相对较宽但很强的LSPR吸收峰。插图中为Au/Ag AHNSs溶液的光学照片，可见其呈现浅蓝色。图2(h)显示，4-ATP标记的Au/AgAHNSs的特征峰位于1081cm-1和1586cm-1处，而DTNB标记的Au/AgAHNSs 的特征峰位于1074cm-1、1327cm-1和1554cm-1处。我们选择1081cm-1和1327cm-1处的特征峰分别代表4-ATP和DTNB。与信号分子微弱的拉曼信号相比，信号分子标记 Au/AgAHNSs的SERS信号明显增强。对Au/AgAHNSs的增强因子(EF)进行了研究，用以下方程式计：EF＝(ISERS/CSERS)/(IRS/CRS)。其中ISERS是Au/AgAHNSs在一定浓度 (CSERS)下获得的SERS信号强度，IRS是在非SERS条件一定的浓度(CRS)下获得的拉曼信号强度。在实验过程中，向Au/AgAHNSs胶体分散液液中加入相同浓度的4-ATP和DTNB 溶液(2×10-6M)以获得最终浓度为10-6M的溶液。通过计算得到4-ATP的EF值为5.388× 105，DTNB的EF值为4.521×105。
2、Au/Ag ANBs的表征
利用TEM和SEM对Au/Ag ANBs的形貌和尺寸进行了表征。在TEM图像中，Au/Ag ANBs的内部和外部之间存在明显的对比(图3(a))，表明内部为中空或多孔结构，其平均边长约为 60nm，壁厚为6.5nm。图3(b)表明使用上述合成方法制备出了大量且粒径均匀的侧壁多孔的 Au/Ag ANBs。通过HRTEM和SAED图像能够观察到Au/Ag ANBs的晶体结构。在图3(c)中，晶格间距为0.210nm和0.225nm的两个晶格条纹分别对应于(111)和(200)平面。单个Au/Ag ANBs的SAED图像清楚地表明，Au/Ag ANBs具有多晶性质。图3(d)中的几个衍射环分别代表Au/Ag ANBs晶体的(111)，(200)，(220)和(311)平面[41]。通过图3(e) 和图3(f)所代表的EDS成像图观察制备的Au/Ag ANBs元素分布情况，可以发现金元素和银元素都均匀地分布在Au/Ag ANBs结构中，Au/Ag ANBs主要由金元素组成，并含有少量的银元素。与Au/AgANBs内部相比，金元素和银元素在外壁上的信号明显增加，表明Au/Ag ANBs 具有中空结构。图3(g)显示了Au/Ag ANBs的UV-vis-NIR吸收光谱，分析结果显示，Au/Ag ANBs在671nm处表现出特征吸收峰，表明成功制备出了Au/Ag ANBs。插图显示了Au/Ag ANBs溶液的光学照片，其颜色为深蓝色。根据图3(h)中的拉曼光谱，4-ATP和DTNB的EF 分别计算为7.875×105和7.477×105。结果表明，Au/AgANBs具有良好的SERS增强效果。
3、FDTD模拟
为了研究Au/Ag ANBAs的SERS增强效果，使用FDTD模拟对其空间电场分布进行了研究。单层Au/Ag ANBAs的电场强度分布模拟是在X-Y平面上使用785nm入射光进行的，SERS强度大致等于电场的四次方(EF＝(E/E0)4)。图4(a)显示了单层Au/Ag ANBAs的SEM 图像，图4(b)为单层Au/Ag ANBAs阵列的SEM截面图。可以看出单层Au/Ag ANBAs均匀平铺在滤纸表面，Au/Ag ANBs之间的间隙约为0.34nm。由于单层Au/Ag ANBAs具有周期性，仿真模型选取了5×5的Au/Ag ANBs为研究对象。图4(c)和(d)为其相应的局部模拟电场分布。从图中可以发现，在单层Au/Ag ANBAs上，电场强度不是均匀分布的，强度最强的区域位于Au/AgANBs的衔接点和连接处。这些间隙中的电场强度远高于Au/Ag ANBs四角周围的电场强度。这是由于大量的自由电子聚集在Au/Ag ANBs之间，导致Au/Ag ANBs间隙中的增强电场远高于其他区域。由于Au/Ag ANBs不仅提高了热点的强度还提升了热点的密度，因此在SERS效应中起到了积极的作用。
4、SERS探针及其SERS基底制备过程的红外光谱表征
为了进一步验证纳米材料表面的修饰，红外光谱也被用来表征制备过程。图5(a)分别显示了Au/Ag AHNSs(蓝色)、Au/Ag AHNSs@4-ATP(紫色)和抗SCCA-1修饰的SERS探针(橙色)的红外光谱。无修饰的纳米材料没有明显的特征峰。1312cm-1、1587cm-1、1602 cm-1和2561cm-1处的特征峰分别归属于C-N伸缩振动、N-H酰胺伸缩振动、苯环中C＝C的伸缩振动和S-N伸缩振动。C-N和N-H键的存在表明抗SCCA-1成功地与Au/AgAHNSs@4-ATP结合。图5(b)给出了Au/Ag AHNSs(蓝色)、Au/Ag AHNSs@DTNB (紫色)和抗survivin-1修饰的SERS探针(橙色)的红外光谱。在DTNB对应的光谱中出现了C＝C的苯骨架振动的特征峰(1600cm-1处)，而在1129cm-1和1558cm-1处的峰分别属于C-N伸缩振动和N-H伸缩振动，只出现在抗survivin-1修饰的SERS探针的光谱中，这证明抗survivin-1与DTNB成功结合。图5(c)给出了Au/AgANBs(蓝色)、Au/AgANBs@DMSA (紫色)和抗SCCA-2及抗survivin-2修饰的Au/AgANBs(橙色)的红外光谱。其中1325cm-1处为C-N伸缩振动，1551cm-1处为N-H伸缩振动，1650cm-1处为C＝O伸缩振动，2547cm-1处为S-N伸缩振动，表明抗体成功修饰在Au/Ag ANBs上。综上所诉，红外光谱证明了SERS 标记和SERS基底已经被成功制备。
5、Au/Ag ANBAs基底的表征
SERS基底的均一性、灵敏度和稳定性是SERS检测的关键特性。图6(a)显示了Au/AgANBAs基底的AFM形貌图及SEM图像，从图中可以看出，单层的Au/Ag ANBAs分布均匀, 平均高度为62.3nm。为了探究Au/Ag ANBAs基底的均一性，我们将DTNB吸附在Au/Ag ANBAs基底表面，然后随机选取一个面积为40×40mm2的区域，以1327cm-1处的特征峰强度为研究对象进行拉曼成像。结果如图6(b)所示，可以看出SERS信号强度在扫描区域的均匀分布，说明Au/Ag ANBAs基底具有良好的均一性。然后如图6(c)所示，在指定区域随机选取6个点测量获得SERS光谱。1327cm-1处特征峰的的峰值强度的直方图(图6(d))证实了这些光谱的之间差异很小，RSD仅为8.328％。这表明Au/Ag ANBAs基底具有很好的均一性。
为了验证Au/Ag ANBAs基底的定量检测能力和SERS敏感性，以DTNB为信号分子进行评估。从图7(a)我们观察到，随着DTNB的浓度从100mM降低至100mM，SERS信号强度随之下降。当DTNB浓度降低至100mM时，仍能在SERS光谱上观察到较明显的特征峰。图7(b)显示了1327cm-1处的特征峰强度与DTNB浓度对数之间的线性关系，回归方程为y＝1744.651x+19675.349，相关系数为0.992。可以发现，特征峰强度与信号分子的浓度对数呈现很好的线性关系，即表明在一定条件下，Au/Ag ANBAs基底可以通过评估信号强度对待测物进行定量检测。而且基于Au/Ag ANBAs的SERS基底具有良好的灵敏度，对DTNB 的最低检测浓度可达到5.278×10-12M。为了考察Au/Ag ANBAs基底的稳定性，比较了储存在 4℃环境下不同时间的Au/Ag ANBAs基底的SERS活性。我们将该基底在4℃环境中放置了 21天，分别于1天、7天、14天和21天对其进行SERS测量。研究结果如图7(c)所示，除信号强度减弱外，其峰值和波形均无明显变化。如图7(d)所示，以DTNB在1327cm-1处特征峰的信号强度为例，存储了21天的Au/Ag ANBAs基底的SERS信号强度与存储1天相比，下降至92.429％。说明Au/Ag ANBAs基底具有良好的稳定性。
6、选择性和再现性的表征
选择性和重现性是基于SERS的免疫分析平台的两个主要问题。为评价基于SERS的免疫分析平台的选择性，我们采用空白对照和相同浓度的不同蛋白(SCCA、survivin、CA125、 AFP和BSA)进行对照实验。如图8(a-c)所示，实验结果表明，SCCA和survivin的峰值强度明显高于于干扰剂和空白对照。同时检测SCCA和survivin时，该平台可以清晰地识别出两种拉曼信号分子。结果表明，该方法对SCCA和survivin具有较高的特异性。然后，通过10个不同批次的SERS平台，我们研究了用于评价SERS免疫分析平台性能的另一个关键因素——再现性，如图8(d)显示，这些SERS光谱几乎相同。图8(e)和8(f)分别显示出了十个独立实验中1081cm-1和1327cm-1处的特征峰强度。其相对应的RSD值分别为7.701％和6.943％，均小于20％。表明SERS传感器具有良好的分析重现性。信号重现性得到保障，说明该基底的制作过程高度可控。
7、基于SERS免疫分析平台的SCCA和survivin的定量检测
为了进一步研究SERS传感器是否能实现对实际样品的检测，将SCCA和survivin以不同浓度(10pg/mL-10mg/mL)分别加入PBS和血清中，利用SERS免疫分析平台进行定量检测。图9(a)和图9(b)表明，随着PBS和血清中SCCA和survivin浓度的降低，1081cm-1处和1327cm-1处的特征峰强度降低，这是因为SCCA和survivin浓度的降低会导致免疫复合物的形成减少。此外如图9(c-f)所示，分别绘制了1081cm-1和1327cm-1的特征峰强度与 SCCA和survivin浓度对数的函数，结果呈现出很好的线性关系。插图显示了校准曲线的线性回归方程和相应的R2值。SCCA和survivin在PBS中的LOD值分别为5.012pg/mL和3.981 pg/mL，SCCA和survivin在血清中的LOD值分别为5.889pg/mL和5.236pg/mL。上述结果表明该平台可以用来对痰液中痕量的SCCA和survivin进行定量分析，可以满足临床诊断的实际需要。
8、临床样本分析
为探究SERS传感器的准确性和临床应用价值，检测了慢性宫颈炎、LSIL、HSIL和宫颈癌患者血清中两种生物标志物的浓度。通过测定4-ATP和DTNB的SERS信号，分别监测SCCA和survivin的浓度。如图10(a)所示，这两种拉曼信号分子的SERS信号强度都随着病程而增加。为了评估该方法的精密度，用ELISA试剂盒对检测同样的临床样本进行了检测，图10(b)和图10(c)分别显示了通过采用SERS免疫分析平台和ELISA分别检测样品中 SCCA和survivin的浓度。每个临床样本中SCCA和survivin的实际浓度通过将SERS强度拟合到线性回归方程中来确定，表3显示了两种检测方法的具体数据及对应的RSD值。所有 RSD均小于20％，SERS免疫分析平台和ELISA方法对各组临床血清的检测结果具有一致性，证实了该SERS传感器在临床诊断中具有良好的准确性和潜在的应用前景。
表2.基于SERS免疫分析平台和ELISA对血清样品中SCCA和survivin的分析数据
Claims (8)
1.一种基于油水界面自组装的三明治SERS免疫传感器检测宫颈癌患者血清生物标志物方法，其特征是，4-ATP与DTNB均通过Au-S键修饰在Au/AgAHNSs的表面，偶联抗体后形成两种SERS探针；其次，制备含有DMSA和不同浓度SCCA和survivin抗体分子的SERS疫基底；当探针上的SCCA和survivin抗原分子和基底上的抗体进行特异性结舍，便检测到4-ATP和DTNB的信号，并且强度的大小是受SCCA和survivin浓度的影响；根据4-ATP和DTNB特征峰的强度即可同时对宫颈癌患者血清中SCCA和survivin进行定量检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于油水界面自组装的三明治SERS免疫传感器检测宫颈癌患者血清生物标志物方法，其特征是，具体包括以下步骤：
1)血清标本的采集与处理；
2)Au/AgAHNSs的合成；
3)Au/AgANBs的合成；
4)Au/AgAHNSs SERS探针的制备；
5)Au/AgANBAs基底的制备；
6)SCCA和survivin免疫反应测定的过程。
3.根据权利要求2所述的一种基于油水界面自组装的三明治SERS免疫传感器检测宫颈癌患者血清生物标志物方法，其特征是，所述步骤1)血清标本的采集与处理：将标本用1000rpm离心10min后，小心并彻底吸取上清液，保存于-80℃冰箱待测。
4.根据权利要求3所述的一种基于油水界面自组装的三明治SERS免疫传感器检测宫颈癌患者血清生物标志物方法，其特征是，所述步骤2)Au/AgAHNSs的合成：
通过种子介导的生长途径合成了Au/Ag AHNSs；
将2mL AgNO3溶液和0.025g K2CO3置于烧瓶中以获得0.5mM的银种子溶液；
接着在剧烈搅拌下，将2mL制备好的THPC快速添加到银种子溶液中；彻底搅拌至少10min后，将0.5mL AA快速注入上述溶液中，溶液颜色从黄色变为蓝色；随后将获得的Au/AgAHNSs离心并重新分散到超纯水中，以去除生长过程中未反应的化学试剂；
将0.01g HAuCl4溶解于100mL水和5mL PVP溶液的混合物中制备0.5mM的HAuCl4溶液；将5mL上述溶液快速滴入银纳米壳溶液中，轻轻搅拌并继续反应2h，然后冷却至室温；通过离心收集产物，并用等量超纯水重新分散。
5.根据权利要求4所述的一种基于油水界面自组装的三明治SERS免疫传感器检测宫颈癌患者血清生物标志物方法，其特征是，所述步骤3)Au/AgANBs的合成：
在空心金纳米笼的制备过程中，首先将90mLHAuCl4溶液加入20mL超纯水中；在750rpm搅拌5min后，接着加入340mL AgNO3，形成乳白色溶液；在强烈搅拌下5min后，向反应溶液中加入80mL AA；搅拌至溶液变成蓝色表明反应完全，合成了空心金纳米笼。
6.根据权利要求5所述的一种基于油水界面自组装的三明治SERS免疫传感器检测宫颈癌患者血清生物标志物方法，其特征是，所述步骤4)Au/AgAHNSs SERS探针的制备：
首先，取制备好的Au/AgAHNSs 10mL，往里面加入50mL的4-ATP己醇溶液或50mL的DTNB己醇溶液，揽拌反应2h，10000rpm离心10min，去上清后将沉淀的Au/AgAHNSs再次分散在去离子水中；
然后，将20mL NHS/EDC PBS溶液滴入上述溶液中，在37℃的摇床中培养30min；接着分别加入5mL SCCA抗体溶液和5mL survivin抗体溶液，混合后在37℃反应2h；
最后，加入1mL的1％的BSA溶液进行封闭反应，其中BSA是溶于PBS缓沖液中的；在10000rpm离心10min后，去上清加入10mL的PBS缓冲液中，储存备用。
7.根据权利要求6所述的一种基于油水界面自组装的三明治SERS免疫传感器检测宫颈癌患者血清生物标志物方法，其特征是，所述步骤5)Au/AgANBAs基底的制备：
选用培养皿制作PDMS透明基底，在使用前，先将培养皿置于超纯水、丙酮和乙醇中进行超声清洗，然后将15mL预聚物凝胶和2mL固化剂的混合物浇铸在培养皿表面上，之后把混合物在真空箱中放置30min，除去内部残留的的气泡，在50℃下烘烤1.5h，最后将PDMS从主体上剥离并切成小块使用；
在培养皿中依次加入4mL Au/Ag ANBs胶体溶液和2mL正己烷，随后逐滴加入2mL乙醇，Au/Ag ANBs在油-水两相界面处自组装形成有金属光泽的单层金银纳米箱阵列；然后，PDMS结构浸入培养皿中，拾起在油-水界面处的单层Au/AgANBAs；随后，将制备好的Au/Ag ANBAs基底浸入到2mM的DMSA溶液中反应4h，用PBS缓冲液清洗掉未反应的DMSA；
加入含有20mL NHS/EDC的PBS溶液反应30min来活化DMSA表面的羧基集团，用PBS缓冲液进行清洗；将10mL的SCCA抗体和survivin抗体混合溶液添加到Au/Ag ANBAs基底表面，然后在37℃下培养4h；用PBS缓冲液清洗掉未连接的抗体；最后，将基底浸入到1％的BSA溶液中进行封闭反应，用PBS缓冲液进行清洗；这样，就获得了Au/Ag ANBAs基底。
8.根据权利要求7所述的一种基于油水界面自组装的三明治SERS免疫传感器检测宫颈癌患者血清生物标志物方法，其特征是，所述步骤6)SCCA和survivin免疫反应测定的过程：
将获得的表面修饰不同浓度SCCA和survivin抗原分子的SERS基底分别浸入到含有SERS探针的溶液中在37℃下反应4h，接着PBS缓冲液清洗掉未连接的探针，干燥后用于拉曼检测。
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