CN101158688B - 一种经改进的固相荧光免疫的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种经改进的固相荧光免疫的检测方法，其特征在于用提供的洗脱液使固相荧光标记免疫复合物形成游离标记物质，再进行测定。所述的洗脱液是由阴离子表面活性剂SDS为溶质，以水或Tris水溶液为溶剂，通过化学交联或物理吸附方法，形成游离荧光标记物质，提高了检测的灵敏度。基本解决了固相时间分辨荧光免疫中存在的稀土元素离子污染问题，摒弃了现有技术中复杂的烘干工艺，提高了检测重复性和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及的一种经改进的固相荧光免疫检测方法，具体地说本发明是一种属于免疫检测领域的固相荧光免疫改进检测方法。属于荧光免疫分析领域。
背景技术
时间分辨荧光分析法(TRIFA)是一种新的非放射性微量分析技术。“时间分辨荧光免疫分析”理论是芬兰人Soini和Hemmia在1979年提出的。其特点在于利用三价稀土离子及其螯合物是一种荧光发射时间较长的示踪物，采用测定时段避开样品的自然荧光的手段，代替荧光物质、同位素和酶，标记生物活性物质。发出的荧光因其灵敏度很高可达到(10pmol/L)以上，操作简便，示踪物稳定，标准曲线范围宽，不受样品的自然荧光干扰，无放射性污染等许多优点，是当今方法学研究和临床应用的最主要的发展方向之一。在生物医学研究和临床超微量免疫检验中已成为一项最有发展前景的分析手段。而已有报道的技术尚存在以下几个方面的问题：
(1)荧光增强液三辛基氧化膦协同法(李振甲；时间分辨荧光分析技术与应用[M]；第一版.北京；科学出版社，1996年)。此法的优点是灵敏度高，缺点是在免疫反应完成后，检测荧光信号值之前需先将荧光标记免疫复合物中的镧系元素先解离下来形成游离的镧系元素，然后加入增强液与游离的镧系元素螯合才能测量荧光，这一过程很容易受到外源性游离镧系元素等金属离子的污染，干扰测量结果。
(2)Cyber Fluor时间分辨荧光免疫分析法(焦奎；酶联免疫技术与应用[M]；第一版.北京；化学工业出版社，2004)。此法采用双功能鳌合剂BCPDA(4，7-双(氯磺酰基苯基)-1，10-菲哕啉-2，9-二羧酸)鳌合三价稀土离子作为标记物，在免疫反应完成后，检测荧光信号值之前无需将荧光标记免疫复合物中的镧系元素解离，可直接测量荧光，避免了因外源性镧系元素等金属离子的污染而干扰测量结果。但是在测量荧光信号值之前需使用强制通风板式干燥器干燥被测载体2小时。而被测载体受测量环境空气的湿度影响较大，易引起被测载体干燥度不稳定，影响测量结果的重复性。且激发光只对待测载体微孔底部荧光发生作用而对孔壁不起作用，因此灵敏度较低。
稀土荧光化合物所产生的荧光具有非常特殊的性质，其最大特征是：
(1)镧系离子的荧光衰变时间极长，是传统荧光的103一106倍。
(2)激发光与发射光之间的Stokes位移大，可达290nm，而普通荧光素的Stokes位移仅为28nm。这样就几乎完全消除了背景荧光的干扰，继而通过时间延迟和波长分辨使特异性荧光和背景荧光得以分辨(故称为时间分辨)，使测量干扰几乎为零。
基于上述特征，时间分辨荧光免疫测定技术的最大优点是可完全消除各种散乱杂光和短寿命荧光对测定的影响，从而极大地提高测定灵敏度和特异性。但是大多数稀土荧光化合物的荧光量子产率较小，需把稀土离子从化合物上解离下来，再用增强液来提高荧光量子的产率，但这也使得外源性稀土离子污染的概率大为增加。而以BCPDA和纳米荧光微粒制备的荧光发光体可直接作为示踪物使用，完全消除了外源性稀土离子污染的问题，如加拿大的Cyber Fluor固相时间分辨荧光免疫分析法。但该法采用载体干式测量，需强力干燥设备，测量环境空气湿度对载体干燥度影响较大，影响测量结果的重复性。而且激光激发的荧光只局限于载体微孔底部某点，使载体微孔壁表面结合的荧光标记物不能利用，造成测量荧光值较低，影响测量结果的灵敏度，使推广受到限制。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种经改进的固相荧光免疫的检测方法。本发明是要提供一种无污染影响，高灵敏度、高稳定性、检测程序简便的固相时间分辨荧光免疫分析法。
本发明的经改进的固相荧光免疫检测步骤为：
(1)在载体上预先固定生物活性物质(如抗体或抗原等)，形成固相生物活性物质。
(2)加入待测的样品，样品中的待测物与固相生物活性物质进行免疫反应，形成固相免疫复合物。除去样品中未反应的物质。
(3)加入荧光标记物：加入标记有荧光发光体的生物活性物质，与固相免疫复合物进行免疫反应，形成固相荧光标记免疫复合物。除去多余的荧光标记物。
(4)用洗脱液使固相荧光标记免疫复合物形成游离荧光标记物质。用荧光仪检测游离荧光标记物质的荧光信号值。
本发明的检测步骤(1)-(3)上与荧光增强液三辛基氧化膦协同法和Cyber Fluor荧光免疫分析法基本相同，但本发明吸取了Cyber Fluor荧光免疫分析法中荧光发光体一次鳌合的特点，又在步骤(4)上改进了CyberFluor法，采用一种专用的洗脱液把荧光发光体全部释放，在汇集荧光增强液三辛基氧化膦协同法和Cyber Fluor荧光免疫分析法的优点时，摒弃了他们的缺陷。
综上所述，本发明的具体技术方案为：
在关键的步骤(4)中，使用洗脱液使固相荧光标记免疫复合物形成游离荧光标记物质进行测定的概念及技术。而洗脱液的组成特征是以阴离子型表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)为溶质，去离子水、蒸馏水或三羟甲基氨基甲烷(Tris)水溶液为溶剂。洗脱液的作用原理是使以化学交联或以物理形式吸附于载体(如聚苯乙烯或聚氯乙烯微孔板)或聚苯乙烯或聚氯乙烯的微粒(球)上的含有荧光发光体的荧光标记复合物在洗脱液的作用下形成游离荧光标记物质，从而不仅提高了测定的灵敏度，同时又避免了操作过程中外源性稀土离子的污染，保证了测定结果的可靠性。洗脱液具有抵御水分子对荧光淬灭作用，同时能以最佳条件降低表面活性剂对荧光的干扰，提高稳定性。
所提供的洗脱液具体配方是：
以蒸馏水、去离子水或三羟甲基氨基甲烷(Tris)为溶剂，以＜1.5％质量百分比的十二烷基硫酸钠(SDS)为溶质的溶液，优先推荐的SDS的质量百分比为0.3％。在免疫反应结束后，用所述的洗涤液清洗载体除去多余的未反应物，加入含有阴离子型表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)的洗脱液，通过振荡器振荡或手工震摇30分钟，或通过超声波洗涤10-30分钟，使荧光发光体或荧光标记物从载体表面洗脱下来并测定荧光值，其洗脱液中的荧光含量与待测物质的含量存在着良好的线性关系。
所述的洗脱液的解离形式为以下三种中的任一种：(A)解离荧光标记免疫复合物对载体的吸附；(B)解离荧光标记免疫复合物之间的结合；(C)解离荧光标记免疫复合物中的荧光发光体或包裹、吸附、联结有荧光发光体的发光微粒(球)与生物活性物质的结合。
所述的荧光标记生物活性物质的制备：制备可在三种状态下进行：(A)双功能螯合剂螯合稀土离子形成荧光发光体标记生物活性物质；(B)双功能螯合剂标记生物活性物质后再螯合稀土离子形成荧光发光体；(C)标记有双功能螯合剂的生物活性物质参与免疫反应，待免疫反应完成后，在进行洗脱前、洗脱过程中以及洗脱后加入稀土离子与标记在生物活性物质上的双功能螯合剂螯合形成荧光发光体。
所述的固相生物物质的形成是将经过修饰或未经过修饰的生物活性物质与经过修饰处理或未经过修饰处理的各种载体通过物理吸附、化学交联的方法结合。
所述的稀土荧光发光体的制备：是以4，7-双(氯磺酰基苯基)-1，10-菲哕啉-2，9-二羧酸(BCPDA)或具有其基本结构的螯合剂和稀土离子形成的螯合物为荧光发光体或吸附、内含荧光发光体的各类纳米尺度级磁性荧光微粒、纳米尺度级高分子塑料荧光微粒、纳米尺度级硅胶微粒为荧光发光体的技术。
螯合剂与稀土离子具有一次性鳌合形成荧光发光体，荧光发光体标记生物活性物质后，稀土离子Eu3+无需再与其它的螯合剂或配位体结合就具有较强的发射荧光能力。
所述的荧光发光体或双功能螯合剂标记生物活性物质，其特征在于标记方式可以是荧光发光体或双功能螯合剂直接与各种生物活性物质如蛋白质、链霉亲和素、生物素、多糖物质、多肽、激素、抗体等结合，也可以将荧光发光体包裹在微粒(球)中再以化学交联形式或以物理吸附的形式与各种生物活性物质结合，或将荧光发光体(或双功能螯合剂)和各种生物活性物质以化学键形式或以物理吸附的形式分别与微粒(球)表面结合。
双功能螯合剂的结构式为：
(1)4，7-双(氯璜酰基苯基)-1，10-菲哕啉-2，9-二羧酸【4，7-bis(chlorosulf-phenyl)-1，10-phenanthrolinc-2，9-diearboxylicacid(BCPDA)】，结构式如图6(a)所示，(2)及其包裹在微粒(球)内或吸附、联接在微粒(球)上具有图6(b)所示的分子基本结构式的鳌合剂。
其中，各种包裹在微粒(球)内或吸附、联接在微粒(球)上的芳香羧酸类鳌合剂：水杨酸、苯甲酸。β-二酮体类鳌合剂：乙酰丙酮(AA)、苯甲酰丙酮(BA)、二苯甲酰甲烷(DBM)、苯甲酰三氟丙酮(BTA)、β-萘酰三氟丙酮(β-NTA)、噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)、三甲基乙酰三氟丙酮(PTA)。
所述的微粒(球)的直径尺度范围是35nm-100nm。
由此可见，本发明的优点是：
1、基本解决了固相时间分辨荧光免疫中使用荧光增强液三辛基氧化膦协同法检测存在的稀土元素离子污染问题，使用本发明所采用的“一次鳌合”形成的荧光发光体即使受到大量稀土离子的污染，其荧光强度依然保持原样，从而极大提高了测定的重复性与稳定性。
2、摒弃了Cyber Fluor时间分辨荧光免疫分析法操作程序中特殊烘干的步骤，避免了空气湿度变化导致的不稳定性，同时缩短了检测时间。
3、本发明使载体微孔内壁及底部结合的荧光标记物得到充分洗脱利用，使测量荧光值增强了5-10倍，提高了检测的灵敏度和精确性。克服了CyberFluor时间分辨荧光免疫分析法只能测量利用载体微孔底部面积所结合的荧光标记物，而造成的测量荧光值低，灵敏度和精确性差的缺陷。
4、结合磁微粒技术，本发明便于固相时间分辨荧光免疫检测全自动化设备的应用。
5、适用的免疫检测方法，包括双抗原夹心法、双抗体夹心法、间接法、竞争法、抗酶抗体法或竞争性抑制法。
附图说明
图1.铕螯合物激发光谱和发射光谱。
图2.铕螯合物消除样品荧光干扰原理示意图。图中，短寿命荧光：通常的荧光体发光和检测样品中的干扰荧光都是短寿命荧光易重迭。长寿命荧光：稀土元素如铕发出的光才是长寿命荧光，利用避开延缓时间仅用计数时间作荧光测定即为时间分辨荧光技术。
图3.用铕螯合物(BCPDA-Eu3+)标记抗体的双抗体夹心法测定血清中甲种胎儿球蛋白(AFP)的工作曲线。
图4.用铕螯合物(BCPDA-Eu3+)-生物素-亲和素标记抗体的双抗体夹心法测定血清中前列腺特异性抗原的(PSA)的工作曲线。
图5.用50Mm-Tris和蒸馏水为溶剂的不同SDS％浓度洗脱液的洗脱效果。
图6.BCPDA的结构式(a)和包裹在微粒(球)内螯合剂的基本结构(b)。
具体实施方式
下面通过实施举例对本发明作进一步说明。
实施例1.
用铕螯合物(BCPDA-Eu3+)标记抗体，用双抗体夹心法测定血清中甲种胎儿球蛋白(AFP)为例，具体步骤如下：
A.Eu3+-BCPDA-羊抗人AFP-IgG抗体的标记：
1)BCPDA标记羊抗人AFP-IgG抗体：
取羊抗人AFP-IgG抗体(1.0mg/ml Medix Biochemica)100μl，加入到pH9.1的碳酸盐缓冲液900μl中，配成0.1mg/ml羊抗人AFP-IgG抗体碳酸盐溶液。同时将1mg BCPDA溶于50μl二甲基甲酰胺(DMF)即为BCPDA溶液，将该BCPDA溶液平均分成4份。每隔2min将1份BCPDA溶液搅拌加入到上述0.1mg/ml羊抗人AFP-IgG抗体碳酸盐溶液中，在8min内加完。搅拌反应30min，取G-50葡萄糖作为凝胶及1cm×15cm的层吸柱，用pH8.0的NH4HCO3为洗脱液，洗脱流速为6滴/min，分离羊抗人AFP-IgG抗体-BCPDA和过量的BCPDA。收集洗脱液在0.1mol/L，pH值9.6的NaHCO3缓冲溶液3升透析2次后，加NaN3到0.1％浓度4℃保存。产物即为羊抗人AFP-IgG抗体-(BCPDA)n。
2)羊抗人AFP-IgG抗体-(BCPDA-Eu3+)n的制备
用含Eu3+Tris-HCl缓冲液(含Eu3+10-6mol·L-1)稀释羊抗人AFP-IgG抗体-(BCPDA)n溶液，将上述稀释溶液置于25℃恒温水浴中加热反应2h，制备成羊抗人AFP-IgG抗体-(BCPDA-Eu3+)n标记物。
B.人血清中AFP的测定：
1)抗体固相：
将含抗人AFP单克隆抗体(Medix Biochemica，5ug/ml)的0.1mol/L pH9.6NaHCO3缓冲溶液100ul分注于载体各微孔中。载体置4℃，24小时。用含0.05％Tween-20的0.05mol/L pH7.8 Tris-HCl缓冲溶液的洗涤液洗涤4次。
2)AFP的时间分辨荧光免疫分析测定：
用含有5％BSA-0.9％NaCl的pH值7.5的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液稀释人AFP(Dakopatts，Denmark)制得AFP标准溶液，将此标准溶液和血清样品分别100ul注入上述已固相抗体的载体各微孔中，将载体置37℃，1小时后，用上述洗涤液洗涤4次。然后加入100ul的羊抗人AFP-IgG抗体-(BCPDA-Eu3+)n标记物，37℃，1小时后，用上述洗涤液洗涤4次，拍干。再加入0.3％十二烷基硫酸钠(SDS)-50mmol/L Tris溶液的洗脱液，用振荡器振荡30分钟，然后测量荧光值。3)测量仪器为新波公司的SYM-D10时间分辨荧光仪测定，测量条件：激发波长，340nm；检测波长，613nm；迟延时间，0.2ms；窗口时间，0.4ms；循环时间，1.0ms。
用本发明提供的方法测定AFP的工作曲线(如图3所示)：用零浓度时的荧光信号(本底)的标准差(SD)3倍计算AFP测定的最低检出下限，得本法的最低检出下限为1.23ug/L。工作曲线上限可达230ug/L。
实施例2
用含铕螯合物-亲和素-生物素标记抗体，用双抗体夹心法测定血清前列腺特异性抗原(PSA)为例，具体检测步骤是：
A.Eu3+-BCPDA的制备：用Tris-HCl缓冲液(含Eu3+10-6mol·L-1)稀释水解的BCPDA溶液，将上述溶液置于37℃恒温水浴中加热反应2h，制得Eu3+-BCPDA。
B.Eu3+-BCPDA螯合物标记链亲合素(SA)的制备：
取1mg SA溶于0.5ml 0.05mol/L的pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入相当于12倍SA摩尔量的Eu3+-BCPDA螯合物，在4℃反应过夜，产物经SephadexG-50柱层析，0.05mol/L pH7.75的Tris-HCl溶液(含0.9％NaCl)淋洗。得纯化的Eu3+-BCPDA-SA，标记比值Eu3+/SA为10。
C.生物素标记羊抗人PSA的抗体制备：
1.0mg的羊抗人PSA抗体(1.0mg/ml Medix Biochemica)在4℃，24小时对3升蒸馏水溶液两次透析后，加入8.4mg的NaHCO3和3mg的NHS-LC-biotin(Pierce Chemical Co)，室温搅拌反应1小时后，4℃继续反应24小时。取反应液于4℃，24小时内对含有0.25gNaN3的0.1mol/L NaHCO3水溶液两次透析。于反应液中加入5mg的BSA和5mg的NaN3。反应液放置-20℃备用。但用于免疫测定时，用0.05mol/L pH7.75的Tris-HCl缓冲溶液稀释1000倍后使用。
D.人血清中PSA的测定：
1)抗体固相：
将含抗人PSA单克隆抗体(Medix Biochemica，4.5ug/ml)的0.1mol/L pH9.6 NaHCO3缓冲溶液100ul分注于载体各微孔中。载体置4℃，24小时。用含0.05％Tween-20的0.05mol/L pH7.8 Tris-HCl缓冲溶液的洗涤液洗涤4次。
2)人血清中PSA的时间分辨荧光免疫分析测定：用含有5％BSA-0.9％NaCl的pH值7.5的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液稀释人PSA(Dakopatts，Denmark)制得PSA标准溶液，将此标准溶液和血清样品分别100ul注入上述已固相抗体的载体各微孔中，将载体置37℃，1小时后，用上述洗涤液洗涤4次。然后加入100ul含量5ug/ml的生物素标记的抗PSA抗体溶液，37℃，1小时，用上述洗涤液洗涤4次，再加入100ul Eu3+-BCPDA-SA溶液，37℃，1小时，用上述洗涤液洗涤4次，拍干。再加入0.3％十二烷基硫酸钠(SDS)-50mmol/L Tris溶液的洗脱液，用振荡器振荡30分钟，然后测量荧光值。
3)测定仪器为新波公司的SYM-D10时间分辨荧光仪测定，测定条件：
激发波长，340nm；检测波长，613nm迟延时间，0.2ms；窗口时间，0.4ms；循环时间，1.0ms。
4)用本发明提供的方法测定PSA的工作曲线(如图4所示)：
用零浓度时的荧光信号(本底)的标准差(SD)3倍计算AFP测定的最低检出下限，得本法的最低检出下限为0.13ug/L。工作曲线上限可达235ug/L。
Claims (1)
1.一种经改进的固相荧光免疫检测方法，其特征在于所述的检测的步骤是：
用铕螯合物BCPDA-Eu3+标记抗体，用双抗体夹心法测定血清中甲种胎儿球蛋白AFP，具体步骤如下：
A.Eu3+-BCPDA-羊抗人AFP-IgG抗体的标记：
1)BCPDA标记羊抗人AFP-IgG抗体：取羊抗人AFP-IgG抗体100μl，加入到pH 9.1的碳酸盐缓冲液900μl中，配成0.1mg/ml羊抗人AFP-IgG抗体碳酸盐溶液，同时将1mg BCPDA溶于50μl二甲基甲酰胺即为BCPDA溶液，将该BCPDA溶液平均分成4份，每隔2min将1份BCPDA溶液搅拌加入到上述0.1mg/ml羊抗人AFP-IgG抗体碳酸盐溶液中，在8min内加完，搅拌反应30min，取G-50葡萄糖作为凝胶及1cm×15cm的层吸柱，用pH8.0的NH4HCO3为洗脱液，洗脱流速为6滴/min，分离羊抗人AFP-IgG抗体-BCPDA和过量的BCPDA，收集洗脱液在0.1mol/L，pH值9.6的NaHCO3缓冲溶液3升透析2次后，加NaN3到0.1％浓度4℃保存，产物即为羊抗人AFP-IgG抗体-(BCPDA)n；
2)羊抗人AFP-IgG抗体-(BCPDA-Eu3+)n的制备：用含Eu3+10-6mol·L-1的Eu3+Tris-HCl缓冲液稀释羊抗人AFP-IgG抗体-(BCPDA)n溶液，将上述稀释溶液置于25℃恒温水浴中加热反应2h，制备成羊抗人AFP-IgG抗体-(BCPDA-Eu3+)n标记物；
B.人血清中AFP的测定：
1)抗体固相：将含抗人AFP单克隆抗体的0.1mol/L pH9.6NaHCO3缓冲溶液100ul分注于载体各微孔中，载体置4℃，24小时，用含0.05％Tween-20的0.05mol/L pH7.8Tris-HCl缓冲溶液的洗涤液洗涤4次；
2)AFP的时间分辨荧光免疫分析测定：用含有5％BSA-0.9％NaCl的pH值7.5的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液稀释人AFP制得AFP标准溶液，将此标准溶液和血清样品分别100ul注入上述已抗体固相的载体各微孔中，将载体置37℃，1小时后，用上述洗涤液洗涤4次，然后加入100ul的羊抗人AFP-IgG抗体-(BCPDA-Eu3+)n标记物，37℃，1小时后，用上述洗涤液洗涤4次，拍干，再加入0.3％十二烷基硫酸钠-50mmol/L Tris溶液的洗脱液，用振荡器振荡30分钟，然后测量荧光值；
或者用含铕螯合物-亲和素-生物素标记抗体，用双抗体夹心法测定血清前列腺特异性抗原，具体检测步骤是：
A.Eu3+-BCPDA的制备：用含Eu3+10-6mol·L-1的Tris-HCl缓冲液稀释水解的BCPDA溶液，将上述溶液置于37℃恒温水浴中加热反应2h，制得Eu3+-BCPDA；
B.Eu3+-BCPDA螯合物标记链亲合素SA的制备：
取1mg SA溶于0.5ml 0.05mol/L的pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入相当于12倍SA摩尔量的Eu3+-BCPDA螯合物，在4℃反应过夜，产物经SephadexG-50柱层析，0.05mol/L pH7.75的Tris-HCl-0.9％NaCl溶液淋洗，得纯化的Eu3+-BCPDA-SA，标记比值Eu3+/SA为10；
C.生物素标记羊抗人PSA的抗体制备：
1.0mg的羊抗人PSA抗体在4℃，24小时对3升蒸馏水溶液两次透析后，加入8.4mg的NaHCO3和3mg的NHS-LC-biotin，室温搅拌反应1小时后，4℃继续反应24小时，取反应液于4℃，24小时内对含有0.25gNaN3的0.1mol/L NaHCO3水溶液两次透析，于反应液中加入5mg的BSA和5mg的NaN3，反应液放置-20℃备用，但用于免疫测定时，用0.05mol/L pH7.75的Tris-HCl缓冲溶液稀释1000倍后使用；
D.人血清中PSA的测定：
1)抗体固相：将含抗人PSA单克隆抗体的0.1mol/L pH9.6NaHCO3缓冲溶液100ul分注于载体各微孔中，载体置4℃，24小时，用含0.05％Tween-20的0.05mol/L pH7.8Tris-HCl缓冲溶液的洗涤液洗涤4次；
2)人血清中PSA的时间分辨荧光免疫分析测定：用含有5％BSA-0.9％NaCl的pH值7.5的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液稀释人PSA制得PSA标准溶液，将此标准溶液和血清样品分别100ul注入上述已抗体固相的载体各微孔中，将载体置37℃，1小时后，用上述洗涤液洗涤4次，然后加入100ul含量5ug/ml的生物素标记的抗PSA抗体溶液，37℃，1小时，用上述洗涤液洗涤4次，再加入100ul Eu3+-BCPDA-SA溶液，37℃，1小时，用上述洗涤液洗涤4次，拍干，再加入0.3％十二烷基硫酸钠-50mmol/L Tris溶液的洗脱液，用振荡器振荡30分钟，然后测量荧光值。
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