CN101545910A - 铁蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测铁蛋白的化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。本发明所提供的检测铁蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒包括：铁蛋白的单克隆抗体酶标记物；铁蛋白的单克隆抗体包被载体；铁蛋白校准品；化学发光底物和洗涤液。根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：以铁蛋白纯品配制校准品；以铁蛋白的单克隆抗体包被载体；分装上述铁蛋白校准品；化学发光底物和洗涤液；以及组装为成品。本发明的试剂盒具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点，并且使用成本低，更易推广应用。

Description

铁蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析及生物医学领域，具体地，本发明提供了一种铁蛋白(Ferritin)化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

铁蛋白是1884年Schmiedeber所发现的水溶性铁贮存蛋白，1937年被Laufberger命名为铁蛋白。1965年Richter等从恶性肿瘤细胞株中分离出铁蛋白，并发现铁蛋白存在于各种组织和体液中。铁蛋白是一种脱铁蛋白组成的具有大分子(450KD)结构的糖蛋白，由24个亚单位聚集而成，每个铁蛋白分子一般可贮存是2500～3000个，最多可达45000个铁原子。血清铁水平在妊娠期及急性贫血时降低，急慢性肝脏损害和肝癌时升高，国内报道肝癌患者阳性率高达90％。

近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。用于检测血清学指标的方法主要包括放射性同位素免疫分析、酶联免疫吸附方法、和化学发光免疫分析。这些方法既可以作为初筛试验也可以作为确认试验，目前该方法已经得到广泛的应用。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)于1977年问世，1985年第一代化学发光免疫分析试剂盒研制成功并投放市场。进入九十年代，化学发光免疫分析试剂盒的研制和自动化测量仪的生产取得了突破性进展，从而进入高速发展阶段。化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术，根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位，代表了当今世界发展的方向和潮流，它不仅具有免疫反应的特异性，而且具有化学发光反应的高灵敏性(检测限度可达10^-15～10^-18mol/L)。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。

本发明的试剂盒可应用于开放式的化学发光测量仪，使用成本低，更易推广应用。

发明内容

本发明将化学发光技术与Ferritin的免疫分析学有效地结合，提供了一种高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速地检测Ferritin的试剂盒，该试剂盒适于在产业上能有效地推广应用。

本发明的目的是提供一种铁蛋白(Ferritin)化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。

根据本发明的试剂盒包括：酶标记的铁蛋白的单克隆抗体；包被有铁蛋白的单克隆抗体的载体；铁蛋白校准品；以及上述酶所作用的化学发光底物和洗涤液。

进一步，根据本发明的制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：

1)用酶标记铁蛋白的单克隆抗体；

2)以铁蛋白的单克隆抗体包被载体；

3)以铁蛋白纯品配制铁蛋白校准品；

4)分装上述铁蛋白校准品、酶标记的铁蛋白的单克隆抗体、该酶所作用的化学发光底物和洗涤液；以及

5)组装为成品。

在上述根据本发明的试剂盒及其制备方法中，所述载体可以为固相载体、优选微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。所述酶可以为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。所述化学发光底物可以为1，2-二氧乙烷类衍生物、其中包括(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。

在根据本发明的方法中，其中所述包被载体的步骤2)包括以下过程：

包被用0.05M pH为7.2的磷酸盐缓冲液配制成所需浓度的Ferritin的单克隆抗体包被液进行包被；生理盐水洗涤三次后，使用pH值为7.0～7.5的磷酸盐封闭液进行封闭。

具体的上述试剂盒可以包括Ferritin校准品、抗体包被板、酶标记物与化学发光底物液、20倍浓缩洗涤液等。其中，所述Ferritin校准品为标准级，纯度不低于90％、抗体包被板为48或96孔的微孔板条、酶标记Ferritin单抗为偶联碱性磷酸酶、化学发光底物液为AMPPD、浓缩洗涤液为Tris-HCl。

本发明“铁蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒”可以准确地定量检测出病人Ferritin的含量，可以根据Ferritin含量的多少估计人体内铁的含量，诊断缺铁性贫血及铁负荷过度等疾病，也可用于血液学及营养状况的研究。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。该Ferritin测定试剂盒(化学发光法)的各项指标均达到或超过酶联免疫分析法。并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。根据本发明的试剂盒，酶标记的Ferritin单抗与载体上包被的Ferritin单抗和被测样品的Ferritin抗原形成“双抗体夹心”结构，因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。

本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与酶联免疫分析同等的特异性，而灵敏度大大提高，比现今的酶联免疫吸附分析灵敏度提高约10倍，可为缺铁性贫血的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。

在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体与包被抗体的活性、载体(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和变异大小、ALP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被缓冲液和保护液进行实验，选择出最适合的包被缓冲液和保护液，通过抗体不同包被浓度实验找到最佳的浓度条件。对于ALP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了长期的考察实验，配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液。

附图说明

图1检测220例正常男性血样结果的散点图。

图2检测180例正常女性血样结果的散点图。

具体实施方式

实施例1制备本发明的Ferritin定量测定试剂盒

一、酶标抗体制备

Ferritin单抗用戊二醛法与碱性磷酸酶偶联，对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存。

酶标单抗稀释液配制称量12.12g的Tris，5g BSA和1mL Proclin 300，将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀。

采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度大于1：5000。

二、Ferritin校准品的制备

用Ferritin纯品配制，分装0、10、50、150、400、800ng/ml共6瓶。

三、固相包被板的制备

(1)包被称量2.20g的NaH₂PO₄·2H₂O、12.90g的Na₂HPO₄·12H₂O和9.0g的NaCl于1L的洁净容器中，加入1L的双蒸水溶解混匀后，PH为7.2，加入适量Ferritin单抗混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔130μL，4℃ 24h。

(2)洗涤：用生理盐水洗三次。

(3)封闭称量0.2g的NaH₂PO₄·2H₂O，2.9g的NaH₂PO₄·12H₂O、10gBSA、和1mL Proclin 300，将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀，测定pH值为7.0。

每孔分别加入封闭液300μL，室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行封袋。贴签后置2～8℃保存。

四、化学发光底物液

称量24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15mL HCl、200mL 3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷和1mL Proclin300，将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀。

五、20倍洗涤液

称量24g Tris，160g NaCl，4g KCl和15ml HCl于洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀，调整PH至7.4

六、半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成铁蛋白定量测定试剂盒(化学发光法)。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。

综上，本发明的发明人还对试剂盒的反应模式和反应条件进行了实验研究，最终确定了双抗体夹心一步法反应模式，并就不同的反应时间对实验结果的影响进行了实验，确定最适合的反应时间。通过对化学发光底物液发光持续时间的测定及不同发光时间对测定值的影响实验表明：在加入化学发光底物液后30-90分钟之间进行测量为最佳，其结果也较为准确。

实施例2～3  制备本发明的Ferritin定量测定试剂盒

除分别以塑料珠，塑料管作为载体、封闭液的pH值为7.5外，其余均以与实施例1相同的方法制备Ferritin定量测定试剂盒。

实施例4  制备本发明的Ferritin定量测定试剂盒

除以磁性颗粒作为载体，用戊二醛将Ferritin的包被单抗与磁颗粒偶联外，其余均以与实施例1相同的方法制备Ferritin定量测定定剂盒。

实施例5 本发明的试剂盒的使用方法

以上实施例1制备的Ferritin定量测定试剂盒的具体操作如下表1：

1)自4℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟。

2)取出包被板条，插入板架上。

表1  Ferritin加样测定程序表      单位：μL

以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的Ferritin的浓度。

实施例6 本发明的试剂盒的方法学鉴定

按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，

(1)试剂盒灵敏度实验

以S0校准品进行10孔重复测定，其平均值加上两倍标准差带入曲线方程所得的浓度值为试剂盒的灵敏度，其灵敏度为1.15ng/mL。

(2)试剂盒特异性实验

与其类似物作交叉反应实验，其结果见表2

表2试剂盒特异性实验结果

 

交叉反应原	CEA	CA50	CA199	CA125
					反应原浓度	162ng/mL	140U/mL	200U/mL	500U/mL
实测值(ng/mL)	0.35	3.38	1.32	1.67

(3)试剂盒精密性实验

批内变异

取低、中、高三份质控血清样品分别进行10孔平行实验，计算测定值的平均值(x)和标准差(s)。按公式CV＝s/x×100％计算变异系数，批内变异系数CV分别为4.5％，5.8％，3.5％。

批间变异

选择5份不同浓度的血清样品对每份血清进行3次重复测定，计算其批间变异系数(CV％)，批间变异CV在6.1～10.5％之间。

(4)试剂盒准确性实验

将高浓度的校准品原料，用正常人血清稀释成四个不同浓度值，每个浓度做5孔平行实验，分别计算回收率在95-103％范围内。

(5)试剂盒稳定性实验

试剂盒保存温度为2-80℃，经过15个月的测定试剂盒的各项指标均满足要求，考虑到运输和使用过程中对试剂盒的影响，我们进行370℃7天的加速实验，实验结果表明试剂盒的各项指标完全符合要求。

说明“铁蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒”的灵敏度、特异性、精密性、准确性和稳定性是完全合格的。

实施例7正常人的Ferritin临界值的确定

健康人血清样品均来自三级甲等以上医院的体检人群，体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾病。

血清样本均于空腹取静脉血5.0ml，经离心分离后收集血清，按照产品的适应症类型重新编号并逐个记录于标本信息检测数据表中，严重溶血、脂血和黄疸样本剔除，如在24小时之内检测，2-8℃保存，否则-20℃保存，避免反复冻融。

使用建立的方法检测了400例健康人血清，其中男性血清220例，女性血清180例，如图1-2。求出健康人测定值的平均值和标准偏差，计算出上述样本发光值的平均值±2倍的标准偏差所对应的浓度值作为正常值参考值，其结果见表3。

表3正常值参考值确定

 

	男性人血清(220例)	女性人血清(180例)
			检测浓度平均值(ng/mL)	118.06	67.42
标准偏差(ng/mL)	50.90	28.52
			人血清正常值平均值±2倍标准偏差，ng/mL)	16.26-219.86	10.38-124.46

利用统计学的正态分布确定其正常值范围为男性16-220ng/mL，女性10-124ng/mL。

Claims (7)

1、一种铁蛋白(Ferritin)定量测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：碱性磷酸酶标记的Ferritin的单克隆抗体；包被有Ferritin的单克隆抗体的载体；Ferritin校准品和洗涤液；以及上述酶所作用的化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物。

2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。。

3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

4、如权利要求1或3所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为溶液，其包含24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15mL HCl、200mL 3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、1mL Proclin 300、1000mL双蒸水。

5、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下过程：用碱性磷酸酶标记Ferritin的单克隆抗体；以Ferritin的单克隆抗体包被载体；以Ferritin纯品配制Ferritin校准品；分装上述Ferritin校准品、酶标记的Ferritin的单克隆抗体、该酶所作用的化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物和洗涤液；以及组装为成品。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述包被载体的步骤2)包括以下过程：用0.05M pH为7.2的磷酸盐缓冲液配制成所需浓度的Ferritin的单克隆抗体包被液进行包被；生理盐水洗涤三次后，使用pH值为7.0～7.5的磷酸盐封闭液进行封闭。

7、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记Ferritin的单克隆抗体采用戊二醛法进行标记。

Images