CN104483481B - 一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼构建的膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼构建的膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼构建的膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器的制备方法及应用，属于新型功能材料、生物传感检测技术领域。碳纳米管/PdPt纳米笼复合材料具有比表面积大，生物相容性好，催化效率高等特点，可显著提高了免疫传感器的灵敏度和稳定性，该免疫传感器对膀胱癌的早期诊断及愈后判断具有重要的意义。

Description

一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼构建的膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼构建的膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用氨基化的多壁碳纳米管负载PdPt纳米笼，制备一种检测膀胱癌标志物-NMP22的夹心型电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
目前已有的肿瘤标志物的临床检测方法很多,如放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析等。但是这些检测方法具有很多缺点，如：具有放射性、耗时长、成本高、灵敏度低。因此本发明制备了一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼复合材料作为检测抗体标记物的简单、快速、灵敏度高和选择性高的电化学免疫传感器，实现了对膀胱癌标志物-NMP22的检测。
纳米材料因其优异的光学、热学、电学、力学以及化学性质，使其在生产、生活及科研中得到了广泛地应用。本发明利用纳米材料修饰传感器，利用其优异的物理化学性质，达到修饰传感器的目的。石墨烯纳米层具有大的比表面积，催化性能好，生物相容性好,增强电子传递等优点，因此本发明将氨基化石墨烯引入到电化学免疫传感器的制备中，利用其生物相容性以及大的比表面积，并且氨基能和捕获抗体更好的连接，这样实现捕获抗体在电极表面的固定；利用其优异的电子传递能力，起到增强电化学信号的作用。
 本发明采用碳纳米管/PdPt纳米笼复合材料来作为检测抗体标记物；这样构建了一种超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。碳纳米管/PdPt纳米笼复合材料对双氧水H2O2有良好的催化能力，并在检测过程中产生良好的电化学信号，有效地降低了传感器的检出限，可用于多种肿瘤标志物的分析。该方法具有制备过程简单、成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，有效克服了目前膀胱癌标志物-NMP22检测方法的不足。
发明内容
 本发明的目的之一是基于碳纳米管/PdPt纳米笼复合材料，构建了一种无酶、快速且超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。
 本发明的目的之二是将该夹心型电化学免疫传感器应用于膀胱癌标志物-NMP22的检测。
本发明的技术方案
1. 一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼构建的膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器的制备方法
（1） 将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV;
（2） 取6 μL、0.5~2 mg/mL的氨基化石墨烯的溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（3） 滴加3 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的混合液到电极表面，再继续滴加6 μL、5~10 μg/mL的膀胱癌标志物-NMP22捕获抗体，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度均为0.1 mol/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的体积比为1~ 4 : 1；
（4） 继续滴加3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液到电极表面，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
（5） 继续滴加6 μL、0.001~20 ng/mL的一系列不同浓度的膀胱癌标志物-NMP22溶液到电极表面，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
（6） 继续滴加4~6 μL检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液到电极表面，置于4 ℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼构建的膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器。
2. 氨基化石墨烯的制备
取0.05~1.5 g氧化石墨烯置于三口烧瓶中，加入0.1~3 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷和10 mL无水乙醇，加热到70 ℃并保持1.0~2.0 h，随后加入0.05~1.5 mL的80%的水合肼，在95℃下保持1 h，然后冷却到室温，所得混合物经洗涤、离心分离，、35~45℃下真空干燥，即制得氨基化石墨烯；
3．检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液的制备
（1）氨基化碳纳米管的制备
将20 mg的羧基化碳纳米管、2.5 mL的乙二胺、0.4 g环己基碳二亚胺放入三口烧瓶中，加热到120 ℃，保温96 h，然后冷却到室温，混合物经洗涤、离心分离、35~45℃下真空干燥，制得氨基化的碳纳米管；
（2）PdPt纳米笼的制备
分别称取80~100 mg聚乙烯吡咯烷酮，40~58 mg抗坏血酸，400~550 mg溴化钾溶于8 mL的超纯水中，在70~80 ℃下预热10 min后，加入50~57 mg氯亚钯酸钠，70~80 ℃油浴下回流3h，得到Pd立方体溶液；
分别称取30~33 mg聚乙烯吡咯烷酮，280~300 mg溴化钾和280~300 mg柠檬酸溶于7 mL水中，加入1 mL Pd立方体溶液，90 ℃下加热搅拌，随后加入28 mg氯亚钯酸钾，继续回流12 h，然后进行离心洗涤，制得PdPt纳米笼；
（3）检测抗体标记物碳纳米管/PdPt纳米笼的制备
将1~3 mg氨基化的碳纳米管与2 mL制得的PdPt纳米笼溶液混合，分离，在35 ℃下真空干燥，制得检测抗体标记物碳纳米管/PdPt纳米笼；
（4）检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液的制备
将1~3 mg 碳纳米管/PdPt纳米笼分散到1 mL超纯水中，加入100 μL、8~12 μg/mL的检测抗体溶液和900 μL、1/15 mol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，在4 ℃下振荡孵化12 h离心分离，取下层沉淀，再加入1 mL、1/15 mol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，取下层沉淀，最后加入1 mL、1/15 mol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，即制得检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液，4 ℃下保存备用。
4. 膀胱癌标志物-NMP22的检测
（1）采用三电极体系进行测定，将上述所制备的传感器作为工作电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于pH=7.4的PBS缓冲溶液中，采用时间-电流的方法进行扫描，输入电压为-0.4 V，运行时间400 s，记录电流变化；
（2）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL的1/15 mol/L、pH=7.4的PBS中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，然后记录电流变化，根据所得电流差值与膀胱癌标志物-NMP22的浓度成线性关系，绘制工作曲线；
（3）依据工作曲线，进行样品中膀胱癌标志物-NMP22的检测。
本发明采用计时电流法，实验表明，时间-电流的电流差值与膀胱癌标志物-NMP22的浓度在0.0010~20 ng/mL范围内线性关系良好，检测限达到0.21 pg/mL。
本发明的有益成果
（1）氨基化石墨烯与普通石墨烯相比较，其保留了石墨烯较大的表面积和较好的导电性，以及良好的生物相容性和稳定性，另外，其表面还有大量的氨基官能团，能够增加抗体在其表面的负载量和在水中的分散性，增加了传感器灵敏度和稳定性。
（2）将氨基化的多壁碳纳米管做为PdPt纳米笼的载体，能够使纳米笼分散的比较均匀，提高传感器的灵敏度，与普通的多壁碳纳米管相比，氨基化的多壁碳纳米管能够利用贵金属和氨基结合的配位键来结合更多的贵金属纳米笼，进而增加检测抗体的负载量。并且氨基化的多壁碳纳米管除了具有大的比表面积、良好的生物相容性和较好的导电性还具有良好的水溶性。
（3）将碳纳米管/PdPt纳米笼与膀胱癌标志物-NMP22检测抗体直接孵化，利用贵金属的生物相容性和较高的催化性能，实现对肿瘤标志物的高灵敏检测。在这种无酶的传感器中，避免了因酶的失活所带来的影响，对电化学传感器的重现性和稳定性起到很重要的作用。
（4）本发明制备的电化学免疫传感器用于膀胱癌标志物-NMP22的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测，对膀胱癌标志物-NMP22的检测限可达0.21 pg/mL。
具体实施方式
实施例1膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器的制备
（1） 将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV;
（2） 取6 μL、0.5 mg/mL的氨基化石墨烯的溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（3） 滴加3 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的混合液到电极表面，再继续滴加6 μL、5~10 μg/mL的膀胱癌标志物-NMP22捕获抗体，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度均为0.1 mol/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的体积比为1 : 1；
（4）继续滴加3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液到电极表面，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
（5） 继续滴加6 μL、0.001~20 ng/mL的一系列不同浓度的膀胱癌标志物-NMP22溶液到电极表面，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
（6） 继续滴加4 μL检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液到电极表面，置于4 ℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼构建的膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器。
实施例2 膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器的制备
（1） 将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV;
（2） 取6 μL、1 mg/mL的氨基化石墨烯的溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（3） 滴加3 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的混合液到电极表面，再继续滴加6 μL、5~10 μg/mL的膀胱癌标志物-NMP22捕获抗体，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度均为0.1 mol/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的体积比为3 : 1；
（4） 继续滴加3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液到电极表面，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
（5） 继续滴加6 μL、0.001~20 ng/mL的一系列不同浓度的膀胱癌标志物-NMP22溶液到电极表面，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
（6） 继续滴加5 μL检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液到电极表面，置于4 ℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼构建的膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器。
实施例3膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器的制备方法
（1） 将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV;
（2） 取6 μL、2 mg/mL的氨基化石墨烯的溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（3） 滴加3 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的混合液到电极表面，再继续滴加6 μL、5~10 μg/mL的膀胱癌标志物-NMP22捕获抗体，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度均为0.1 mol/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的体积比为4 : 1；
（4） 继续滴加3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液到电极表面，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
（5） 继续滴加6 μL、0.0010~20 ng/mL的一系列不同浓度的膀胱癌标志物-NMP22溶液到电极表面，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
（6） 继续滴加6 μL检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液到电极表面，置于4 ℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼构建的膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器。
实施例4  氨基化石墨烯的制备
取0.05 g氧化石墨烯置于三口烧瓶中，加入0.1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷和10 mL无水乙醇，加热到70 ℃并保持1.0 h，随后加入0.05 mL的80%的水合肼，在95℃下保持1 h，然后冷却到室温，所得混合物经洗涤、离心分离，35 ℃下真空干燥，制得氨基化石墨烯。
实施例5 氨基化石墨烯的制备
取1 g氧化石墨烯置于三口烧瓶中，加入1.5 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷和10 mL无水乙醇，加热到70 ℃并保持1.5 h，随后加入1 mL的80%的水合肼，在95 ℃下保持1 h，然后冷却到室温，所得混合物经洗涤、离心分离，、40 ℃下真空干燥，制得氨基化石墨烯。
实施例6 氨基化石墨烯的制备
取1.5 g氧化石墨烯置于三口烧瓶中，加入3 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷和10 mL无水乙醇，加热到70 ℃并保持2.0 h，随后加入1.5 mL的80%的水合肼，在95℃下保持1 h，然后冷却到室温，所得混合物经洗涤、离心分离，45℃下真空干燥，制得氨基化石墨烯。
实施例7检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液的制备
（1）氨基化碳纳米管的制备
将20 mg的羧基化碳纳米管、2.5 mL的乙二胺、0.4 g环己基碳二亚胺放入三口烧瓶中，加热到120 ℃，保温96 h，然后冷却到室温，混合物经洗涤、离心分离、35℃下真空干燥，制得氨基化的碳纳米管；
（2）PdPt纳米笼的制备
分别称取80 mg聚乙烯吡咯烷酮，40 mg抗坏血酸，400 mg溴化钾溶于8 mL的超纯水中，在70 ℃下预热10 min后，加入50 mg氯亚钯酸钠，70 ℃油浴下回流3 h，得到Pd立方体溶液；
分别称取30 mg聚乙烯吡咯烷酮，280 mg溴化钾和280 mg柠檬酸溶于7 mL水中，加入1 mL Pd立方体溶液，90 ℃下加热搅拌，随后加入28 mg氯亚钯酸钾，继续回流12 h，然后进行离心洗涤，制得PdPt纳米笼；
（3）检测抗体标记物碳纳米管/PdPt纳米笼的制备
将1 mg氨基化的碳纳米管与2 mL制得的PdPt纳米笼溶液混合，分离，在35 ℃下真空干燥，制得检测抗体标记物碳纳米管/PdPt纳米笼；
（4）检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液的制备
将1 mg 碳纳米管/PdPt纳米笼分散到1 mL超纯水中，加入100 μL、8 μg/mL的检测抗体溶液和900 μL、1/15 mol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，在4 ℃下振荡孵化12 h离心分离，取下层沉淀，再加入1 mL、1/15 mol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，取下层沉淀，最后加入1 mL、1/15 mol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，即制得检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液，4 ℃下保存备用。
实施例8检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液的制备
（1）氨基化碳纳米管的制备
将20 mg的羧基化碳纳米管、2.5 mL的乙二胺、0.4 g环己基碳二亚胺放入三口烧瓶中，加热到120 ℃，保温96 h，然后冷却到室温，混合物经洗涤、离心分离、40℃下真空干燥，制得氨基化的碳纳米管；
（2）PdPt纳米笼的制备
分别称取90 mg聚乙烯吡咯烷酮，50 mg抗坏血酸，450 mg溴化钾溶于8 mL的超纯水中，在75 ℃下预热10 min后，加入54 mg氯亚钯酸钠，75 ℃油浴下回流3 h，得到Pd立方体溶液；
分别称取32 mg聚乙烯吡咯烷酮，290 mg溴化钾和290 mg柠檬酸溶于7 mL水中，加入1 mL Pd立方体溶液，90 ℃下加热搅拌，随后加入28 mg氯亚钯酸钾，继续回流12 h，然后进行离心洗涤，制得PdPt纳米笼；
（3）检测抗体标记物碳纳米管/PdPt纳米笼的制备
将2 mg氨基化的碳纳米管与2 mL制得的PdPt纳米笼溶液混合，分离，在35 ℃下真空干燥，制得检测抗体标记物碳纳米管/PdPt纳米笼；
（4）检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液的制备
将2 mg 碳纳米管/PdPt纳米笼分散到1 mL超纯水中，加入100 μL、9 μg/mL的检测抗体溶液和900 μL、1/15 mol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，在4 ℃下振荡孵化12 h离心分离，取下层沉淀，再加入1 mL、1/15 mol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，取下层沉淀，最后加入1 mL、1/15 mol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，即制得检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液，4 ℃下保存备用。
实施例9 检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液的制备
（1）氨基化碳纳米管的制备
将20 mg的羧基化碳纳米管、2.5 mL的乙二胺、0.4 g环己基碳二亚胺放入三口烧瓶中，加热到120 ℃，保温96 h，然后冷却到室温，混合物经洗涤、离心分离、45℃下真空干燥，制得氨基化的碳纳米管；
（2）PdPt纳米笼的制备
分别称取100 mg聚乙烯吡咯烷酮，58 mg抗坏血酸，550 mg溴化钾溶于8 mL的超纯水中，在80 ℃下预热10 min后，加入57 mg氯亚钯酸钠，80 ℃油浴下回流3 h，得到Pd立方体溶液；
分别称取33 mg聚乙烯吡咯烷酮，300 mg溴化钾和300 mg柠檬酸溶于7 mL水中，加入1 mL Pd立方体溶液，90 ℃下加热搅拌，随后加入28 mg氯亚钯酸钾，继续回流12 h，然后进行离心洗涤，制得PdPt纳米笼；
（3）检测抗体标记物碳纳米管/PdPt纳米笼的制备
将3 mg氨基化的碳纳米管与2 mL制得的PdPt纳米笼溶液混合，分离，在35 ℃下真空干燥，制得检测抗体标记物碳纳米管/PdPt纳米笼；
（4）检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液的制备
将3 mg 碳纳米管/PdPt纳米笼分散到1 mL超纯水中，加入100 μL、12 μg/mL的检测抗体溶液和900 μL、1/15 mol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，在4 ℃下振荡孵化12 h离心分离，取下层沉淀，再加入1 mL、1/15 mol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，取下层沉淀，最后加入1 mL、1/15 mol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，即制得检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液，4 ℃下保存备用。
实施例10  膀胱癌标志物-NMP22的检测
（1）采用三电极体系进行测定，将上述所制备的传感器作为工作电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于pH=7.4的PBS缓冲溶液中，采用时间-电流的方法进行扫描，输入电压为-0.4 V，运行时间400 s，记录电流变化；
（2）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL的1/15 mol/L、pH=7.4的PBS中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，然后记录电流变化，根据所得电流差值与膀胱癌标志物-NMP22的浓度成线性关系，绘制工作曲线；
（3）依据工作曲线，进行样品中膀胱癌标志物-NMP22的检测，线性范围为 0.0010~20 ng/mL，检测限达到0.21 pg/mL。

Claims (2)

1.一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼构建的膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）氨基化碳纳米管的制备
将20 mg的羧基化碳纳米管、2.5 mL的乙二胺、0.4 g环己基碳二亚胺放入三口烧瓶中，加热到120 ℃，保温96 h，然后冷却到室温，混合物经洗涤、离心分离、35~45℃下真空干燥，制得氨基化的碳纳米管；
（2）PdPt纳米笼的制备
分别称取80~100 mg聚乙烯吡咯烷酮，40~58 mg抗坏血酸，400~550 mg溴化钾溶于8 mL的超纯水中，在70~80 ℃下预热10 min后，加入50~57 mg氯亚钯酸钠，70~80 ℃油浴下回流3h，得到Pd立方体溶液；
分别称取30~33 mg聚乙烯吡咯烷酮，280~300 mg溴化钾和280~300 mg柠檬酸溶于7 mL水中，加入1 mL Pd立方体溶液，90 ℃下加热搅拌，随后加入28 mg氯亚钯酸钾，继续回流12 h，然后进行离心洗涤，制得PdPt纳米笼；
（3）检测抗体标记物碳纳米管/PdPt纳米笼的制备
将1~3mg氨基化的碳纳米管与2 mL制得的PdPt纳米笼溶液混合，分离，在35 ℃下真空干燥，制得检测抗体标记物碳纳米管/PdPt纳米笼；
（4）检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液的制备
将1~3 mg 碳纳米管/PdPt纳米笼分散到1 mL超纯水中，加入100 μL、8~12 μg/mL的检测抗体溶液和900 μL、1/15 mol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，在4 ℃下振荡孵化12 h离心分离，取下层沉淀，再加入1 mL、1/15 mol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，取下层沉淀，最后加入1 mL、1/15 mol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，即制得检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液，4 ℃下保存备用；
（5）免疫传感器的制备
1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；
2）取6 μL、0.5~2 mg/mL的氨基化石墨烯的溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
3）滴加3 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的混合液到电极表面，再继续滴加6 μL、5~10 μg/mL的膀胱癌标志物-NMP22捕获抗体，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度均为0.1 mol/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液的体积比为1~ 4 : 1；
4）继续滴加3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液到电极表面，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
5）继续滴加6 μL、0.001~20 ng/mL的一系列不同浓度的膀胱癌标志物-NMP22溶液到电极表面，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
6）继续滴加4~6 μL检测抗体孵化物碳纳米管/PdPt纳米笼-Ab2溶液到电极表面，置于4 ℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼构建的膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器。
2.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼构建的膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器，其特征在于，用于膀胱癌标志物-NMP22的检测，包括以下步骤：
（1）采用三电极体系进行测定，将上述所制备的传感器作为工作电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于pH=7.4的PBS缓冲溶液中，采用时间-电流的方法进行扫描，输入电压为-0.4 V，运行时间400 s，记录电流变化；
（2）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL的1/15 mol/L、pH=7.4的PBS中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，然后记录电流变化，根据所得电流差值与膀胱癌标志物-NMP22的浓度成线性关系，绘制工作曲线；
（3）依据工作曲线，进行样品中膀胱癌标志物-NMP22的检测。
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CN104133059B (zh) * 2014-08-20 2015-08-19 济南大学 一种合金负载分子筛电化学免疫传感器的制备方法及应用
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105759052A (zh) * 2015-12-02 2016-07-13 陈炜 用于膀胱癌非侵入式诊断的分子标志

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