CN106680512B - 一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒及其应用。本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒主要由核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体、辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体、吖啶酯、洗涤液和核基质蛋白22校准品组成。本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒可以检测手术治疗后患者或复发及转移性肿瘤患者人体液核基质蛋白22的表达水平，对膀胱癌的临床诊断具有重要意义；而且本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒还具有检测结果的准确性和稳定性高、灵敏度好的优点，有利于膀胱癌患者的早期诊断和预后处理。

Description

一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒及其应用。
背景技术
膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤，90％以上为移行细胞癌，膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinoma of bladder)多发生于50-70岁之间，其中80％以上为表浅肿瘤，有10％～20％发展为浸润性膀胱癌。目前对膀胱癌诊断和术后复查的手段主要有膀胱镜和尿细胞学检查，膀胱镜虽准确，但其是一种侵入性检查，操作复杂、费时费力、费用高额，且会增加患者的痛苦，使得很多患者对此方法有抵触情绪，同时其还难以发现原位癌或扁平癌。尿细胞学检查虽无创，且特异性较好，但敏感性低，对于分期较低、分化较好的肿瘤，其敏感性仅为30％或更低，而且受诊断医师主观因素的影响较大。因此，寻找一种简便、无创且能早期诊断膀胱癌的检测方法具有很大意义。
核基质蛋白22(NMP-22)是核基质的重要组成部分，其与DNA的复制、转录及RNA的合成、基因表达的调控有关。NMP-22是核有丝分裂装置蛋白(NuMA)的一个亚单位，NuMA和有丝分裂期间纺锤体的形成有关，其主要功能为协调核有丝分裂期间染色体正确均匀地分配到子代细胞。因此，NMP-22多分布于有丝分裂较活跃的组织，如上皮细胞，尤其是尿路上皮细胞。
现代研究发现，当细胞恶变(malignant transformation)时，核内遗传物质在分裂末期分配极度异常，NMP22的合成激增。膀胱癌患者尿液NMP-22含量升高是由于癌细胞增殖异常活跃使细胞内NMP-22含量增高，在细胞凋亡过程中释放到尿液中所致。NMP-22在尿液中的含量在一定程度上反映了肿瘤细胞的增殖状况。因此，尿液中NMP-22含量可作为筛选膀胱癌的一个肿瘤标志物，对判断疾病的进展及治疗效果评价有重要参考价值。
专利文献CN104330565A在2014年10月24日公开了一种利用抗核基质蛋白22抗体快速检测膀胱癌的免疫层析试纸及其制备方法，该免疫层析试纸包括样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4和底板5；硝酸纤维素膜3在所述底板5的中部，在所述硝酸纤维素膜3沿底板的一端依次为结合垫2、样品垫1，在所述硝酸纤维素膜3沿底板的另一端为吸水纸4；硝酸纤维素膜3包含包被有抗核基质蛋白22抗体的检测区和包被有抗IgG抗体的质控区；检测区设有检测线(T)，质控区设有质控线(C)；结合垫2上包被有胶体金标记的抗核基质蛋白22抗体或乳胶标记的抗核基质蛋白22抗体或胶体硒标记的抗核基质蛋白22抗体。该免疫层析试纸具有使用简便、无创，可作为膀胱癌的临床辅助诊断及病情的检测的优点，但是，该免疫层析试纸的检测准确度和重复性较低，不适合大规模推广和应用。
专利文献CN104267197A在2014年10月24日公开了一种核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒及其制备方法，所述核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒包括：1)NMP22校准品；2)NMP22单克隆抗体预包被的固相载体；3)NMP22单克隆抗体的酶标记物；4)与所述酶作用的发光底物液；5)浓缩洗液。该核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒是一种简便、无创且能早期诊断膀胱癌的试剂盒。但是，该核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒的稳定性较差，无法满足临床的要求。
因此，研究和开发出一种灵敏性高、特异性好和稳定性高的膀胱癌的检测方法仍是当前亟需解决的难题。
发明内容
为了解决现有技术中的膀胱癌检测试剂盒的不足，本发明目的在于提供一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒，以解决上述问题。
本发明提供了一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒，由核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体、辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体、吖啶酯、洗涤液和核基质蛋白22校准品组成。
进一步地，所述核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体的制备方法为：
将核基质蛋白22单克隆抗体加入pH为4.2的柠檬酸钠缓冲液中制成包被液，所述核基质蛋白22单克隆抗体的添加量是柠檬酸钠缓冲液体积的0.8-1.2％，将所述包被液加入96孔微孔板中，每孔100μL，放置4℃条件下过夜，甩掉包被液，接着每孔加入300μL封闭液，室温放置3-5h，甩掉封闭液，室温除湿干燥24h，即得。
进一步地，所述封闭液由以下组分组成：
柠檬酸钠缓冲液30-50g/L、十四烷基三甲基氯化铵12-16g/L、绿原酸2-4g/L、葛根素0.6-1.2g/L、氯化钠4-6g/L和Proclin300 0.1-0.3g/L，余量为水。
进一步地，所述封闭液由以下组分组成：
柠檬酸钠缓冲液45g/L、十四烷基三甲基氯化铵14g/L、绿原酸3g/L、葛根素0.8g/L、氯化钠5g/L和Proclin300 0.2g/L，余量为水。
进一步地，所述辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体的制备方法为：
取10mg辣根过氧化物酶加1ml水中溶解，混匀4-6min后加浓度为0.08mol/L的NaIO4水溶液1ml混合，然后置于冰箱内20-30min后，加0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml终止氧化反应，反应20-30min，接着加入21％NaCl溶液0.3ml，再加1.2ml无水乙醇沉淀醛化酶，离心去上清，沉淀酶再用6ml 80％的乙醇溶液浸泡洗涤一次后，离心倾去乙醇，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸钠缓冲液2ml溶解，然后加入2ml羊抗人IgG(内含蛋白量20mg左右)，搅拌均匀，置冰箱内过夜，次日取出加10mgNaBH4混匀，3h后加10mg饱和硫酸铵沉淀酶结合物，离心，去上清，沉淀用50％饱和硫酸铵洗涤一次，离心，再去上清，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸钠缓冲液3ml溶解，转入透析袋中用生理盐水透析除盐(需换液5次)，如有沉淀需离心除去，上清呈淡棕色即为辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体。
进一步地，所述吖啶酯的浓度为1-2g/mL。
进一步地，所述洗涤液由以下组分组成：
十四烷基三甲基氯化铵12-16g/L、小檗碱1-3g/L、脱氧胆酸钠8-12g/L、氯化钠3-6g/L、氯化钙5-8g/L和Proclin300 0.1-0.3g/L，余量为水。
进一步地，所述洗涤液由以下组分组成：
十四烷基三甲基氯化铵14g/L、小檗碱2g/L、脱氧胆酸钠10g/L、氯化钠4g/L、氯化钙6g/L和Proclin300 0.2g/L，余量为水。
进一步地，所述核基质蛋白22校准品以牛血清蛋白为基质，加入核基质蛋白22抗原纯品配制成。
另外，本发明还提供了所述的核基质蛋白22的快速检测试剂盒在检测核基质蛋白22中的应用。
本发明采用的吖啶酯的分子式为C30H26N2O9S，CAS号为194357-64-7；核基质蛋白22单克隆抗体购于上海乔羽生物科技有限公司；绿原酸的CAS号为327-97-9；葛根素的CAS号为3681-99-0；羊抗人IgG购于上海心语生物科技有限公司；血清蛋白的CAS号为9048-46-8；小檗碱的CAS号为2086-83-1。
本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒的检测原理是：采用化学发光检测核基质蛋白22，采用辣根过氧化物酶对核基质蛋白22抗体进行标记，然后将辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体加入待测的抗原中使之结合，结合有辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体的抗原与核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体上的核基质蛋白22单克隆抗体结合，接着用洗涤液洗板，将固定在固相载体上的包被抗体-抗原-酶标抗体复合物与未结合物分离，接着加入化学底物液进行反应，然后利用化学发光检测进行检测，从而检测出核基质蛋白22的含量。
本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒可以有效、稳定地测定膀胱癌患者血液、尿液或唾液中核基质蛋白22的含量，是一种较为理想的膀胱癌检测试剂盒。本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒优选的检测样品为膀胱癌患者的尿液。
进一步地，本发明提供的洗涤液可以有效的减少受检血液、尿液或唾液中其他物质的干扰，可以大大的提高核基质蛋白22的快速检测试剂盒的灵敏度和精确度。同时，本发明提供的封闭液可以有效的提高核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体的稳定性，从而可以有效的提高核基质蛋白22的快速检测试剂盒的稳定性，有利于膀胱癌患者的早期诊断和预后处理。
进一步地，经试验发现，本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒的灵敏度小于0.2ng/ml，可以有效的提高核基质蛋白22的快速检测试剂盒的准确性和精确度。同时，本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒检测的批内和批间的变异系数小于5％，说明本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒具有较高的精密度和重复性。
进一步地，经试验发现，本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒具有较高的稳定性，在常温下放置12个月其灵敏度与刚制备的试剂盒基本一致。另外，本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒在4℃下保存36个月后，试剂盒的灵敏度及线性良好，与刚制备的试剂盒无明显差别，说明本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒具有较高的稳定性。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：
(1)本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒可以检测手术治疗后患者或复发及转移性肿瘤患者人体液的NMP-22的表达水平，对膀胱癌的临床诊断具有重要意义；
(2)本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒具有灵敏性高、特异性好和稳定性高的优点，有利于膀胱癌患者的早期诊断和预后处理。
具体实施方式
下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。下列实施例中未注明具体试验条件的试验方法，通常按照常规条件，分子克隆试验指南(Sambrook J,et al.2008.Molecular Cloning:A LaboratoryManual,3rd Ed.)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒
所述核基质蛋白22的快速检测试剂盒的制备
1、核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体的制备：
将核基质蛋白22单克隆抗体加入pH为4.2的柠檬酸钠缓冲液中制成包被液，所述核基质蛋白22单克隆抗体的添加量是柠檬酸钠缓冲液体积的0.8％，将所述包被液加入96孔微孔板中，每孔100μL，放置4℃条件下过夜，甩掉包被液，接着每孔加入300μL封闭液，室温放置3-5h，甩掉封闭液，室温除湿干燥24h，即得；
所述封闭液由以下成分组成：柠檬酸钠缓冲液30g/L、十四烷基三甲基氯化铵12g/L、绿原酸2g/L、葛根素0.6-g/L、氯化钠4g/L和Proclin300 0.1g/L，余量为水。
2、辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体的制备：
取10mg辣根过氧化物酶加1ml水中溶解，混匀4min后加浓度为0.08mol/L的NaIO4水溶液1ml混合，然后置于冰箱内20min，加0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml终止氧化反应，反应20min，接着加入21％NaCl溶液0.3ml，再加1.2ml无水乙醇沉淀醛化酶，离心去上清，沉淀酶再用6ml 80％的乙醇溶液浸泡洗涤一次后，离心倾去乙醇，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸钠缓冲液2ml溶解，然后加入2ml羊抗人IgG(内含蛋白量20mg左右)，搅拌均匀，置冰箱内过夜，次日取出加10mgNaBH4混匀，3h后加10mg饱和硫酸铵沉淀酶结合物，离心，去上清，沉淀用50％饱和硫酸铵洗涤一次，离心，再去上清，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸钠缓冲液3ml溶解，转入透析袋中用生理盐水透析除盐，需换液5次，如有沉淀需离心除去，上清呈淡棕色即为辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体。
3、洗涤液的配置：
所述洗涤液由以下成分组成：十四烷基三甲基氯化铵12g/L、小檗碱1g/L、脱氧胆酸钠8g/L、氯化钠3g/L、氯化钙5g/L和Proclin300 0.1g/L，余量为水。
将上述配方中的十四烷基三甲基氯化铵、小檗碱、脱氧胆酸钠、氯化钠、氯化钙和Proclin300加入水中搅拌均匀，即得。
4、核基质蛋白22校准品的配置：以牛血清蛋白为基质，加入核基质蛋白22抗原纯品配制成，制备的最终浓度为：0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。
5、将核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体、辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体、吖啶酯、洗涤液和核基质蛋白22校准品分别组装，即得，所述吖啶酯的浓度为1g/mL。
实施例2、一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒
所述核基质蛋白22的快速检测试剂盒的制备
1、核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体的制备：
将核基质蛋白22单克隆抗体加入pH为4.2的柠檬酸钠缓冲液中制成包被液，所述核基质蛋白22单克隆抗体的添加量是柠檬酸钠缓冲液体积的1.0％，将所述包被液加入96孔微孔板中，每孔100μL，放置4℃条件下过夜，甩掉包被液，接着每孔加入300μL封闭液，室温放置3-5h，甩掉封闭液，室温除湿干燥24h，即得；
所述封闭液由以下组分组成：
柠檬酸钠缓冲液45g/L、十四烷基三甲基氯化铵14g/L、绿原酸3g/L、葛根素0.8g/L、氯化钠5g/L和Proclin300 0.2g/L，余量为水。
2、辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体的制备：
取10mg辣根过氧化物酶加1ml水中溶解，混匀5min后加浓度为0.08mol/L的NaIO4水溶液1ml混合，然后置于冰箱内25min，加0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml终止氧化反应，反应25min，接着加入21％NaCl溶液0.3ml，再加1.2ml无水乙醇沉淀醛化酶，离心去上清，沉淀酶再用6ml 80％的乙醇溶液浸泡洗涤一次后，离心倾去乙醇，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸钠缓冲液2ml溶解，然后加入2ml羊抗人IgG(内含蛋白量20mg左右)，搅拌均匀，置冰箱内过夜，次日取出加10mgNaBH4混匀，3h后加10mg饱和硫酸铵沉淀酶结合物，离心，去上清，沉淀用50％饱和硫酸铵洗涤一次，离心，再去上清，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸钠缓冲液3ml溶解，转入透析袋中用生理盐水透析除盐，需换液5次，如有沉淀需离心除去，上清呈淡棕色即为辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体。
3、洗涤液的配置：
所述洗涤液由以下成分组成：十四烷基三甲基氯化铵14g/L、小檗碱2g/L、脱氧胆酸钠10g/L、氯化钠4g/L、氯化钙6g/L和Proclin300 0.2g/L，余量为水。
将上述配方中的十四烷基三甲基氯化铵、小檗碱、脱氧胆酸钠、氯化钠、氯化钙和Proclin300加入水中搅拌均匀，即得。
4、核基质蛋白22校准品的配置：以牛血清蛋白为基质，加入核基质蛋白22抗原纯品配制成，制备的最终浓度为：0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。
5、将核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体、辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体、吖啶酯、洗涤液和核基质蛋白22校准品分别组装，即得，所述吖啶酯的浓度为2g/mL。
实施例3、一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒
所述核基质蛋白22的快速检测试剂盒的制备
1、核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体的制备：
将核基质蛋白22单克隆抗体加入pH为4.2的柠檬酸钠缓冲液中制成包被液，所述核基质蛋白22单克隆抗体的添加量是柠檬酸钠缓冲液体积的1.2％，将所述包被液加入96孔微孔板中，每孔100μL，放置4℃条件下过夜，甩掉包被液，接着每孔加入300μL封闭液，室温放置3-5h，甩掉封闭液，室温除湿干燥24h，即得；
所述封闭液由以下组分组成：
柠檬酸钠缓冲液50g/L、十四烷基三甲基氯化铵16g/L、绿原酸4g/L、葛根素1.2g/L、氯化钠6g/L和Proclin300 0.3g/L，余量为水。
2、辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体的制备：
取10mg辣根过氧化物酶加1ml水中溶解，混匀6min后加浓度为0.08mol/L的NaIO4水溶液1ml混合，然后置于冰箱内30min，加0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml终止氧化反应，反应30min，接着加入21％NaCl溶液0.3ml，再加1.2ml无水乙醇沉淀醛化酶，离心去上清，沉淀酶再用6ml 80％的乙醇溶液浸泡洗涤一次后，离心倾去乙醇，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸钠缓冲液2ml溶解，然后加入2ml羊抗人IgG(内含蛋白量20mg左右)，搅拌均匀，置冰箱内过夜，次日取出加10mgNaBH4混匀，3h后加10mg饱和硫酸铵沉淀酶结合物，离心，去上清，沉淀用50％饱和硫酸铵洗涤一次，离心，再去上清，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸钠缓冲液3ml溶解，转入透析袋中用生理盐水透析除盐，需换液5次，如有沉淀需离心除去，上清呈淡棕色即为辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体。
3、洗涤液的配置：
所述洗涤液由以下成分组成：十四烷基三甲基氯化铵16g/L、小檗碱3g/L、脱氧胆酸钠12g/L、氯化钠6g/L、氯化钙8g/L和Proclin300 0.3g/L，余量为水。
将上述配方中的十四烷基三甲基氯化铵、小檗碱、脱氧胆酸钠、氯化钠、氯化钙和Proclin300加入水中搅拌均匀，即得。
4、核基质蛋白22校准品的配置：以牛血清蛋白为基质，加入核基质蛋白22抗原纯品配制成，制备的最终浓度为：0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。
5、将核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体、辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体、吖啶酯、洗涤液和核基质蛋白22校准品分别组装，即得，所述吖啶酯的浓度为1g/mL。
对比例1、一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒
所述核基质蛋白22的快速检测试剂盒制备方法的不同在于，所述封闭液由以下组分组成：柠檬酸钠缓冲液45g/L、牛血清蛋白14g/L、绿原酸3g/L、葛根素0.8g/L、氯化钠5g/L和Proclin300 0.2g/L，余量为水。其余步骤与实施例2类似。
对比例2、一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒
所述核基质蛋白22的快速检测试剂盒制备方法的不同在于，所述封闭液由以下组分组成：柠檬酸钠缓冲液45g/L、十四烷基三甲基氯化铵14g/L、绿原酸3.8g/L、氯化钠5g/L和Proclin300 0.2g/L，余量为水。其余步骤与实施例2类似。
对比例3、一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒
所述核基质蛋白22的快速检测试剂盒制备方法的不同在于，所述洗涤液有以下成分组成：吐温20 14g/L、小檗碱2g/L、脱氧胆酸钠10g/L、氯化钠4g/L、氯化钙6g/L和Proclin3000.2g/L，余量为水。其余步骤与实施例2类似。
对比例4、一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒
所述核基质蛋白22的快速检测试剂盒制备方法的不同在于，所述洗涤液有以下成分组成：十四烷基三甲基氯化铵14g/L、脱氧胆酸钠12g/L、氯化钠4g/L、氯化钙6g/L和Proclin3000.2g/L，余量为水。其余步骤与实施例2类似。
试验例一、核基质蛋白22的快速检测试剂盒的操作试验
1、将核基质蛋白22的快速检测试剂盒取出，平衡所有检测试剂和样本至室温(18-25℃)；
2、取需用量的核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体；
3、在所述核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体上每孔依次加入25μL校准品/待测样品；
4、接着在加有校准品/待测样品的核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体上依次加入辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体，每孔100μL，于微量振荡器上振荡30s使其混合均匀，在37℃温育60min；所述辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体使用前用酶标抗体稀释液以1∶4000工作浓度稀释，所述酶标抗体稀释液由磷酸二氢钠0.3g/L、磷酸氢二钠30.3g/L、氯化钠10g/L和水解明胶12g/L、余量为水组成。
5、用洗涤液洗核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体5次，将固定在核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体上的包被抗体-抗原-酶标抗体复合物与未结合物分离；
7、接着在经洗涤液洗板后的核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体加入化学发光底物液，所述化学发光底物液为浓度为1g/mL的吖啶酯溶液，每孔100μL，室温避光反应5min，在5～15min内利用化学发光检测仪进行检测；
8、使用Log(x)-Log(y)的双对数数据拟合方式，进行标准曲线的建立，计算测定结果，即得。试验例二、核基质蛋白22的快速检测试剂盒的灵敏度试验
1、试验材料：实施例1、实施例2和实施例3制备的核基质蛋白22的快速检测试剂盒，人核基质蛋白-22ELISA检测试剂盒(市售试剂盒)，由上海乔羽生物科技有限公司提供。
2、试验方法：采用化学发光检测仪测定实施例1、实施例2和实施例3制备的核基质蛋白22的快速检测试剂盒的灵敏度，按照人核基质蛋白-22ELISA检测试剂盒的说明书测定人核基质蛋白-22ELISA检测试剂盒的灵敏度。
3、试验结果
试验结果如表1所示。
表1核基质蛋白22的快速检测试剂盒的灵敏度试验数据
实施例1 实施例2 实施例3 市售试剂盒
检测范围 0-100ng/ml 0-100ng/ml 0-100ng/ml 0-80ng/ml
灵敏度 0.2ng/ml 0.1ng/ml 0.2ng/ml 1.2ng/ml
由表1可知，本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒的灵敏度小于0.2ng/ml，可以有效的提高核基质蛋白22的快速检测试剂盒的准确性和精确度。
试验例二、核基质蛋白22的快速检测试剂盒的精密度试验
1、试验材料：实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的核基质蛋白22的快速检测试剂盒；收集人核基质蛋白22临床检测高值的人尿液样本，所述尿液可以是任何市售尿液样本、或收集自临床机构。
2、试验方法：将人NMP-22临床检测高值的人尿液样品用蒸馏水稀释浓度为50ng/ml和2.0ng/ml，高浓度值质控品浓度为：50ng/ml，低浓度值质控品为2.0ng/ml。
2.1、批内精密度检测：将高、低浓度值质控品分别分装成10份，采用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备得到的核基质蛋白22的快速检测试剂盒连续检测高、低浓度值质控品10次，计算批内变异系数。
2.2、批间精密度检测：将高、低浓度值质控品分别分装成10份，放于-20℃冰箱保存，采用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备得到的核基质蛋白22的快速检测试剂盒每天检测高、低浓度值质控品1次，连续检测10天，计算批间变异系数。
3、试验结果
试验结果如表2和表3所示。
表2核基质蛋白22的快速检测试剂盒的批内变异系数(CV％)(n＝10)
表3核基质蛋白22的快速检测试剂盒的批间变异系数(CV％)(n＝10)
由表2和表3可知，本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒检测的批内和批间的变异系数小于5％，说明本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒具有较高的精密度和重复性。
试验例三、核基质蛋白22的快速检测试剂盒的稳定性试验
1、试验材料：实施例2、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的核基质蛋白22的快速检测试剂盒。
2、试验方法：
2.1、将实施例2、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的核基质蛋白22的快速检测试剂盒在20℃分别放置6个月和12个月后，按照试验例一中的方法进行灵敏度测定；
2.2、根据浓度为：0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的标准品进行测定，对数据进行回归分析，计算R2值。
3、试验结果：
试验结果如表4所示。
表4核基质蛋白22的快速检测试剂盒的稳定性试验
由表4可知，本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒具有较高的稳定，在常温下放置12个月其灵敏度与刚制备的试剂盒基本一致。另外，本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒在4℃下保存36个月后，试剂盒灵敏度及线性良好，与刚制备的试剂盒无明显差别，说明本发明提供的核基质蛋白22的快速检测试剂盒具有较高的稳定性。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (7)

1.一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒，其特征在于，由核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体、辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体、吖啶酯、洗涤液和核基质蛋白22校准品组成；
所述核基质蛋白22单克隆抗体包被的固相载体的制备方法为：
将核基质蛋白22单克隆抗体加入pH为4.2的柠檬酸钠缓冲液中制成包被液，所述核基质蛋白22单克隆抗体的添加量是柠檬酸钠缓冲液体积的0.8-1.2％，将所述包被液加入96孔微孔板中，每孔100μL，放置4℃条件下过夜，甩掉包被液，接着每孔加入300μL封闭液，室温放置3-5h，甩掉封闭液，室温除湿干燥24h，即得；
所述封闭液由以下组分组成：
柠檬酸钠缓冲液30-50g/L、十四烷基三甲基氯化铵12-16g/L、绿原酸2-4g/L、葛根素0.6-1.2g/L、氯化钠4-6g/L和Proclin300 0.1-0.3g/L，余量为水；
所述洗涤液由以下组分组成：
十四烷基三甲基氯化铵12-16g/L、小檗碱1-3g/L、脱氧胆酸钠8-12g/L、氯化钠3-6g/L、氯化钙5-8g/L和Proclin300 0.1-0.3g/L，余量为水。
2.如权利要求1所述的核基质蛋白22的快速检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液由以下组分组成：
柠檬酸钠缓冲液45g/L、十四烷基三甲基氯化铵14g/L、绿原酸3g/L、葛根素0.8g/L、氯化钠5g/L和Proclin300 0.2g/L，余量为水。
3.如权利要求1所述的核基质蛋白22的快速检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体的制备方法为：
取10mg辣根过氧化物酶加1ml水中溶解，混匀4-6min后加浓度为0.08mol/L的NaIO4水溶液1ml混合，然后置于冰箱内20-30min后，加0.4mol/L的乙二醇溶液0.5ml终止氧化反应，反应20-30min，接着加入21％NaCl溶液0.3ml，再加1.2ml无水乙醇沉淀醛化酶，离心去上清，沉淀酶再用6ml 80％的乙醇溶液浸泡洗涤一次，离心倾去乙醇，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸钠缓冲液2ml溶解，然后加入2ml羊抗人IgG，搅拌均匀，置冰箱内过夜，次日取出加10mgNaBH4混匀，3h后加10mg饱和硫酸铵沉淀酶结合物，离心，去上清，沉淀用50％饱和硫酸铵洗涤一次，离心，再去上清，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸钠缓冲液3ml溶解，转入透析袋中用生理盐水透析除盐，上清呈淡棕色即为辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22单克隆抗体。
4.如权利要求1所述的核基质蛋白22的快速检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯的浓度为1-2g/mL。
5.如权利要求1所述的核基质蛋白22的快速检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液由以下组分组成：
十四烷基三甲基氯化铵14g/L、小檗碱2g/L、脱氧胆酸钠10g/L、氯化钠4g/L、氯化钙6g/L和Proclin300 0.2g/L，余量为水。
6.如权利要求1所述的核基质蛋白22的快速检测试剂盒，其特征在于，所述核基质蛋白22校准品以牛血清蛋白为基质，加入核基质蛋白22抗原纯品配制成。
7.如权利要求1-6任一所述的核基质蛋白22的快速检测试剂盒在检测核基质蛋白22中的应用。
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