CN1482459A - 三价铕－β－二酮荧光标记物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了三价铕－β－二酮荧光标记物及其应用，其中四齿β－二酮类配位体含有双β－二酮基取代邻二苯基苯骨架结构和可与生物分子直接键合的功能性取代基，其β－二酮部位和三价铕离子配位后可形成稳定的强荧光性铕配合物。该类配合物可通过其含有的功能性取代基与蛋白质、氨基酸、多肽、核酸、核苷酸、有机化合物等物质共价结合而标记这些物质，进而用于这些物质的时间分辨荧光测定。
Description
技术领域
本发明涉及三价铕与四齿β-二酮类配位体荧光标记物的制备方法及其在相关的时间分辨荧光生物检测技术领域的应用。
背景技术
作为生物试料(细胞组织、血液、尿等)中微量生理活性物质的测定方法，免疫测定法、DNA杂交测定法等已广泛应用于各种临床测定中。在这些测定中均需使用某种标记物来标记抗体、抗原、核苷酸、核酸等物质。作为标记物使用的物质包括放射性元素、酶、荧光化合物、化学发光化合物等。
使用放射性标记物的方法虽然灵敏度较高，但放射性标记物及其标记产品在储藏、运输、使用、废液处理等方面存在许多的不便和麻烦，并可导致环境污染，另外由于放射性标记物的自身衰减问题，导致其可保存时间较短。
使用酶标记物虽然没有上述问题，由于酶标记物的分子量太大，其活性极易受到温度、保存条件、酸度、杂离子、防腐剂等的影响，导致使用该类标记物的测定方法再现性较差。
使用有机荧光标记物虽然不存在上述两种标记物的问题，但使用这种标记物的测定方法在用于生物组织、血清等样品测定时，由于激发光的散乱光和样品产生的强本底荧光的影响，使这种方法的灵敏度较低，只适用于高浓度物质的测定。
为克服上述有机荧光标记物的问题，近年来使用稀土荧光配合物作为标记物的时间分辨荧光测定法已成功地开发出来，并广泛应用于各种测定中。稀土荧光配合物具有荧光寿命极长、Stokes位移大、荧光发光峰尖锐等特点，通过使用时间分辨荧光测定法，可非常有效地消除激发光的散乱光和样品产生的本底荧光对荧光测定的影响，从而极大地提高测定灵敏度。
现已报道的时间分辨荧光测定法及其存在的问题包括如下几个方面。
(1)PerkinElmer Life Sciences公司开发的溶解增强时间分辨荧光测定法(简称DELFIA测定法)(文献1，E.Soini and T.Lovgren，CRC.Crit.Rev.Anal.Chem.，1987，18，105-154.文献2，E.P.Diamandis and T.K.Christopoulos，Anal.Chem.，1990，62，1149A-1157A.文献3，I.Hemmila，J.Alloys Compd.，1995，225，480-485)。DELFIA测定法使用三价铕与N1-(p-异硫腈基苯基)-二乙基三胺四乙酸的配合物作为标记物来标记抗体、抗原等物质，当免疫反应结束后，由于该标记物是非荧光性铕配合物，所以在进行时间分辨荧光测定之前，必须要在反应体系中加入弱酸性的含有β-二酮类配位体、三辛基氧化膦及表面活性剂的所谓荧光增强溶液，使铕离子转化为强荧光性配合物后才能进行测定。DELFIA测定法的优点是灵敏度较高，但由于在该法的荧光测定的溶液中含有大过量的β-二酮类配位体及三辛基氧化膦，所以该测定法的最大缺点是极易受到测定环境、测定样品及测定用溶液等中的金属离子的污染，对测定操作环境及所用试剂要求极其严格。另外，由于该体系只能进行液相荧光测定，使其应用范围受到很大限制。
(2)加拿大的Diamandis等人开发的FIAgen测定法(文献4，E.P.Diamandis，Clin.Biochem.，1988，21，139-150.文献5，E.F.G.Dickson，A.Pollak and E.P.Diamandis，Pharmacol.Ther.，1995，66，207-235)。该测定法使用荧光性铕配合物4，7-二(氯磺酰基苯基)-1，10-啡罗啉-2，9-二羧酸(简称BCPDA)与Eu3+的配合物作为标记物来标识抗体、抗原等物质，当免疫反应结束后不需加入荧光增强溶液即可直接对免疫复合物进行时间分辨荧光测定。该法无DELFIA法的缺点，但由于BCPDA的铕配合物荧光较弱，其缺点是测定灵敏度较低。
(3)法国的Mathis等人开发的TRACE测定法(文献6，G.Mathis，Clin.Chem.，1995，41，1391-1397.文献7，G.Mathis，J.Clin.Ligand Assay，1997，20，141-147)。该法是同时使用铕荧光配合物三(联二吡啶)窝穴体与Eu3+的配合物和蓝藻蛋白(allophycocyanin)作为荧光标记物的均相时间分辨荧光测定法。其优点是不需使用固相材料、无结合型/游离型分离(B/F分离)操作及洗涤步骤、操作简单且易自动化，缺点是灵敏度较低并且试剂价格昂贵。
发明内容
本发明的目的是解决上述各种时间分辨荧光测定法中所存在的问题，提供一种可直接用于生物分子标记的三价铕-β-二酮荧光标记物。
本发明的另一目的是提供上述的荧光标记物的应用。
本发明的技术方案是：通过在4齿β-二酮类配位体上导入可直接与生物分子键合的功能性取代基，使之可直接用于生物分子的标记，带有配位体标记的生物分子再与三价铕离子反应，即可形成带有三价铕-β-二酮荧光配合物标记的生物分子，进而用于时间分辨荧光测定。由于三价铕-β-二酮配合物具有非常强的荧光性质(文献8，J.Yuan，K.Matsumoto，Anal.Sci.，1996，12，31-36)，所以三价铕-β-二酮配合物标记的生物分子用于荧光测定时不需使用任何荧光增强溶液，且测定灵敏度高于现有的时间分辨荧光测定法。
本发明所述4齿β-二酮类配位体的结构式为：
式中R为氯磺酰基(-SO2Cl)、异硫睛基(-NCS)、氨基(-NH2)、肼磺酰基(-SO2NHNH2)等可与生物分子键合的活性取代基，R1为CnH2n+1、CnF2n+1、C6H5或C6F5，其中，n＝1，2，3，4，5，即甲基、苯基、五氟苯基、三氟甲基(-CF3)、五氟乙基(-C2F5)、七氟丙基(-C3F7)和九氟丁基(-C4F9)等脂肪烃、芳香烃取代基。
本发明的荧光标记物能广泛用于各种蛋白质的标记，如抗体、抗原、亲合素、链亲合素、牛血清白蛋白(简称BSA)，半抗原-BSA结合体等。具体标记方法如下：
1)将待标记蛋白质溶于pH值9.0-9.5的碳酸氢钠缓冲溶液后，加入上述4齿β-二酮配位体，室温下搅拌反应1-2小时。
2)用Sephadex G-50柱层析方法除去反应液中未反应的β-二酮配位体。
3)收集已标记的蛋白质溶液，加入EuCl3溶液，其中β-二酮配位体∶铕离子的摩尔比＝1∶1-10，优选1∶1-2，最佳为β-二酮配位体∶铕离子＝1∶1，即制得所需的标记蛋白质，加入防腐剂如NaN3和蛋白质活性稳定剂如BSA，然后低温保存待用。
上述的荧光标记物在时间分辨荧光测定法中的应用，首先利用三价铕-β-二酮荧光标记物用于制备标记蛋白质，所述标记蛋白质与待测物反应，分离除去未反应的标记反应原料后，通过时间分辨荧光测定法测定反应生成物的荧光强度来测定待测物的浓度。
上述的时间分辨荧光测定法为时间分辨荧光免疫测定法，时间分辨荧光DNA杂交测定法，时间分辨荧光显微镜测定法，时间分辨荧光细胞活性测定法和时间分辨荧光生物芯片测定法。
上述的荧光标记物还可用于制备基于标记蛋白质的临床诊断用试剂及试剂盒。
与已有方法相比，本发明具有如下几方面的优点：
1)本发明的荧光标记物制备及用于标记蛋白质的反应及分离操作简单，成本低。
2)本发明的荧光标记物的荧光量子产率及摩尔吸光系数大，荧光寿命长，用于时间分辨荧光测定的灵敏度高。
3)本发明的荧光标记物标记的蛋白质分子用于荧光测定时不需使用任何荧光增强溶液，可在生化反应(如免疫反应)结束后直接进行时间分辨荧光测定。
4)不存在DELFIA测定法中存在的金属离子污染测定溶液的问题。
附图说明
图1是可与三价铕离子配位的4齿β-二酮类配位体的结构式。
图2是带有氯磺酰基的4齿β-二酮类配位体BHHCT的合成路线。
图3是BHHCT-Eu3+标记BSA溶液的荧光光谱，其浓度是2.0×10-6mol/L，溶剂是pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液。
图4是BHHCT-Eu3+标记BSA系列稀释溶液的时间分辨荧光测定结果。A线的稀释溶剂是1.0×10-5mol/L TOPO-0.05％SDS-0.1mol/L NaHCO3水溶液，B线的稀释溶剂是pH值9.1的0.1mol/L Tris-HCl水溶液。
图5是使用BHHCT-Eu3+标记抗体的时间分辨荧光免疫测定法测定人血清中甲胎蛋白(AFP)的工作曲线。
图6是使用BHHCT-Eu3+标记链亲合素-BSA结合体的时间分辨荧光免疫测定法测定人血清中免疫球蛋白E(IgE)的工作曲线。
图7是使用BHHCT-Eu3+标记链亲合素-BSA结合体的时间分辨荧光免疫测定法测定人血清中胰岛素的工作曲线。
图8是使用BHHCT-Eu3+标记链亲合素-BSA结合体的时间分辨荧光免疫测定法测定人血清中前列腺特异抗原(PSA)的工作曲线。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
4齿β-二酮类配位体的合成
(1)4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己二酮-6”-基)氯磺酰基-邻二苯基苯(简称BHHCT)的合成。BHHCT按图2所示合成路线合成，具体操作过程如下。
(i)4，4’-二乙酰基-邻二苯基苯(化合物I)的合成
外部冰-水浴冷却下，将14克无水三氯化铝和8.1克乙酰氯溶于100毫升干燥的二氯甲烷中，搅拌下滴加入11.5克邻二苯基苯溶于50毫升二氯甲烷的溶液。反应液在冰-水浴冷却下搅拌30分钟后，室温下搅拌24小时，然后再回馏2小时。将反应液倒入冰与盐酸的混合液中，蒸馏除去二氯甲烷后，过滤收集沉淀。沉淀用水充分洗涤后，用125毫升2-丁酮重结晶。得目标化合物12.3克(78％收率)。元素分析结果(％)，按C22H18O2计算值：C＝84.05，H＝5.77；实测值：C＝84.06，H＝5.87。1H NMR(氘代氯仿)测定结果：7.83，7.80(d，4H)，7.50-7.40(m，4H)，7.24，7.21(d，4H)，2.58(s，6H)。
(ii)4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己二酮-6”-基)-邻二苯基苯(化合物II)的合成
将3.0克甲醇钠、4.84克七氟代丁酸乙酯和3.14克4，4’-二乙酰基-邻二苯基苯加入到70毫升干燥乙醚中，室温下搅拌反应36小时。反应液倒入100毫升15％的硫酸水溶液中，搅拌15分钟后，蒸馏除去乙醚。过滤收集沉淀，沉淀用水充分洗涤后，将沉淀加热溶于200毫升乙醇中，过滤除去少量的不溶物。乙醇溶液减压浓缩至约10毫升后，放入冰箱中冷却结晶。过滤收集析出的结晶，真空干燥。得目标化合物5.1克(72％收率)。元素分析结果(％)，按C30H16F14O4计算值：C＝51.00，H＝2.28；实测值：C＝51.22，H＝2.61。1H NMR(氘代丙酮)测定结果：8.09，8.06(d，4H)，7.60-7.50(m，4H)，7.43，7.39(d，4H)，6.99(s，2H)。
(iii)BHHCT的合成
将2.82克化合物II加入到10毫升氯磺酸中，室温下搅拌反应7小时后，反应液慢慢滴加入搅拌下的300毫升冰-水溶液中，离心收集沉淀。沉淀用冰-水洗涤，过滤后真空干燥。得BHHCT 2.48克(75.6％收率)。元素分析结果(％)，按C30H17F14O7ClS(BHHCT.H2O)计算值：C＝43.78，H＝2.08；实测值：C＝43.96，H＝2.10。1H NMR(氘代丙酮)测定结果：8.32(dd，J，1.98，8.25Hz，1H)，8.23(d，J，1.98Hz，1H)，8.15(d，J，8.25Hz，4H)，8.00(d，J，8.25Hz，1H)，7.57-7.52(m，4H)，7.02(s，2H)。
(2)4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，-五氟-3”，5”-戊二酮-5”-基)氯磺酰基-邻二苯基苯的合成。
该化合物的合成反应原理与BHHCT的合成相同。首先用五氟代丙酸乙酯与 4，4’-二乙酰基-邻二苯基苯反应制备出 4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，-五氟-3”，5”-戊二酮-5”-基)-邻二苯基苯，产物经元素分析验证，元素分析结果(％)，按C28H16F10O4计算值：C＝55.46，H＝2.66；实测值：C＝55.71，H＝2.54。然后再将4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，-五氟-3”，5”-戊二酮-5”-基)-邻二苯基苯与氯磺酸反应即制得目标化合物，产物经1H NMR验证。1H NMR(氘代丙酮)测定结果：8.32(dd，J，1.98，8.25Hz，1H)，8.23(d，J，1.98Hz，1H)，8.14(d，J，8.25Hz，4H)，8.00(d，J，8.25Hz，1H)，7.57-7.52(m，4H)，7.02(s，2H)。
(3)4，4’-二(1”，1”，1”-三氟-2”，4”-丁二酮-4”-基)氯磺酰基-邻二苯基苯的合成。
该化合物的合成反应原理也与BHHCT的合成相同。首先用三氟代乙酸乙酯与4，4’-二乙酰基-邻二苯基苯反应制备出4，4’-二(1”，1”，1”-三氟-2”，4”-丁二酮-4”-基)-邻二苯基苯，产物经元素分析验证，元素分析结果(％)，按C26H16F6O4计算值：C＝61.60，H＝3.19；实测值：C＝61.68，H＝3.32。然后再将4，4’-二(1”，1”，1”-三氟-2”，4”-丁二酮-4”-基)-邻二苯基苯与氯磺酸反应即制得目标化合物，产物经1H NMR验证。1HNMR(氘代丙酮)测定结果：8.32(dd，J，1.98，8.25Hz，1H)，8.23(d，J，1.98Hz，1H)，8.12(d，J，8.25Hz，4H)，8.00(d，J，8.25Hz，1H)，7.57-7.52(m，4H)，6.95(s，2H)。
实施例2
使用BHHCT-Eu3+标记蛋白质
(1)使用BHHCT-Eu3+标记BSA
将5毫克BSA溶于1毫升pH值为9.3的0.1mol/L碳酸氢钠缓冲溶液中，搅拌下滴入3.5毫克BHHCT溶于200微升DMF的溶液。室温搅拌1小时后，用Sephadex G-50凝胶柱分离标记的BSA与未反应的BHHCT，用0.05mol/L的碳酸氢铵溶液展开。测定标记BSA溶液在330nm的吸光度，利用BHHCT在330nm的摩尔吸光系数(3.41×104cm-1mol-1L)计算标记BSA溶液中BHHCT的浓度，然后计算标记率(BHHCT浓度与BSA浓度的比值)。该法制得的标记BSA的标记率为35。溶液中加入与BHHCT等摩尔量的EuCl3后，即得到荧光标记BSA溶液BSA(BHHCT-Eu3+)35。溶液中加入NaN3(0.1％)后用盐酸调整pH值为6.5，然后放入冰箱中保存。
(2)使用BHHCT-Eu3+标记链亲合素(简称SA)
将含有4毫克BHHCT的0.2毫升乙醇溶液加入到33毫升含有5毫克SA的pH值9.1的0.1mol/L碳酸氢钠缓冲溶液中，室温搅拌1小时后，4℃下用4升含有0.25克NaN3的0.1mol/L NaHCO3溶液对溶液透析2次，每次24小时。通过测定标记后溶液在330nm的吸光度，测定出透析后溶液中SA的标识率为21，即所得产物为SA(BHHCT)21。加入与BHHCT等摩尔量的EuCl3后，再加入50毫克BSA，20毫克NaN3并用1mol/L盐酸调其pH值为6.5，放置-20℃冷冻保存。使用时用含有0.2％BSA-0.1％NaN3-0.9％NaCl的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液1)稀释500倍。
(3)利用BHHCT-Eu3+标记SA-BSA结合体
将5毫克SA和5毫克BSA同时溶解于2ml pH值7.1的0.1mol/L磷酸缓冲溶液中，并加入0.1毫升1％的戊二醛，4℃，24小时反应后，加入2毫克NaBH4，进一步反应2小时后，用0.9％NaCl水溶液，4℃，24小时透析2次。透析后溶液用纯水稀释至15毫升并加入126毫克NaHCO3，用1mol/L NaOH调其pH＝9.1后，加入含有10毫克BHHCT的0.3毫升无水乙醇溶液，室温反应1小时。反应后离心除去微量不溶物，溶液过柱分离，固定相为Sephadex G-50，流动相为0.05mol/L NH4HCO3。通过测定标记后溶液在330nm的吸光度，测定出标记蛋白质的组成为：SA(BSA)0.9(BHHCT)46。所收集的标记蛋白质中加入与BHHCT等摩尔量的EuCl3后，再加入50毫克BSA，20毫克NaN3并用1mol/L盐酸调其pH值为6.5，放置-20℃冷冻保存。使用时用缓冲溶液1稀释700倍。
(4)利用BHHCT-Eu3+标记山羊抗人AFP抗体
2毫升(0.5mg/ml)山羊抗人AFP抗体(Nippon Bio-Test Laboratories，Inc.)用3升0.9％NaCl水溶液在4℃，24小时2次透析后，稀释到10毫升，加入84毫克NaHCO3并用0.1mol/L NaOH调其pH值为9.1，加入含有3毫克BHHCT的180微升无水乙醇溶液，室温搅拌1小时后，用SephadexG-50凝胶柱分离，分离条件同上。所收集标记蛋白质部分加入与BHHCT等摩尔量的EuCl3后，再加入30毫克BSA，20毫克NaN3并用1mol/L盐酸调其pH值为6.5，放置-20℃冷冻保存。使用时用缓冲溶液1稀释600倍。
实施例3
BHHCT-Eu3+标记BSA溶液的荧光性质测定结果
如图3所示，BHHCT-Eu3+的最大荧光激发波长在330nm，最大发光波长是614nm，其发光峰形状为铕配合物特征的尖锐形发光峰。使用BHHCT-Eu3+标记BSA溶液测得BHHCT-Eu3+在pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液中的荧光寿命为380微秒，荧光量子产率为0.27，在含有1.0×10-5mol/L三辛基氧化磷及0.05％十二烷基磺酸钠的0.1mol/L碳酸钠溶液中的荧光寿命为641微秒，荧光量子产率为0.76。
BHHCT-Eu3+标记BSA系列稀释溶液的时间分辨荧光测定结果如图4所示，用本底信号标准偏差的2倍计算最低检出下限，得BSA(BHHCT-Eu3+)35的最低检出下限为：在1.0×10-5mol/L TOPO-0.05％SDS-0.1mol/L NaHCO3水溶液中，6.5×10-15mol/L；在pH值9.1的0.1mol/L Tris-HCl水溶液中，2.4×10-14mol/L。说明使用BHHCT-Eu3+作为标记物的时间分辨荧光测定具有非常高的灵敏度。
实施例4
使用BHHCT-Eu3+标记抗体的时间分辨荧光免疫测定法测定人血清中的甲胎蛋白(简称AFP)
1)96微孔板的包被
将含抗人AFP单克隆抗体(Biostride，Inc.，5g/ml)的0.1mol/L，pH值9.6的NaHCO3缓冲溶液100l分注于96微孔板的各孔中，4℃，24小时包被后，用含有0.05％Tween 20的0.05mol/L，pH值7.8的Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液2)洗两次，再用0.05mol/L，pH值7.8的Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液3)洗1次，此包被后的微孔板-20℃下可保存1个月以上。
2)人血清中AFP的免疫分析测定
用含有5％BSA-0.9％NaCl-0.1％NaN3的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液4)稀释人AFP(Dakopatts，Denmark)制得AFP标准溶液。将此标准溶液和血清样品分别50l注入上述包被后的微孔板的各孔中，37℃，1小时反应后，用上述缓冲溶液2(2回)，缓冲溶液3(1回)洗净，然后加入50l BHHCT-Eu3+标记的抗AFP抗体溶液。37℃，1小时反应后，用pH值9.1，含有0.05％Tween 20的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液5)洗4次，然后进行固相时间分辨荧光测定。测定用仪器为WALLAC VICTOR 1420多标记计数仪，测定条件为：激发波长，340nm；检测波长，615nm；迟延时间，0.2ms；窗口时间，0.4ms；循环时间，1.0ms。
3)测定结果
如图5所示，用零浓度时的荧光信号(本底)的标准偏差(SD)的3倍计算AFP测定的最低检出下限，得本法的最低检出下限为0.07ng/ml。工作曲线上限可达100ng/ml。
表1给出了该法测定血清样品中AFP的精密度。由表可见，该法的相对标准偏差(CV％)不大于8％，平均小于5％，说明该法具有较高的精密度。
表1人血清样品中AFP测定的精密度
| 浓度(ng/ml) | SD(n＝4) | CV(％) |
| 1.682.263.389.3018.439.6 | 0.120.0560.220.440.941.53 | 7.142.496.374.725.143.87 |
表2给出了该法测定AFP血清样品的回收率，其在95-105％范围内，满足一般微量分析的要求。
表2标准AFP溶液加入人血清样品中的回收率测定结果
| 加入量(ng/ml) | 测得量(ng/ml) | 回收率(％) |
| 0.005.002.500.0050.025.05.00 | 7.6012.410.016.967.540.821.9 | ----96.096.0----101.295.6100.0 |
实施例5
使用BHHCT-Eu3+标记SA-BSA的时间分辨荧光免疫测定法测定人血清中的免疫球蛋白E(简称IgE)
1)96微孔板的包被
将山羊抗人IgE多克隆抗体(Vector Laboratories)用0.1mol/L，pH值9.6的NaHCO3缓冲溶液稀释后(10g/ml)的抗体溶液100l分注于96微孔板，4℃，24小时包被后，用缓冲溶液2洗两次，再用缓冲溶液3洗1次，此包被后的微孔板-20℃下可保存1个月以上。
2)IgE的免疫分析测定
用缓冲溶液4稀释人IgE(Behring，Germany)制得IgE标准溶液。将此标准溶液和血清样品分别50l注入上述包被后的微孔板，37℃，1小时反应后，用上述缓冲溶液2(2回)，缓冲溶液3(1回)洗净。加入50l用缓冲溶液1,400倍稀释的兔抗人IgE抗体(Nordic ImmunologicLaboratories)溶液，37℃1小时反应后，用上述缓冲溶液2(2回)，缓冲溶液3(1回)洗净后，加入50l用缓冲溶液1,500倍稀释的生物素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体(Vector Laboratories，Inc.，1.5mg/ml)，37℃，1小时反应后，用上述缓冲溶液2(2回)，缓冲溶液3(1回)洗净后，再加入50l的BHHCT-Eu3+标记SA-BSA溶液，37℃，1小时反应后，用缓冲溶液5洗4次，然后进行固相时间分辨荧光测定。
3)测定结果
如图6所示，用零浓度时的荧光信号(本底)的标准偏差(SD)的3倍计算AFP测定的最低检出下限，得本法的最低检出下限为1.5×10-3IU/ml(3.6pg/ml)，与已报道的放射性免疫测定法、酶标记免疫测定法相比，本发明的方法其测定灵敏度要比已有的方法高2-3个数量级。
表3给出了该法测定血清样品中IgE的精密度。由表可见，该法的相对标准偏差不大于7％，平均小于5％，说明该法具有较高的精密度。
表3人血清样品中IgE测定的精密度
| 浓度(IU/ml) | SD(n＝4) | CV(％) |
| 0.722.386.3627.432.3127.7 | 0.0310.140.0741.161.478.32 | 4.456.001.164.254.566.52 |
表4给出了该法测定IgE血清样品的添加回收率，其范围在85-105％内，满足一般微量分析的要求。
表4标准IgE溶液加入血清样品中的回收率测定结果
| 加入量(IU/ml) | 测得量(IU/ml) | 回收率(％) |
| 0.002.400.002.400.003.470.003.47 | 0.552.650.943.0214.017.523.326.7 | ----87.5----86.8----102.0----99.0 |
实施例6
使用BHHCT-Eu3+标记SA-BSA的时间分辨荧光免疫测定法测定人血清中的胰岛素(简称Ins)
1)生物素标记小鼠抗人Ins抗体的制备
1.3ml的小鼠抗人Ins抗体(0.3mg/1.3ml，International ReagentsCo.)在4℃，24小时对3L水两次透析后，加入9.4mg的NaHCO3和3mg的NHS-LC-biotin(Pierce Chemical Co.)，室温搅拌1小时后，4℃下24小时放置。反应液在4℃，24小时对3L含有0.25g NaN3的0.1mol/L NaHCO3水溶液两次透析后加入5mg的BSA和5mg的NaN3，放置-20℃备用。当用于免疫测定时，用缓冲溶液1稀释200倍后使用。
2)96微孔板的包被
将小鼠抗人Ins单克隆抗体(International Reagents Co.)用0.1mol/L，pH值9.6的NaHCO3缓冲溶液稀释后(10μg/ml)的抗体溶液50μl分注于96微孔板，4℃，24小时包被后，用缓冲溶液2洗两次，再用缓冲溶液3洗1次，此包被后的微孔板-20℃下可保存1个月以上。
3)Ins的免疫分析测定
用缓冲溶液4稀释人Ins(Sigma)制得Ins标准溶液。将此标准溶液分别50μl注入上述包被后的微孔板，37℃，1.5小时反应后，用上述缓冲溶液2(2回)，缓冲溶液3(1回)洗净。加入50μl生物素标记的用小鼠抗人Ins单克隆抗体，37℃，1小时反应后，用上述缓冲溶液2(2回)，缓冲溶液3(1回)洗净后，再加入50μl的BHHCT-Eu3+标记SA-BSA溶液，37℃，1小时反应后，用缓冲溶液5洗4次，然后进行固相时间分辨荧光测定。
4)测定结果
如图7所示，用零浓度时的荧光信号(本底)的标准偏差(SD)的3倍计算Ins测定的最低检出下限，得本法的最低检出下限为31pg/ml。
实施例7
使用BHHCT-Eu3+标记SA-BSA的时间分辨荧光免疫测定法测定人血清中的前列腺特异抗原(简称PSA)
1)生物素标记山羊抗人PSA抗体的制备
1.0ml的山羊抗人PSA抗体(0.5mg/ml，OEM Concepts Co.)在4℃，24小时对3L水两次透析后，加入8.4mg的NaHCO3和3mg的NHS-LC-biotin(Pierce Chemical Co.)，室温搅拌1小时后，4℃下24小时放置。反应液在4℃，24小时对3L含有0.25g NaN3的0.1mol/L NaHCO3水溶液两次透析后加入5mg的BSA和5mg的NaN3，放置-20℃备用。当用于免疫测定时，用缓冲溶液1稀释300倍后使用。
2)96微孔板的包被
将小鼠抗人PSA单克隆抗体(OEM Concepts Co.)用0.1mol/L，pH值9.6的NaHCO3缓冲溶液稀释后(10μg/ml)的抗体溶液50μl分注于96微孔板，4℃，24小时包被后，用缓冲溶液2洗两次，再用缓冲溶液3洗1次，此包被后的微孔板-20℃下可保存1个月以上。
3)PSA的免疫分析测定
用缓冲溶液4稀释人PSA(Biogenesis Ltd.)制得PSA标准溶液。将此标准溶液分别50l注入上述包被后的微孔板，37℃，1.5小时反应后，用上述缓冲溶液2(2回)，缓冲溶液3(1回)洗净。加入50μl生物素标记的山羊抗人PSA抗体，37℃，1小时反应后，用上述缓冲溶液2(2回)，缓冲溶液3(1回)洗净后，再加入50μl的BHHCT-Eu3+标记SA-BSA溶液，37℃，1小时反应后，用缓冲溶液5洗4次，然后进行固相时间分辨荧光测定。
4)测定结果
如图8所示，用零浓度时的荧光信号(本底)的标准偏差(SD)的3倍计算PSA测定的最低检出下限，得本法的最低检出下限为6pg/ml。
Claims (8)
1.一种三价铕-β-二酮荧光标记物，其特征在于：以三价铕离子与含有可直接与生物分子键合的功能性取代基的4齿β-二酮类配位体形成的荧光配合物，其中所述配位体的结构式为：
式中R为可与生物分子键合的活性取代基，亦即氯磺酰基、异硫睛基、氨基或肼磺酰基；R1为CnH2n+1、CnF2n+1、C6H5或C6F5，其中，n＝1，2，3，4，5。
2.权利要求1所述的三价铕-β-二酮荧光标记物用于制备各种标记蛋白质，其制备方法如下：
1)将待标记蛋白质溶于pH值9.0-9.5的碳酸氢钠缓冲溶液后，加入4齿β-二酮配位体，室温下搅拌反应1-2小时；
2)用透析或柱层析方法除去反应液中未反应的β-二酮配位体；
3)收集已标记的蛋白质溶液，加入EuCl3溶液，其中β-二酮配位体∶铕离子的摩尔比＝1∶1-10，即制得所需的标记蛋白质，加入防腐剂和蛋白质活性稳定剂，然后低温保存待用。
3.如权利要求2所述的三价铕-β-二酮荧光标记物用于制备各种标记蛋白质的制备方法，其特征在于所述的β-二酮配位体∶铕离子＝1∶1-2。
4.如权利要求3所述的三价铕-β-二酮荧光标记物用于制备各种标记蛋白质的制备方法，其特征在于所述的β-二酮配位体∶铕离子＝1∶1。
5.权利要求1所述的三价铕-β-二酮荧光标记物在时间分辨荧光测定法中的应用，其特征在于：首先利用三价铕-β-二酮荧光标记物用于制备标记蛋白质，所述标记蛋白质与待测物反应，分离除去未反应的标记反应原料后，通过时间分辨荧光测定法测定反应生成物的荧光强度来测定待测物的浓度。
6.如权利要求5所述的三价铕-β-二酮荧光标记物在时间分辨荧光测定法中的应用，其特征在于：其中的时间分辨荧光测定法为时间分辨荧光免疫测定法，时间分辨荧光DNA杂交测定法，时间分辨荧光显微镜测定法，时间分辨荧光细胞活性测定法或时间分辨荧光生物芯片测定法。
7.权利要求1所述的三价铕-β-二酮荧光标记物用于制备基于标记蛋白质的临床诊断用试剂及试剂盒。
8.如权利要求2-7中任意一个所述的三价铕-β-二酮荧光标记物的应用，其特征在于所述的蛋白质为抗体、抗原、亲合素、链亲合素、牛血清白蛋白或半抗原-BSA结合体。
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