CN102608327A - 一种铁蛋白的示踪标记方法 - Google Patents

Abstract

一种铁蛋白的示踪标记方法，属于时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）技术领域，可用于血清中铁蛋白含量的检测及对其他分子的标记。本发明研制的一种铁蛋白的示踪标记方法，利用铁蛋白的24个亚基自组装形成中空的球形壳可以包裹金属离子的特性，在pH2.0附近将铁蛋白解离后与EuCl₃混合，再用Na₂CO₃将pH调到8.0，此时铁蛋白的24个亚基重新形成中空的球形壳，同时将Eu包裹在铁蛋白里面形成标记物。本发明方法可建立竞争免疫分析直接检测铁蛋白含量，也可与其他分子偶联形成标记物，用于TRFIA免疫分析。

Description

一种铁蛋白的示踪标记方法

技术领域

一种铁蛋白的示踪标记方法，可用于对铁蛋白含量的检测，属于时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）技术领域。

背景技术

在自然界中，多数动植物及微生物机体中均存在着一种高效维持体内铁平衡的蛋白质，简称铁蛋白(ferritin，FER)，分子量约450000，含铁17%~23%，是铁的主要贮存形式之一，几乎所有真核细胞都含有FER。

血清FER浓度降低常见于缺铁性贫血，隐性缺铁性贫血。溶血性贫血患者血清FER增加，巨幼红细胞贫血、再生障碍性贫血及急性造血停滞等血清FER显著增加。肝炎、肝硬化伴有肝细胞受损时血清FER明显升高。恶性肿瘤血清FER常见增高。慢性肾病患者和肺结核患者也可以引起血清FER明显升高。测定孕妇血清FER可作防治孕期缺铁及贫血的有效指标。

目前FER的检测方法包括以同位素标记的放射免疫分析、以酶标记的酶联免疫分析法、以稀土离子铕标记的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)等等，其中TRFIA是采用稀土元素铕(Eu)标记抗体。基于Eu³⁺独特的光谱学性质，配合荧光检测仪的时间门电路的使用，大大提高了免疫分析的灵敏度(10^-17mol／L)，且没有放射性危害和放射性废物，具有测量范围宽、特异性强、标记物稳定及货架寿命长、检测速度快、操作较简便等优点。

现有的FER时间分辨荧光免疫分析法是基于微孔板双抗体夹心原理的固相时间分辨荧光免疫分析，Eu离子通过双功能螯合剂DTTA标记在FER的特异性抗体。本发明方法提供一种新的标记方法，不需要借助螯合剂，利用FER的自然属性进行标记。FER由含24个亚单位的空蛋白壳和4500个铁原子组成。FER的24亚基分H和L两类，在pH 2.0条件下，FER蛋白壳能解离成游离的亚基并释放出铁离子，随着pH值递增，游离的亚基可重新组装成FER。采用类似方式，FER可通过亚基解离途径直接捕获一些其他的金属离子及各类有机小分子。利用FER的自组装的特性，不需双功能螯合剂，直接将稀土离子Eu包埋在FER分子里面，可用于建立竞争的FER时间分辨荧光免疫分析法等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种铁蛋白的示踪标记方法，可用于对FER含量的检测。

本发明的技术方案：一种铁蛋白FER的示踪标记方法，利用铁蛋白的24个亚基自组装形成中空的球形壳包裹金属离子，即在pH 2.0将铁蛋白解离后与EuCl₃混合，再用Na₂CO₃将pH调到8.0，此时铁蛋白的24个亚基重新形成中空的球形壳，同时将Eu包裹在铁蛋白里面形成标记物：Eu标记的FER。

Eu标记的FER：将100μg FER溶解在200μL pH 2.0、0.1mol/L的HCl溶液中，将FER解离；加入10μL 0.1μmol/L的EuCl₃溶液，混合30分钟，再用Na₂CO₃将pH调到8.0，游离的亚基重新组装成FER分子，同时将Eu包裹在FER里面，通过超滤分离，去除没有包裹进去的Eu、Fe离子，得到Eu标记的FER：Eu³⁺-FER。

Eu标记的FER的应用，建立时间分辨荧光免疫分析TRFIA直接检测铁蛋白FER。

所述Eu标记的FER的应用，检测血清中的铁蛋白FER，步骤为：

（1）Eu标记的FER：Eu³⁺-FER；

（2）微孔板包被羊抗鼠抗体：用pH 9.6、50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液将亲和层析提纯的羊抗鼠IgG稀释至10 mg/L，100μL /孔包被，4℃过夜，弃包被液，拍干板，每孔加250μL封闭液封闭2h，弃封闭液，真空抽干，密封，-20℃保存；

所述封闭液：pH 9.6、含2%BSA的50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液；

（3）抗FER单克隆抗体的稀释：用pH 7.8、含0.1%NaN₃、0.2% BSA、0.9% NaCl的50mmol/L Tris-HCl缓冲液稀释抗FER单克隆抗体至100ng/mL；

抗FER单克隆抗体：购于天津协和医药科技有限公司。

（4）TRFIA分析：取步骤（2）制备的包被有羊抗鼠抗体的微孔包被板，加入25μL的FER标准或样品到各自的微孔中，加25μL步骤（3）制备的以缓冲液稀释的抗FER单克隆抗体，加以pH 7.8、含0.1% NaN₃、0.2%BSA、0.9% NaCl的50mmol/L Tris-HCl稀释的50μL步骤（1）制备的Eu³⁺-FER，25℃振荡1小时，用洗涤液洗六次，加200μL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的FER的含量；

FER标准为：0ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL，从FER纯品中稀释得到，稀释液为工作缓冲液；

工作缓冲液：pH7.8、含8mmol/L NaCl、0.1%BSA、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸DTPA、0.1mL/L Tween-80和0.1% NaN₃的Tris-HCl；

洗涤液：pH7.8、含14.5mmol/L NaCl、0.2mL/L Tween-80和0.2% NaN₃的50mmol/L Tris-HCl；

增强液的配制：1L pH 3.2、含15μmol β-萘甲酰三氟丙酮β-NTA，50μmol三正辛基氧化膦TOPO，1mL曲拉通X-100的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。

本发明的有益效果：本发明标记方法简单，使用方便。

附图说明

图1 FER-TRFIA的标准曲线。

具体实施方式

实施例1 检测血清中的FER

Eu标记的FER：将100μg FER溶解在200μL pH 2.0、0.1mol/L的HCl溶液中，将FER解离，加入10μL 0.1μmol/L的 EuCl₃溶液，混合30分钟，再用Na₂CO₃将pH调到8.0，游离的亚基可重新组装成FER分子，同时将Eu包裹在FER里面。通过超滤分离，去除没有包裹进去的Eu、Fe等离子，得到Eu标记的FER。

微孔板包被羊抗鼠抗体：用pH 9.6、50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液将亲和层析提纯的羊抗鼠IgG稀释至10 mg/L，100μL /孔包被，4℃过夜。弃包被液，拍干板，每孔加250μL封闭液封闭2h，弃封闭液，真空抽干，密封，-20℃保存。

抗FER单克隆抗体的稀释：用pH 7.8、含0.1% NaN₃、0.2% BSA、0.9% NaCl的50mmol/L Tris-HCl缓冲液稀释抗FER单克隆抗体至100ng/mL。抗FER单克隆抗体：购于天津协和医药科技有限公司。

试剂的配制：

工作缓冲液：8mmol/L NaCl、0.1%BSA、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、0.1mL/L Tween-80和0.1% NaN₃的Tris-HCl、pH7.8。

FER标准：（0ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL），从FER纯品中稀释得到，稀释液为工作缓冲液。

洗涤液：14.5mmol/L NaCl、0.2mL/L Tween-80和0.2% NaN₃的50mmol/L Tris-HCl、pH7.8。

增强液的配制：1L pH 3.2、含15μmol β-萘甲酰三氟丙酮（β-NTA），50μmol三正辛基氧化膦(TOPO)，1mL曲拉通X-100（Triton X-100）的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。

TRFIA分析步骤：取包被有羊抗鼠抗体的微孔包被板，加入25μL的FER标准或样品到各自的微孔中，加25μL以缓冲液稀释的抗FER单克隆抗体，加以pH 7.8的50mmol/L Tris-HCl（含0.1%N_aN₃、0.2%BSA、0.9% NaCl）稀释的50μL Eu³⁺-FER，25℃振荡1小时，用洗涤液洗六次，加200μL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的FER的含量，见表1，该例的样品浓度为122ng/mL。

                                                 

Claims (3)

1.一种铁蛋白FER的示踪标记方法，其特征在于利用铁蛋白的24个亚基自组装形成中空的球形壳包裹金属离子，即在pH 2.0将铁蛋白解离后与EuCl₃混合，再用Na₂CO₃将pH调到8.0，此时铁蛋白的24个亚基重新形成中空的球形壳，同时将Eu包裹在铁蛋白里面形成标记物：Eu标记的FER；

Eu标记的FER：将100μg FER溶解在200μL pH 2.0、0.1mol/L的HCl溶液中，将FER解离；加入10μL 0.1μmol/L的EuCl₃溶液，混合30分钟，再用Na₂CO₃将pH调到8.0，游离的亚基重新组装成FER分子，同时将Eu包裹在FER里面，通过超滤分离，去除没有包裹进去的Eu、Fe离子，得到Eu标记的FER：Eu³⁺-FER。

2.用权利要求1所述的方法得到Eu标记的FER的应用，其特征在于建立时间分辨荧光免疫分析TRFIA直接检测铁蛋白FER。

3.根据权利要求2所述Eu标记的FER的应用，其特征在于检测血清中的铁蛋白FER，步骤为：

（1）Eu标记的FER：Eu³⁺-FER；

（2）微孔板包被羊抗鼠抗体：用pH 9.6、50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液将亲和层析提纯的羊抗鼠IgG稀释至10 mg/L，100μL /孔包被，4℃过夜，弃包被液，拍干板，每孔加250μL封闭液封闭2h，弃封闭液，真空抽干，密封，-20℃保存；

所述封闭液：pH 9.6、含2%BSA的50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液；

（3）抗FER单克隆抗体的稀释：用pH 7.8、含0.1%NaN₃、0.2% BSA、0.9% NaCl的50mmol/L Tris-HCl缓冲液稀释抗FER单克隆抗体至100ng/mL；

（4）TRFIA分析：取步骤（2）制备的包被有羊抗鼠抗体的微孔包被板，加入25μL的FER标准或样品到各自的微孔中，加25μL步骤（3）制备的以缓冲液稀释的抗FER单克隆抗体，加以pH 7.8、含0.1% NaN₃、0.2%BSA、0.9% NaCl的50mmol/L Tris-HCl稀释的50μL步骤（1）制备的Eu³⁺-FER，25℃振荡1小时，用洗涤液洗六次，加200μL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的FER的含量；

FER标准为：0ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL，从FER纯品中稀释得到，稀释液为工作缓冲液；

工作缓冲液：pH7.8、含8mmol/L NaCl、0.1%BSA、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸DTPA、0.1mL/L Tween-80和0.1% NaN₃的Tris-HCl；

洗涤液：pH7.8、含14.5mmol/L NaCl、0.2mL/L Tween-80和0.2% NaN₃的50mmol/L Tris-HCl；

增强液的配制：1L pH 3.2、含15μmol β-萘甲酰三氟丙酮β-NTA，50μmol三正辛基氧化膦TOPO，1mL曲拉通X-100的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。

Images