CN115266852A - 一种基于纳米银花探针的电化学生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纳米银花探针的电化学生物传感器，使用具有电化学信号产生功能的抗体修饰的纳米银花作为探测待测蛋白的电化学探针。电极表面的捕获探针与纳米银花探针二者分别特异性结合于待测蛋白的不同位点，使传感器电极、待测蛋白、纳米银花探针组成的“三明治”结构结合于基底表面。该生物传感器依据纳米银花产生的电化学响应信号反映待测溶液中待测蛋白浓度，纳米银花较大的活性比表面积使得该生物传感器对待测蛋白具有极高的灵敏度和极低的检测限。
Description
技术领域
本发明涉及电化学检测技术领域，具体涉及一种基于纳米银花探针的电化学生物传感器。
背景技术
生物标志物作为机体活动的重要参与物，对生物体的生理学和病理学过程有重要的指示作用。常见的标志物有DNA、RNA、氨基酸、蛋白质、细胞等，这些标志物在机体内的含量变化与疾病进程有着密切的关系，在疾病预防、早期诊断、药效评估等方面具有广泛的应用。蛋白质作为组成细胞的有机物中含量最多的物质，在常见的标志物中，蛋白类标志物在数量上同样占据明显优势，因此针对蛋白质类标志物检测具有重要意义。
蛋白质不仅可以作为生命活动的承担者，且可以在不同的领域起到不同的作用。在医疗健康领域内，其可以作为某些疾病标志物，在机体内的含量变化与疾病进程有着密切关系。在环境监测领域中，某些生物产生的特定蛋白可以作为环境污染早期检测指标。在食品分析领域中，蛋白质的含量和结构，为人们摄取营养提供重要的参考依据。因此，针对特定蛋白质检测具有重要意义。
电化学传感器是基于待测物的电化学性质并将待测物的化学量转变成电学量进行传感检测的一种传感器。将其用于蛋白检测与传统方式相比，具有简易低耗、抗干扰能力强、高精度、分析速度快等优点。此外，在环境检测、食品分析、健康监测等领域，实现痕量蛋白分子的分析检验有重要意义。使用氧化还原物质如铁氰化钾、二茂铁衍生物等作为标记物的电化学传感器，因为其自身较差的导电性和单个探针较小的电化学活性面积，导致其有较低的灵敏度无法满足在环境监测、健康检测等领域所要求的痕量蛋白质检测。
因此，目前急需具有极高灵敏度的电化学生物传感器用以检测蛋白质类标志物。
发明内容
本发明根据现有技术的不足，提供了一种基于纳米银花探针的电化学生物传感器及其制备方法与应用。对纳米银花依次修饰功能化试剂与识别单元后，将其与传感器电极、待测蛋白形成“三明治”结构，依据具有丰富活性表面积的纳米银花在一定电压扫描范围内峰电流的数值变化可以测量待测蛋白的浓度。
不同浓度的待测蛋白结合在电极表面的量不同，进而使结合在电极表面的纳米银花的量不同，产生不同强度的电流响应，实现生物传感器能够响应一定范围浓度的待测蛋白的特性。
该传感器在传统的“夹心法”的基础上，将纳米银花作为电化学探针对待测蛋白进行定量监测，修饰于电极表面的识别单元和纳米银花探针二者存在不同的待测蛋白的特异性结合位点。在待测蛋白存在的情况下，传感器电极、待测蛋白、纳米银花三者形成“三明治”结构，两次特异性结合使该传感器能够特异性检测待测蛋白浓度。
本发明的技术方案：
一种基于纳米银花探针的电化学生物传感器，以纳米银花探针作为信号放大器，与传感器电极、待测蛋白形成“三明治”结构用以检测蛋白类生物标志物；
所述的纳米银花探针的制备过程如下：在纳米银花表面修饰4-氨基苯硫酚(4-ATP)用于提高纳米银花在水溶液中的稳定性，并作为中间连接体用于将识别单元连接到纳米银花表面，识别单元为可识别并结合待测蛋白的抗体或亲和肽；将牛血清白蛋白(BSA)与识别单元混合后通过戊二醛修饰于已修饰了4-ATP的纳米银花表面形成纳米银花探针，其目的是节约识别单元的成本的同时，BSA附着于纳米银花表面能够提高纳米银花探针的抗干扰性。
所述的纳米银花，其颗粒直径范围可以在0.1～5μm，同时具有丰富的纳米级微结构，能够产生较大的电化学响应。
使用时，将待测蛋白和所述纳米银花探针孵育在修饰了针对待测蛋白的捕获单元的电极表面并形成“三明治”结构，以银/氯化银作为参比电极对样品进行电化学测试，电极表面的捕获单元为可识别并结合待测蛋白的抗体或亲和肽，与纳米银花探针二者分别特异性结合于待测蛋白的不同位点。
本发明的有益效果：
本发明引入纳米银花作为电化学探针的核心用以制备电化学生物传感器，由于纳米银花极大的活性表面积以及较低的反应电位，产生极大电化学信号响应的同时可以有效避免其他物质带来的信号的干扰。该生物传感器在兼备极低检测限的同时对待测蛋白有较高的特异性，可进一步用于环境监测、食品分析等领域。
附图说明
图1是本发明实施例的纳米银花探针的结构示意图；
图2(a)和图2(b)是实施例中使用的纳米银花的SEM图；
图3是对照血清与待测蛋白梯度浓度的差分脉冲伏安图；
图4是待测蛋白浓度与峰电流的校准曲线。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权力书中所详细描述的本发明。
实施例1：纳米银花探针的制备
在示例性实施方式中，冰水浴条件下，在离心管中加入10mL超纯水，随后将1mL0.5M硝酸银溶液与0.1mL 0.1M柠檬酸酸钠溶液混合，并迅速加入0.5mL 1M抗坏血酸溶液，加入磁力搅拌子搅拌该体系，反应15min。
将反应后的混合溶液置于转速为13000rpm的离心机后，使用超纯水冲洗干净后在60℃干燥箱内干燥，得到纳米银花颗粒。如图2(a)和图2(b)所示，得到的纳米银花直径在3μm左右，兼备较好均一性的同时，具有丰富的活性微结构。
取10mg纳米银花，加入1mL乙醇溶液，并使用超声波细胞粉碎机进行超声30min。所述超声波细胞粉碎机配备2mm直径超声探头，功率设置为35％，超声工作时间为5s，间隙时间为5s。
取上述混合体系，加入0.5mL 0.2mM 4-ATP的乙醇溶液并超声30min，静置4h后，将混合溶液在13000rpm离心作用下取沉淀，并依次使用乙醇、超纯水冲洗干净。
将修饰了4-ATP的纳米银花加入到1mL水中，超声30min后，加入5％戊二醛溶液静置4h，将混合溶液在13000rpm离心作用下取沉淀，随后使用超纯水冲洗干净后加入1mL超纯水并超声30min。
取上述0.5mL混合溶液加入1mL牛血清白蛋白(BSA)与待测蛋白的识别单元混合溶液，其中二者质量比为100000：1，随后在4℃环境静置4h。所述的识别单元为特异性识别待测蛋白的抗体或多肽。
将混合溶液在13000rpm离心作用下取沉淀，使用超纯水冲洗干净后加入1mL超纯水并使用超声波细胞粉碎机进行超声30min后得到纳米银花探针。
实施例2：基于纳米银花的电化学生物传感器的制备及其应用
在示例性实施方式中，采用激光雕刻技术，以厚度为150μm的聚酰亚胺薄膜(PI)作为碳前体材料制备激光诱导石墨烯(LIG)电极，激光功率为16％，雕刻速度64mm/s，雕刻清晰度统一设置为100％。
将聚氯乙烯膜(PVC)、聚氨酯弹性体橡胶薄膜(TPU)、LIG电极、离型膜按顺序叠放，使用电烙铁对其进行烫压封装LIG电极，仅将工作电极暴露出来。
使用5mM 1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(PBASE)的DMF(N-N-二甲基甲酰胺)溶液孵育工作电极2h后分别用DMF、乙醇、超纯水冲洗干净。
使用3μL100μg/mL的针对待测蛋白的捕获单元溶液孵育工作电极2h后用超纯水冲洗干净。
使用1mg/mLBSA溶液孵育工作电极1h以封闭PBASE的非特异性结合位点。
滴加对照样血清以及一系列标准浓度梯度的待测蛋白溶液于LIG电极，孵育15min后用超纯水冲洗干净。
滴加3μL纳米银花探针溶液于LIG电极，孵育15min后用超纯水冲洗干净。
使用电化学工作站，以银/氯化银作为参比电极，控制电势在-0.2V～0.2V范围内对上述样品使用差分脉冲伏安法(DPV)进行扫描，得到一系列不同浓度的差分脉冲伏安图如图3所示。随着待测蛋白浓度的升高，传感器的电流响应有明显的上升，而测量对照样血清时传感器没有产生响应，说明该传感器具有较好的特异性。
在上述DPV测试中，待测蛋白浓度范围在1fg/mL和10pg/mL之间时，其对数与响应电流呈现良好的线性关系，如图4所示，线性方程为Ip＝0.51157lgC(Target)+0.75976，回归系数为0.98798，其实际检测限为1fg/mL。
Claims (2)
1.一种基于纳米银花探针的电化学生物传感器，其特征在于，所述的电化学生物传感器以纳米银花探针作为信号放大器，与传感器电极、待测蛋白形成“三明治”结构用以检测蛋白类生物标志物；
所述的纳米银花探针的制备过程如下：在纳米银花表面修饰4-氨基苯硫酚4-ATP用于提高纳米银花在水溶液中的稳定性，并作为中间连接体用于将识别单元连接到纳米银花表面，识别单元为可识别并结合待测蛋白的抗体或亲和肽；将牛血清白蛋白BSA与识别单元混合后通过戊二醛修饰于已修饰了4-ATP的纳米银花表面形成纳米银花探针。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米银花探针的电化学生物传感器，其特征在于，所述的纳米银花，其颗粒直径范围为0.1～5μm。
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-
2022
- 2022-07-27 CN CN202210890280.2A patent/CN115266852A/zh active Pending
Patent Citations (6)
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