JPS6176464A - 化学ルミネッセンス化合物およびこれを用いる発光計量免疫検定法 - Google Patents
化学ルミネッセンス化合物およびこれを用いる発光計量免疫検定法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は免疫検定方法の分野に属し、特に化学ルミネッ
センスによる免疫学的物質または他の分析物質（ａｎｍ
ｌｙｔｅ）を検出し得る化合物に関する。
センスによる免疫学的物質または他の分析物質（ａｎｍ
ｌｙｔｅ）を検出し得る化合物に関する。
免疫検定は医学および生物学の分野において広く用いら
れる分析的技法である。本明細書中で用いられる用語「
免疫検定」は、標識を用いる生物学的物質の検出、位置
の発見、または定量化を包含する。一般に標識、たとえ
ば放射性同位体は対象物質の分子に取付けられる。その
後、標識分子の存在は適切な手法によシ検出可能である
。
れる分析的技法である。本明細書中で用いられる用語「
免疫検定」は、標識を用いる生物学的物質の検出、位置
の発見、または定量化を包含する。一般に標識、たとえ
ば放射性同位体は対象物質の分子に取付けられる。その
後、標識分子の存在は適切な手法によシ検出可能である
。
通常の用途においては各種形式の免疫検定がある。免疫
検定の一形式において、試料、たとえば未知物質と対象
とする標識された抗原の双方を含有する溶液をその抗原
に特異性を有する抗体と共に培養する。もし、未知物質
もまた、抗原を含んでいるとすれば、標識および非標識
抗原の双方が抗体上の結合部位に関して競合する。この
抗原は固体支持体、たとえば試験管、ガラスピーズ、ラ
テックス粒子等の上に固定することができる。培養には
分離工程が引続くが、この工程において支持体上の抗体
に結合している抗原か、結合していない抗原から分離さ
れる。結合した標識抗原量の測定によって、類似の非標
識抗原の存在および／または量を決定することが可能で
ある。すなわち、未知物質中の抗原の濃度が高くなれば
なる程、標識抗原により占有される結合部位は少なくな
る。
検定の一形式において、試料、たとえば未知物質と対象
とする標識された抗原の双方を含有する溶液をその抗原
に特異性を有する抗体と共に培養する。もし、未知物質
もまた、抗原を含んでいるとすれば、標識および非標識
抗原の双方が抗体上の結合部位に関して競合する。この
抗原は固体支持体、たとえば試験管、ガラスピーズ、ラ
テックス粒子等の上に固定することができる。培養には
分離工程が引続くが、この工程において支持体上の抗体
に結合している抗原か、結合していない抗原から分離さ
れる。結合した標識抗原量の測定によって、類似の非標
識抗原の存在および／または量を決定することが可能で
ある。すなわち、未知物質中の抗原の濃度が高くなれば
なる程、標識抗原により占有される結合部位は少なくな
る。
従って、標識抗原の検出レベル（たとえば、放射能の１
分間の計数値）は非標識抗原の濃度の逆関数である。
分間の計数値）は非標識抗原の濃度の逆関数である。
免症検定の第２のタイプはサンドイツチ免疫検定として
知られている。この方法においては、抗原ではなくて抗
体が標識される。未知物質を含む試料は、固定された抗
体と共に培養される。試料中に存在するとすれば、その
抗原は抗体と結合することになる。インキュベーション
後、非結合物質は分離工程により除去される。標識抗体
の溶液による第２のインキュベーションに際して、結合
された抗原は固定された抗体と抗原に付着する標識抗体
との間にサンドイツチされる。第２の分離後、標識抗体
の量が測定される。標識抗体の検出は抗原の存在を示す
。
知られている。この方法においては、抗原ではなくて抗
体が標識される。未知物質を含む試料は、固定された抗
体と共に培養される。試料中に存在するとすれば、その
抗原は抗体と結合することになる。インキュベーション
後、非結合物質は分離工程により除去される。標識抗体
の溶液による第２のインキュベーションに際して、結合
された抗原は固定された抗体と抗原に付着する標識抗体
との間にサンドイツチされる。第２の分離後、標識抗体
の量が測定される。標識抗体の検出は抗原の存在を示す
。
通常、最も一般的に用いられるタイプの標識は放射性物
質、たとえば Ｉであシ、これは容易かつ正確に検出可
能なものである。しかし、放射能によシ標識された物質
はしばしば短い貯蔵寿命を有し、これは標識の放射能壊
変および放射線が標識分子を分解するという双方の理由
によるものである。更に放射性物質の取扱いは実験室の
人員に対し危険を伴う。
質、たとえば Ｉであシ、これは容易かつ正確に検出可
能なものである。しかし、放射能によシ標識された物質
はしばしば短い貯蔵寿命を有し、これは標識の放射能壊
変および放射線が標識分子を分解するという双方の理由
によるものである。更に放射性物質の取扱いは実験室の
人員に対し危険を伴う。
本発明は、慣用およびサンドイツチ検定技法の双方にお
ける発光計量免疫検定法（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｌｃｉ
ｍｍｕｎｏａａｓａｙ 、以下ｒＬＩＡＪと称する）に
おいて標識として有用である新規な化合物に向けられて
いる。放射性免疫検定とは異な、り、ＬＩＡは放射性物
質を使用しない。むしろ、抗原または抗体に付着される
標識は化学ルミネッセンス化合物、すなわち、光を発生
する反応（通常、酸化）を行うことのできるものである
。この光の放射は適切な装置により １ｌｌ１１定され
、そして成る場合には光の強さは標識物質の量を示す。
ける発光計量免疫検定法（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｌｃｉ
ｍｍｕｎｏａａｓａｙ 、以下ｒＬＩＡＪと称する）に
おいて標識として有用である新規な化合物に向けられて
いる。放射性免疫検定とは異な、り、ＬＩＡは放射性物
質を使用しない。むしろ、抗原または抗体に付着される
標識は化学ルミネッセンス化合物、すなわち、光を発生
する反応（通常、酸化）を行うことのできるものである
。この光の放射は適切な装置により １ｌｌ１１定され
、そして成る場合には光の強さは標識物質の量を示す。
免疫検定に用いるのに適した既知の化学ルミネッセンス
物質には、ルミノール（５−アミノ−２゜３−ジヒドロ
フタラジン−１，４−ジオン）、イソルミノール（６−
アミノ−２，３−ジヒドロフタラジン−１，４−ジオン
）および各種のアクリジニウムエステルがある。
物質には、ルミノール（５−アミノ−２゜３−ジヒドロ
フタラジン−１，４−ジオン）、イソルミノール（６−
アミノ−２，３−ジヒドロフタラジン−１，４−ジオン
）および各種のアクリジニウムエステルがある。
本発明は、新規なフエナントリジニウム化合物および発
光計量免症検定におけるそれらの利用に関する。特に本
発明の化合物は式： （但し、Ｒは炭素数１乃至５のアルキル基、Ｘはスルフ
ェート、アルキルスルフェート、ハロスルホネートおよ
びハロゲン化物から成る群から選択されるアニオン、そ
してＹはアミノ基、カルボキシル基、または対象分析物
質またはたんばく質中に通例見出されるその他の基と結
合可能な化学的部分である）で示されるフェニル−１Ｏ
−メチルフエナントリジニウムー９−カルボキシレート
誘導体の塩類である。
光計量免症検定におけるそれらの利用に関する。特に本
発明の化合物は式： （但し、Ｒは炭素数１乃至５のアルキル基、Ｘはスルフ
ェート、アルキルスルフェート、ハロスルホネートおよ
びハロゲン化物から成る群から選択されるアニオン、そ
してＹはアミノ基、カルボキシル基、または対象分析物
質またはたんばく質中に通例見出されるその他の基と結
合可能な化学的部分である）で示されるフェニル−１Ｏ
−メチルフエナントリジニウムー９−カルボキシレート
誘導体の塩類である。
本発明の他の態様において、免役検定は上記化合物およ
び抗体または抗原の混合物を用いて行われる。一実施態
様において、免疫検定法は試料溶液により固定された、
抗原に対し特異性を有する抗体を培養する工程と、固定
された抗体と、もし存在すれば、結合された抗原とを標
識抗体の溶液と共に培養して固定サンドイツチを形成す
る工程と、標識抗体の溶液を固定サンドイツチから分離
する工程と、固定サンドイツチ中の標識抗体を酸化剤と
反応させて光の放射を行わせる工程と、放射された光量
を測定して抗原の存在を決定する工程とを含み、かつ前
記標識抗体が抗体と、式：（但し、Ｒは炭素数１乃至５
のアルキル基、Ｘはスルフェート、アルキルスルフェー
ト、ハロスルホネートおよびハロゲン化物から成る群か
ら選択されるアニオン、そしてＹはアミン基、カルボキ
シル基、あるいは問題のアナライトまたはたんばく質中
に通例見出されるその他の基と結合可能な化学的部分で
ある）で示される化学ルミネッセンス化合物との配合体
とからなっている方法である。
び抗体または抗原の混合物を用いて行われる。一実施態
様において、免疫検定法は試料溶液により固定された、
抗原に対し特異性を有する抗体を培養する工程と、固定
された抗体と、もし存在すれば、結合された抗原とを標
識抗体の溶液と共に培養して固定サンドイツチを形成す
る工程と、標識抗体の溶液を固定サンドイツチから分離
する工程と、固定サンドイツチ中の標識抗体を酸化剤と
反応させて光の放射を行わせる工程と、放射された光量
を測定して抗原の存在を決定する工程とを含み、かつ前
記標識抗体が抗体と、式：（但し、Ｒは炭素数１乃至５
のアルキル基、Ｘはスルフェート、アルキルスルフェー
ト、ハロスルホネートおよびハロゲン化物から成る群か
ら選択されるアニオン、そしてＹはアミン基、カルボキ
シル基、あるいは問題のアナライトまたはたんばく質中
に通例見出されるその他の基と結合可能な化学的部分で
ある）で示される化学ルミネッセンス化合物との配合体
とからなっている方法である。
別の免疫検定法は、試料溶液で固定された抗体および標
識抗原を培養する工程と、結合抗原を非結合抗原から分
離する工程と、結合標識抗原を酸化剤と反応させて光の
放射を行わせる工程と、放射された光量を測定して非標
識抗原の存在を決定する工程とを含み、前記標識抗体が
抗原と、式：（但し、Ｒは炭素数１乃至５のアルキル基
、Ｘはスルフェート、アルキルスルフェート、）１０ス
ルホネートおよびハロゲン化物から成る群から選択され
るアニオン、セしてＹはアミノ基、カルボキシル基、あ
るいは問題のアナライトまたはたんばく質中に通例見出
されるその他の基と結合可能な化学的部分である）で示
される化学ルミネッセンス化合物との配合体からなって
いる方法である。
識抗原を培養する工程と、結合抗原を非結合抗原から分
離する工程と、結合標識抗原を酸化剤と反応させて光の
放射を行わせる工程と、放射された光量を測定して非標
識抗原の存在を決定する工程とを含み、前記標識抗体が
抗原と、式：（但し、Ｒは炭素数１乃至５のアルキル基
、Ｘはスルフェート、アルキルスルフェート、）１０ス
ルホネートおよびハロゲン化物から成る群から選択され
るアニオン、セしてＹはアミノ基、カルボキシル基、あ
るいは問題のアナライトまたはたんばく質中に通例見出
されるその他の基と結合可能な化学的部分である）で示
される化学ルミネッセンス化合物との配合体からなって
いる方法である。
本明細書中で用いられる用語「抗原」は、試料中の検出
しようとする凡ゆる物質を包含するものであり、この物
質に対し特異性を有する抗体を提供することを条件とす
る。従って、本明細書中で用いられる用語は、それら自
体免疫性でない物質を包含するが、それらはこの物質に
対し特異性を有する抗体の形成をもたらすために免疫性
坦体分子と連結することによシ免疫性にし得るものであ
る。たとえば、体内に天然に存在するが、それら自体免
疫性ではないステロイドホルモンは、本説明の目的に関
して抗原と考えられるものである。
しようとする凡ゆる物質を包含するものであり、この物
質に対し特異性を有する抗体を提供することを条件とす
る。従って、本明細書中で用いられる用語は、それら自
体免疫性でない物質を包含するが、それらはこの物質に
対し特異性を有する抗体の形成をもたらすために免疫性
坦体分子と連結することによシ免疫性にし得るものであ
る。たとえば、体内に天然に存在するが、それら自体免
疫性ではないステロイドホルモンは、本説明の目的に関
して抗原と考えられるものである。
それはステロイドホルモンに特異性を有する抗体をもた
らすだめの技法が利用可能だからである。
らすだめの技法が利用可能だからである。
本発明の化学ルミネッセンス化合物は下記の式：（但し
、Ｒは炭素数１乃至５のアルキル基、Ｘはスルフェート
、アルキルスルフェート、ハロスルホネートおよびハロ
ゲン化物から成る群から選択されるアニオン、そしてＹ
はアミノ基、カルボキシル基、または対象の分析物質ま
たはたんばく質中に通例見出されるその他の基と結合可
能な化学的部分である）で表わされる。Ｙは、たとえば
アはン、アルデヒド、カルボン酸、Ｎ−マレイミド、ま
たはＮ−スクシンイミジル基であればよい。好ましくは
Ｙはスクシンイミジロキシカルボニルまたはスクシンイ
ミジロキシ力ルポニルアルキルであって、この場合アル
キル基の炭素数が１乃至５であるものである。望ましく
はＸは７１０スルホネ−４であり、そして好ましくはフ
ルオロスルホネートである。
、Ｒは炭素数１乃至５のアルキル基、Ｘはスルフェート
、アルキルスルフェート、ハロスルホネートおよびハロ
ゲン化物から成る群から選択されるアニオン、そしてＹ
はアミノ基、カルボキシル基、または対象の分析物質ま
たはたんばく質中に通例見出されるその他の基と結合可
能な化学的部分である）で表わされる。Ｙは、たとえば
アはン、アルデヒド、カルボン酸、Ｎ−マレイミド、ま
たはＮ−スクシンイミジル基であればよい。好ましくは
Ｙはスクシンイミジロキシカルボニルまたはスクシンイ
ミジロキシ力ルポニルアルキルであって、この場合アル
キル基の炭素数が１乃至５であるものである。望ましく
はＸは７１０スルホネ−４であり、そして好ましくはフ
ルオロスルホネートである。
本発明の化学ルミネッセンス化合物は、中間化合物を生
成する一連の反応を用いてフエナントリジンから合成す
ることができる。反応模式図を以下に略述するが、Ｙお
よびＸは好ましい化合物であるものとする。
成する一連の反応を用いてフエナントリジンから合成す
ることができる。反応模式図を以下に略述するが、Ｙお
よびＸは好ましい化合物であるものとする。
Ｉ ｎ
ＩＩＩ一般に、フエナントリジン（Ｉ）はシアン化
水素酸および塩化ベンゾイルと反応させて、（■）式で
示Ｇれるシアノペンジイルヒドロツェナ／ ） ＩＪレ
ジン合物を生成させる。（ＩＩ）式の化合物は硫酸およ
び硝酸ナトリウムと反応させて（ＩＩＩ）式で示される
フエナントリジンカルボン酸化合物を生成させる。この
酸を対応する酸塩化物、すなわち式（ＩＶ）の化合物に
転換させ、そしてスクシンイミジロキシカルボニルアル
キルフェノール（Ｖ）と反応させて式（Ｖｌ）で示され
るフエナントリジンエステル化合物を生成させる。これ
に引続いて、アルキルハロスルホネート化合物との反応
による塩への転換を行い、式（■）で示されるフエナン
トリジニウムエステル塩、すなわち本発明の化合物を生
成させる。
ＩＩＩ一般に、フエナントリジン（Ｉ）はシアン化
水素酸および塩化ベンゾイルと反応させて、（■）式で
示Ｇれるシアノペンジイルヒドロツェナ／ ） ＩＪレ
ジン合物を生成させる。（ＩＩ）式の化合物は硫酸およ
び硝酸ナトリウムと反応させて（ＩＩＩ）式で示される
フエナントリジンカルボン酸化合物を生成させる。この
酸を対応する酸塩化物、すなわち式（ＩＶ）の化合物に
転換させ、そしてスクシンイミジロキシカルボニルアル
キルフェノール（Ｖ）と反応させて式（Ｖｌ）で示され
るフエナントリジンエステル化合物を生成させる。これ
に引続いて、アルキルハロスルホネート化合物との反応
による塩への転換を行い、式（■）で示されるフエナン
トリジニウムエステル塩、すなわち本発明の化合物を生
成させる。
免疫検定に用いるために、本発明の化学ルミネッセンス
化合物は、Ｎ−スクシンイミジル普たけ他の基を介して
抗体または抗原に結合される。これらの抗体は従来の抗
血清タイプ抗体であってもよいし、あるいは所望によシ
それらは単一クローン（ｍｏｎｏｅｌｏ’ｎａｌ）
の抗体であってもよい。本発明の化学ルミネッセンス化
合物に関連して有用である抗体の生成方法は当業者にと
って周知である。
化合物は、Ｎ−スクシンイミジル普たけ他の基を介して
抗体または抗原に結合される。これらの抗体は従来の抗
血清タイプ抗体であってもよいし、あるいは所望によシ
それらは単一クローン（ｍｏｎｏｅｌｏ’ｎａｌ）
の抗体であってもよい。本発明の化学ルミネッセンス化
合物に関連して有用である抗体の生成方法は当業者にと
って周知である。
化学ルミネッセンス化合物と抗体または抗原との配合体
は、本発明の化学ルミネッセンス化合物と抗体または抗
原とを緩衝液中で室温において数分（通常約１５分）間
混合することにより調製される。このような条件下で、
ペプチド結合がフエナントリジニウムエステルと抗体ま
たは抗原との間に形成される。
は、本発明の化学ルミネッセンス化合物と抗体または抗
原とを緩衝液中で室温において数分（通常約１５分）間
混合することにより調製される。このような条件下で、
ペプチド結合がフエナントリジニウムエステルと抗体ま
たは抗原との間に形成される。
本発明の好ましい実施態様では、化学ルミネッセンス化
合物で標識した抗体はサンドイツチタイプの免疫検定法
において用いられる。標識抗体または抗原を用いる免疫
検定の遂行に際して、対象の抗原に特異性を示す抗体は
通常固体支持体、たとえば試験管壁、ガラスピーズ、ポ
リスチレンビーズ、セファロース（ｍ＠ｐｈａｒｏｓｅ
） 、ラテックスまたは凡ゆる不活性固体マトリクス上
に固定される。
合物で標識した抗体はサンドイツチタイプの免疫検定法
において用いられる。標識抗体または抗原を用いる免疫
検定の遂行に際して、対象の抗原に特異性を示す抗体は
通常固体支持体、たとえば試験管壁、ガラスピーズ、ポ
リスチレンビーズ、セファロース（ｍ＠ｐｈａｒｏｓｅ
） 、ラテックスまたは凡ゆる不活性固体マトリクス上
に固定される。
抗体は固体支持体表面上に簡単に吸着させることもでき
るし、あるいは共有結合によりマトリクスに結合させる
ことも可能である。
るし、あるいは共有結合によりマトリクスに結合させる
ことも可能である。
本発明のサンドイッチタイプ免役検定に際して、試験す
べき試料は、固体支持体上に固定された抗体を含有する
試験管もしくはウェル内に配置される。たとえば、抗体
を試験管またはウェルに固定してもよいし、或−は容器
に、そのビーズ表面に抗体を固定したポリスチレンまた
はガラスピーズを収容させてもよい。一般に緩衝溶液の
形態の試料を、固定した抗体と共に、試料中に存在する
かも知れない抗原を固定抗体に結合させるに足る時間に
わたり培養する。培養時間は特定の抗原、試料の希釈度
、温度等に幾分影４ＩｉＩされて変動するかも知れない
が、一般に約１時間で結合を生じさせるに十分である。
べき試料は、固体支持体上に固定された抗体を含有する
試験管もしくはウェル内に配置される。たとえば、抗体
を試験管またはウェルに固定してもよいし、或−は容器
に、そのビーズ表面に抗体を固定したポリスチレンまた
はガラスピーズを収容させてもよい。一般に緩衝溶液の
形態の試料を、固定した抗体と共に、試料中に存在する
かも知れない抗原を固定抗体に結合させるに足る時間に
わたり培養する。培養時間は特定の抗原、試料の希釈度
、温度等に幾分影４ＩｉＩされて変動するかも知れない
が、一般に約１時間で結合を生じさせるに十分である。
この培養は温度約０℃乃至４５℃、そして好ましくは略
周囲温度で行うことができる。
周囲温度で行うことができる。
次に、この試料金兄ゆる都合の良い手段、たとえば試験
管またはウェルからの吸引によシ固定した抗体および結
合抗原から分離する。試験管を適切な溶液で洗浄した後
、本発明の化学ルミネッセンス化合物で標識した抗体を
含有する緩衝液を試験管またはウェルに配置し、そして
標識抗体を存在するかも知れない如何なる抗原にも結合
させるに足る時間にわたり培養する。培養時間および温
度は一般に、最初の培養について上に示したところと略
同−である。次に、標識抗体を含有する溶液を、標識抗
体、抗原および固体支持体に結合された非標識抗体を含
んで成るサンドイツチから分離する。
管またはウェルからの吸引によシ固定した抗体および結
合抗原から分離する。試験管を適切な溶液で洗浄した後
、本発明の化学ルミネッセンス化合物で標識した抗体を
含有する緩衝液を試験管またはウェルに配置し、そして
標識抗体を存在するかも知れない如何なる抗原にも結合
させるに足る時間にわたり培養する。培養時間および温
度は一般に、最初の培養について上に示したところと略
同−である。次に、標識抗体を含有する溶液を、標識抗
体、抗原および固体支持体に結合された非標識抗体を含
んで成るサンドイツチから分離する。
次いで、固体支持体上の標識サンドイツチに対し、光を
放射させるためにおだやかな酸化条件を施す。酸化条件
は、試験管またはウェルに酸化剤、たとえば過酸化水素
の緩衝液を添加することにょシ都合良く達成することが
できる。放射された光の量は、凡ゆる適当な光測定計器
、たとえば市販のルミノメータ（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅ
ｒ）にょシ測定される。
放射させるためにおだやかな酸化条件を施す。酸化条件
は、試験管またはウェルに酸化剤、たとえば過酸化水素
の緩衝液を添加することにょシ都合良く達成することが
できる。放射された光の量は、凡ゆる適当な光測定計器
、たとえば市販のルミノメータ（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅ
ｒ）にょシ測定される。
試料から放射された光量と既知濃度の抗原の連続希釈度
について得られている標準曲線とを比較することによ多
試料中に存在する抗原の量を決定することができる。
について得られている標準曲線とを比較することによ多
試料中に存在する抗原の量を決定することができる。
所望によシ、簡略化免疫検定法を利用することも可能で
あシ、その場合には固定した抗体と試料の培養に引続く
第１の分離工程を省略することができる。たとえば、試
験すべき試料の緩衝液を、試験管壁の内表面に結合した
抗体を有するポリスチレン試験管に添加してもよい。引
続いて、標識抗体の緩衝液を、試料溶液を除去すること
なく、試験管に添加し、そして混合物を培養する。
あシ、その場合には固定した抗体と試料の培養に引続く
第１の分離工程を省略することができる。たとえば、試
験すべき試料の緩衝液を、試験管壁の内表面に結合した
抗体を有するポリスチレン試験管に添加してもよい。引
続いて、標識抗体の緩衝液を、試料溶液を除去すること
なく、試験管に添加し、そして混合物を培養する。
この方法において、２以上の抗体結合部位を含む抗原は
、２種類の異なったタイプの抗体とは別々に結合するこ
とになる。２種類の異なったタイプの抗体は同一の結合
部位において競合することはないので、この方法は検定
の感度を犠牲にすることなく、簡単かつ迅速な試験法を
提供するものである。この方法は、試料中のポリペプチ
ドの存在を決定しようとするとき、たとえば庖疹ヴイー
ルス抗原の存在に関する免疫検定を行なおうとするとき
、典型的に用いられるものである。免疫検定法は好まし
いサンドイッチタイプの免疫検定に関して詳細に説明し
たけれども、本発明の化学ルミネッセンス化合物はまた
、他のタイプの免疫検定法、たとえば先に説明した方法
であって、固体支持体上に固定した抗体に結合するため
に標識抗原が試料中の非標識抗原と競合しているような
ものについても利用可能である。
、２種類の異なったタイプの抗体とは別々に結合するこ
とになる。２種類の異なったタイプの抗体は同一の結合
部位において競合することはないので、この方法は検定
の感度を犠牲にすることなく、簡単かつ迅速な試験法を
提供するものである。この方法は、試料中のポリペプチ
ドの存在を決定しようとするとき、たとえば庖疹ヴイー
ルス抗原の存在に関する免疫検定を行なおうとするとき
、典型的に用いられるものである。免疫検定法は好まし
いサンドイッチタイプの免疫検定に関して詳細に説明し
たけれども、本発明の化学ルミネッセンス化合物はまた
、他のタイプの免疫検定法、たとえば先に説明した方法
であって、固体支持体上に固定した抗体に結合するため
に標識抗原が試料中の非標識抗原と競合しているような
ものについても利用可能である。
本明細書中で説明する免疫検定法は、それについて特定
の抗体を提起し得る凡ゆる抗原を検出かつ定量するため
に用いることができる。それらは誰もが抗原のタイプの
単なる例示として言及し得るもの、また誰もが検出する
ことを望むもの、すなわちヴイールス抗原、たとえば庖
疹、肝炎、インフルエンザ等、ポリペプチド、たとえば
チモクンアルファ１、インターリューキｙ （ｉｎｔｅ
ｒｌｅｕｋｉｎ）、エンドルフィン（・ｎｄｏｒｐｈｉ
ｎ） 、エンカファリン（ａｎｋａｐｈａｌｉｎ） 、
ヒトの絨毛ゴナドトロピン、α−７エトプロテイｙ （
ａｌｐｈａ−ｆａｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）等、ステロイド
ホルモン、各種の薬剤物質および対象とする分析物質で
ある。
の抗体を提起し得る凡ゆる抗原を検出かつ定量するため
に用いることができる。それらは誰もが抗原のタイプの
単なる例示として言及し得るもの、また誰もが検出する
ことを望むもの、すなわちヴイールス抗原、たとえば庖
疹、肝炎、インフルエンザ等、ポリペプチド、たとえば
チモクンアルファ１、インターリューキｙ （ｉｎｔｅ
ｒｌｅｕｋｉｎ）、エンドルフィン（・ｎｄｏｒｐｈｉ
ｎ） 、エンカファリン（ａｎｋａｐｈａｌｉｎ） 、
ヒトの絨毛ゴナドトロピン、α−７エトプロテイｙ （
ａｌｐｈａ−ｆａｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）等、ステロイド
ホルモン、各種の薬剤物質および対象とする分析物質で
ある。
以下に示す実施例は、本発明のフエナントリジニウムエ
ステル塩の合成および免疫検定におけるそれらの利用を
例示している。
ステル塩の合成および免疫検定におけるそれらの利用を
例示している。
実施例１乃至４は中間体および本発明の２釉類の化合物
の合成を説明している。
の合成を説明している。
実施例５では、抗体配合体の調製が説明されるが、そこ
では家兎ＩｇＧに対する精製ロノく抗体および超免疫家
兎血清の家兎ＩｇＧ留分が（別々に）フエナントリジニ
ウムエステル塩と組合わされている。実施例６には、抗
原を検出するためにどのようにして標準曲線を得ること
ができるかが示されている。それらの結果は第１表、第
１図および第２図中に要約する。次いで標準曲線は未知
の、たとえば実施例７におけるような庖疹抗体の定量口
９測定に用いることができる。第■表は庖疹サンドイッ
チＬＩＡの結果を要約している。既に示した式の他に、
下記の化合物も、その数字のみによって実施例中で時々
参照するものとする。
では家兎ＩｇＧに対する精製ロノく抗体および超免疫家
兎血清の家兎ＩｇＧ留分が（別々に）フエナントリジニ
ウムエステル塩と組合わされている。実施例６には、抗
原を検出するためにどのようにして標準曲線を得ること
ができるかが示されている。それらの結果は第１表、第
１図および第２図中に要約する。次いで標準曲線は未知
の、たとえば実施例７におけるような庖疹抗体の定量口
９測定に用いることができる。第■表は庖疹サンドイッ
チＬＩＡの結果を要約している。既に示した式の他に、
下記の化合物も、その数字のみによって実施例中で時々
参照するものとする。
■
八
実施例１
フエナントリジｙ （Ｉ） １’ ０．０Ｆｍ（５５，
８ミ！Ｊ モル）および乾燥トルエン２〇−中の無水シ
アン化水素酸約１２ｍｇから成るスラリーを調製した。
８ミ！Ｊ モル）および乾燥トルエン２〇−中の無水シ
アン化水素酸約１２ｍｇから成るスラリーを調製した。
このスラリーを氷水浴中で冷却し、そして乾燥トルエン
２〇−中塩化ベンゾイル４．Ｏｆｍ（２８，５ミリモル
）から成る溶液’＆１滴づつ添加した。そのようにする
ことによシフエナントリジンは撹拌によって可溶化した
。この混合物を氷水温度で４時間撹拌し、次いで室温で
一晩中撹拌した。第１の撹拌時間の後、少量の沈殿物が
生成した。ジエチルエーテル７５−の添加により沈殿が
増加した。脱イオン水および希硫酸による抽出の結果、
沈殿物を再溶解した。この有機溶液を脱イオン水で２度
洗浄した。濃水酸化アンモニウム溶液を水層に添加する
ことによりフェナントリジン（４，９Ｆｍ）が回収され
た。有機層を飽和炭酸水素す） ＩＪウム溶液で洗浄し
、次いで水で洗浄した後、ジエチルエーテルおよびトル
エンを減圧下で完全に除去した。
２〇−中塩化ベンゾイル４．Ｏｆｍ（２８，５ミリモル
）から成る溶液’＆１滴づつ添加した。そのようにする
ことによシフエナントリジンは撹拌によって可溶化した
。この混合物を氷水温度で４時間撹拌し、次いで室温で
一晩中撹拌した。第１の撹拌時間の後、少量の沈殿物が
生成した。ジエチルエーテル７５−の添加により沈殿が
増加した。脱イオン水および希硫酸による抽出の結果、
沈殿物を再溶解した。この有機溶液を脱イオン水で２度
洗浄した。濃水酸化アンモニウム溶液を水層に添加する
ことによりフェナントリジン（４，９Ｆｍ）が回収され
た。有機層を飽和炭酸水素す） ＩＪウム溶液で洗浄し
、次いで水で洗浄した後、ジエチルエーテルおよびトル
エンを減圧下で完全に除去した。
エチルアルコール（９５％）よシの結晶化によって化合
物（ｎ） （ｍｐｌ ４０．５〜１４１．５℃）８．３
Ｆ（収率９５．９ｑｂ）が得られた・ 実施例２ フエナントリジンー９−カルボン酸（■）の制置 化合物■はＭｅ Ｃａｐａｒａ他の英国特許第１，４６
１゜８７７号「アクリジン−９−カルボン酸の製造」の
変形方法によシ合成された。２００ｄフラスコ中に、濃
硫酸１〇−中化合物ＩＩ２．Ｏｒｍ（６，５ミリモル）
から成る混合物を配置した。この混合物を１００〜１１
０℃で３時間撹拌し、次いで氷水浴中で冷却した。撹拌
した粘稠溶液に粉末硝酸ナトリウム（４，０Ｆｍ）を少
しづつ添加した。次いでこのフラスコを熱板上で注意深
く加熱した。酸化窒素の急激な発生が起るので、反応を
スローダウンさせるために熱板からフラスコを時々移動
させる必要があった。
物（ｎ） （ｍｐｌ ４０．５〜１４１．５℃）８．３
Ｆ（収率９５．９ｑｂ）が得られた・ 実施例２ フエナントリジンー９−カルボン酸（■）の制置 化合物■はＭｅ Ｃａｐａｒａ他の英国特許第１，４６
１゜８７７号「アクリジン−９−カルボン酸の製造」の
変形方法によシ合成された。２００ｄフラスコ中に、濃
硫酸１〇−中化合物ＩＩ２．Ｏｒｍ（６，５ミリモル）
から成る混合物を配置した。この混合物を１００〜１１
０℃で３時間撹拌し、次いで氷水浴中で冷却した。撹拌
した粘稠溶液に粉末硝酸ナトリウム（４，０Ｆｍ）を少
しづつ添加した。次いでこのフラスコを熱板上で注意深
く加熱した。酸化窒素の急激な発生が起るので、反応を
スローダウンさせるために熱板からフラスコを時々移動
させる必要があった。
熱い粘稠混合物を撹拌した氷および混合物中にゆるやか
に注いだ。吸引濾過により黄色の沈殿を収集し、水で洗
浄し、そして十分に排水した。生成物を氷冷水酸化す）
ＩＪウム（２Ｎ）中に溶解した。
に注いだ。吸引濾過により黄色の沈殿を収集し、水で洗
浄し、そして十分に排水した。生成物を氷冷水酸化す）
ＩＪウム（２Ｎ）中に溶解した。
未溶解物質は一過により除去した。氷水温度における濃
塩酸による酸性化の後、黄色溶液を冷蔵庫内に一晩貯蔵
した。得られた沈殿物ｔ−濾過し、水洗し、そして真空
炉内で３５〜４０℃で乾燥して化合物Ｉ［［（ｍｐ１５
５℃）〔（事実上１５５℃）で分解を伴う：Ｉｌ０−４
３ｒを得た。一般的な方法は、Ｖｏｎ Ｇｅｏｒｇ Ｗ
ｉｔｔｉｇ、 Ｍａｒｇｅｔｉｍ Ａ、 Ｊｅｓａｉｔ
ｉｇ、およびＭａｒｔｌｓ Ｇｌｏｗによる論文［分析
化学（Ａｎｎ、 ｄｅｒ。
塩酸による酸性化の後、黄色溶液を冷蔵庫内に一晩貯蔵
した。得られた沈殿物ｔ−濾過し、水洗し、そして真空
炉内で３５〜４０℃で乾燥して化合物Ｉ［［（ｍｐ１５
５℃）〔（事実上１５５℃）で分解を伴う：Ｉｌ０−４
３ｒを得た。一般的な方法は、Ｖｏｎ Ｇｅｏｒｇ Ｗ
ｉｔｔｉｇ、 Ｍａｒｇｅｔｉｍ Ａ、 Ｊｅｓａｉｔ
ｉｇ、およびＭａｒｔｌｓ Ｇｌｏｗによる論文［分析
化学（Ａｎｎ、 ｄｅｒ。
Ｃｈｅｍｌｅ） Ｊ ５７７．１（１９５２年）中に要
約されている・ 一 実施例３ 凝縮器を備えた１００−の丸底フラスコに化合物ｌｌｌ
７．２Ｆｍ（３２，３ミリモル）および塩化チオニル１
５ｍ１を添加した。凝縮器の上部に取付けた乾燥管を用
いて装置を水分から保護した。混合物を撹拌して１０分
間還流させた。回転蒸発により過剰の塩化チオニルを除
去した。残留塩化チオニルを除去するために、乾燥トル
エン（４０ｍｇ）を生成物に添加し、次いで減圧下で蒸
発させた。このようにして生成した化合物■の酸塩化物
を更に精製することなく用いた。乾燥トルエン（３０ｄ
）を、酸塩化物を容れたフラスコに添加した。このスラ
リーに、乾燥トルエン２５−と無水トリエチルアミン１
０ｒｎｔ中の化合物■であるＮ−スクシンイミジル−４
−ヒドロキシベンゾニー）９．０ｒｍ（３８，３ミｌＪ
モル）から成る溶液を一滴づつ添加した。この混合物を
室温で４時間撹拌した。生成したトリエチルアミンヒド
ロクロリドを濾過によシ除去した。溶媒を減圧において
Ｐ液から除去した。
約されている・ 一 実施例３ 凝縮器を備えた１００−の丸底フラスコに化合物ｌｌｌ
７．２Ｆｍ（３２，３ミリモル）および塩化チオニル１
５ｍ１を添加した。凝縮器の上部に取付けた乾燥管を用
いて装置を水分から保護した。混合物を撹拌して１０分
間還流させた。回転蒸発により過剰の塩化チオニルを除
去した。残留塩化チオニルを除去するために、乾燥トル
エン（４０ｍｇ）を生成物に添加し、次いで減圧下で蒸
発させた。このようにして生成した化合物■の酸塩化物
を更に精製することなく用いた。乾燥トルエン（３０ｄ
）を、酸塩化物を容れたフラスコに添加した。このスラ
リーに、乾燥トルエン２５−と無水トリエチルアミン１
０ｒｎｔ中の化合物■であるＮ−スクシンイミジル−４
−ヒドロキシベンゾニー）９．０ｒｍ（３８，３ミｌＪ
モル）から成る溶液を一滴づつ添加した。この混合物を
室温で４時間撹拌した。生成したトリエチルアミンヒド
ロクロリドを濾過によシ除去した。溶媒を減圧において
Ｐ液から除去した。
得られた化合物■である褐色固体を更に’ＩＴｔ製する
ことなく用いた。
ことなく用いた。
化合物■を乾燥塩化メチレン２０〇−中に溶解した。メ
チルフルオロスルホネー）（２０ｒｎｔ）ｅ添加し、そ
してその混合物を室温で一晩中撹拌した。黄色沈殿物（
化合物Ｘ）を吸引濾過によシ収集し、そして塩化メチレ
ンで洗浄した。化合物Ｘを、アセトニトリル（１００ｍ
）中の溶解と、引続くジエチルエーテル（７００ｔｎｔ
）を用いる沈殿により再結晶させた。９５％エタノール
から、更に再結晶によシ純粋な生成物（ｍｐ、２５８〜
２５９℃）が得られた。
チルフルオロスルホネー）（２０ｒｎｔ）ｅ添加し、そ
してその混合物を室温で一晩中撹拌した。黄色沈殿物（
化合物Ｘ）を吸引濾過によシ収集し、そして塩化メチレ
ンで洗浄した。化合物Ｘを、アセトニトリル（１００ｍ
）中の溶解と、引続くジエチルエーテル（７００ｔｎｔ
）を用いる沈殿により再結晶させた。９５％エタノール
から、更に再結晶によシ純粋な生成物（ｍｐ、２５８〜
２５９℃）が得られた。
実施例４
乾燥トルエン３０ゴ中の化合物■であるフエナントリジ
ンー９−カルボン酸７．２ｆｍ（３２，３ミリモル）か
ら得た化合物■の粗フエナントリジンー９−カルポキン
ルクロリドの溶液に、無水トルエン２５−と無水トリエ
チルアミン１０ｍｇ中の化合物Ｍである４−（２−Ｎ−
スクシンイミジロキシカルボニルエチル）フェノール１
２．０ ｔｍヲ８ツつ添加した。この混合物を室温で４
時間撹拌した。
ンー９−カルボン酸７．２ｆｍ（３２，３ミリモル）か
ら得た化合物■の粗フエナントリジンー９−カルポキン
ルクロリドの溶液に、無水トルエン２５−と無水トリエ
チルアミン１０ｍｇ中の化合物Ｍである４−（２−Ｎ−
スクシンイミジロキシカルボニルエチル）フェノール１
２．０ ｔｍヲ８ツつ添加した。この混合物を室温で４
時間撹拌した。
沈殿物は吸引濾過によシ除去した。Ｆ液を蒸発して化合
物■を得た。このエステル■は更に精製することなく用
いた。
物■を得た。このエステル■は更に精製することなく用
いた。
化合物■を乾燥塩化メチレン２０〇−中に溶解し、そし
てこの混合物にメチルフルオロスルホネート２０−を添
加した。混合物を室温で一晩撹拌し、次いで生成した黄
色沈殿物を濾過によシ収集した。この固形物をアセトニ
トリル１０〇−中への溶解と引続くエチルエーテル７０
０ｍｊによる沈殿によシ再結晶させて、化合物証の非常
にはつきシした淡黄色の結晶（ｍｐ、２０２〜２０６℃
）６．８ｆｍ（収率２６％）を得た。
てこの混合物にメチルフルオロスルホネート２０−を添
加した。混合物を室温で一晩撹拌し、次いで生成した黄
色沈殿物を濾過によシ収集した。この固形物をアセトニ
トリル１０〇−中への溶解と引続くエチルエーテル７０
０ｍｊによる沈殿によシ再結晶させて、化合物証の非常
にはつきシした淡黄色の結晶（ｍｐ、２０２〜２０６℃
）６．８ｆｍ（収率２６％）を得た。
実施例５
の調製
家兎ＩｇＧ Ｌ Ｉ Ａに関し、家兎ＩｇＧに対抗する
親和精製した（ａｆｆｉｕｉｔｙ ｐｕｒｉｆｌｅｄ）
ロバの抗体約１．０ツおよび化合物■の４−（２−Ｎ−
スクシンイミジロキシカルボニルエチル）フェニル−１
０−メチルフエナントリジニウムー９−カルボキシレー
）０．５ｍｇを用いた。庖疹ＬＩＡにおいて、超免疫家
兎血清のＩｇＧ留分２．２５ηおよび化合物Ｘである４
−（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル）フェニ
ル−１０−メチルフエナントリシニウムー９−カルボキ
シレート０．７５ｗｑを結合に際して用いた。適量のフ
エナントリジニウムエステルを含有するＮ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）（３５μｔ）を、ｐＨ８，５
のリン酸塩緩衝液（０，０２Ｍ）０．５ｄ中の対応量の
抗体に添加した。この混合物を室温で１５分間撹拌した
。０．１Ｍの１．ｐＨ４，５を示すくえん酸塩緩衝液（
急冷溶液）５００μｔを添加する以前に、混合物は氷水
浴中で２分間冷却した。この反応混合物は、０．０５Ｍ
の、ｐＨ５，０を示すくえん酸塩緩衝液と共に１．０％
塩化ナトリウムおよび０．０１％チメロサルによシ平衡
させた１、０ｍＸ５０ｃｍｒセファデックス（Ｓｓｐｈ
ａｄｓｘ）Ｇ−２５−１５０Ｊ［ファーマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｅｉｍ） ］カラムに移動させた。たんばく質留
分は収集され、そして明るさが定量された。
親和精製した（ａｆｆｉｕｉｔｙ ｐｕｒｉｆｌｅｄ）
ロバの抗体約１．０ツおよび化合物■の４−（２−Ｎ−
スクシンイミジロキシカルボニルエチル）フェニル−１
０−メチルフエナントリジニウムー９−カルボキシレー
）０．５ｍｇを用いた。庖疹ＬＩＡにおいて、超免疫家
兎血清のＩｇＧ留分２．２５ηおよび化合物Ｘである４
−（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル）フェニ
ル−１０−メチルフエナントリシニウムー９−カルボキ
シレート０．７５ｗｑを結合に際して用いた。適量のフ
エナントリジニウムエステルを含有するＮ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）（３５μｔ）を、ｐＨ８，５
のリン酸塩緩衝液（０，０２Ｍ）０．５ｄ中の対応量の
抗体に添加した。この混合物を室温で１５分間撹拌した
。０．１Ｍの１．ｐＨ４，５を示すくえん酸塩緩衝液（
急冷溶液）５００μｔを添加する以前に、混合物は氷水
浴中で２分間冷却した。この反応混合物は、０．０５Ｍ
の、ｐＨ５，０を示すくえん酸塩緩衝液と共に１．０％
塩化ナトリウムおよび０．０１％チメロサルによシ平衡
させた１、０ｍＸ５０ｃｍｒセファデックス（Ｓｓｐｈ
ａｄｓｘ）Ｇ−２５−１５０Ｊ［ファーマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｅｉｍ） ］カラムに移動させた。たんばく質留
分は収集され、そして明るさが定量された。
実施例６
免疫検定法
検定は、家兎ＩｇＧに対抗する山羊Ω抗体によシ予め吸
着させた３組の１２Ｘ７５５１のポリスチレン管内で行
った。このＬＩＡ全体に用いた緩衝液は０．１５Ｍの塩
化ナトリウム、０．１８チＢＳＡおよび０．０１％チメ
ロサルを含有する、ｐＨ６，３を示す０．０２Ｒ１ん酸
塩であった。
着させた３組の１２Ｘ７５５１のポリスチレン管内で行
った。このＬＩＡ全体に用いた緩衝液は０．１５Ｍの塩
化ナトリウム、０．１８チＢＳＡおよび０．０１％チメ
ロサルを含有する、ｐＨ６，３を示す０．０２Ｒ１ん酸
塩であった。
０．８ｎｌ／−乃至２００ ｎｔ／ｒｄの範囲に及び家
兎ＩｇＧ標準抗原（１００μｔ）を抗体塗布管に添加し
た。引続いて、化学ルミネッセンス的に標識した抗体１
００μｔを添加した。この混合物を緩やかに渦巻かせ、
次いで室温で３時間培養した。培養期間の最後で、緩衝
液１．０−を６管に添加し、そして引続いて傾しゃした
。これらの管を次いで緩衝液１．０１１１によｐ２度洗
浄した。最後の洗浄溶液は、光測定の直前まで管内に残
留させた。化学ルミネッセンスの測定のために、最終洗
浄溶液を傾しやし、そして管に、３％過酸化水素溶液２
μｔを含有する、ｐＨ１２，５を示す０．５Ｍはう酸塩
緩衝液２００μｔを注入した。放射された光Ｖｉ、［タ
ーナ−・デザインズ・ルミノメータ・モデル２０ （Ｔ
ｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉ−ｇｎｓ Ｌｕｍｉｎｏｍｓｔｅ
ｒ Ｍｏｄｅｌ ２０） Ｊによシ測定され、そして５
秒間にわたシ積分された相対光子計数として表わされた
。それらの結果および家兎ＩｇＧＬ！Ａに関する標準曲
線は第１表ならびに第１図および第２図中に示されてい
る。
兎ＩｇＧ標準抗原（１００μｔ）を抗体塗布管に添加し
た。引続いて、化学ルミネッセンス的に標識した抗体１
００μｔを添加した。この混合物を緩やかに渦巻かせ、
次いで室温で３時間培養した。培養期間の最後で、緩衝
液１．０−を６管に添加し、そして引続いて傾しゃした
。これらの管を次いで緩衝液１．０１１１によｐ２度洗
浄した。最後の洗浄溶液は、光測定の直前まで管内に残
留させた。化学ルミネッセンスの測定のために、最終洗
浄溶液を傾しやし、そして管に、３％過酸化水素溶液２
μｔを含有する、ｐＨ１２，５を示す０．５Ｍはう酸塩
緩衝液２００μｔを注入した。放射された光Ｖｉ、［タ
ーナ−・デザインズ・ルミノメータ・モデル２０ （Ｔ
ｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉ−ｇｎｓ Ｌｕｍｉｎｏｍｓｔｅ
ｒ Ｍｏｄｅｌ ２０） Ｊによシ測定され、そして５
秒間にわたシ積分された相対光子計数として表わされた
。それらの結果および家兎ＩｇＧＬ！Ａに関する標準曲
線は第１表ならびに第１図および第２図中に示されてい
る。
実施例７
庖疹に関するサンドイッチＬＩＡ
直径５／１６“で、鏡のように仕上げたポリスチレンビ
ーズをｐＨ９，６の、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液中の庖疹に
対抗する家兎抗体で前処理した。検定に際して、これら
のビーズは、０．１１ＢＳＡおよび０．１チアジドナト
リウムを含有する、ｐＨ７，４の、０．０２Ｍ、９ん酸
塩緩衝液中の庖疹感染させた各種希釈度を有する培地３
００μｔと共に室温で２時間振とうした。培養の末期で
ｐＨ７，４の、０．０２ＭＪ）ん酸塩緩衝液２−を６管
に添加し、そして液体を吸引によシ除去した。次いで、
これらのビーズはシん酸塩緩衝液２ゴで２度洗浄した。
ーズをｐＨ９，６の、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液中の庖疹に
対抗する家兎抗体で前処理した。検定に際して、これら
のビーズは、０．１１ＢＳＡおよび０．１チアジドナト
リウムを含有する、ｐＨ７，４の、０．０２Ｍ、９ん酸
塩緩衝液中の庖疹感染させた各種希釈度を有する培地３
００μｔと共に室温で２時間振とうした。培養の末期で
ｐＨ７，４の、０．０２ＭＪ）ん酸塩緩衝液２−を６管
に添加し、そして液体を吸引によシ除去した。次いで、
これらのビーズはシん酸塩緩衝液２ゴで２度洗浄した。
引続いてビーズは、０．１％アジドナトリウムおよび２
５チ胎児子牛血清を含有するｐＨ７，４の、０．０２Ｒ
１ん酸塩緩衝液中の抗体−化合物Ｘ配合体３００μｔと
共に室温で２時間振とうした。上述と同一の洗浄方法に
従い３回洗浄した後、ビーズを新しい管に移動させた。
５チ胎児子牛血清を含有するｐＨ７，４の、０．０２Ｒ
１ん酸塩緩衝液中の抗体−化合物Ｘ配合体３００μｔと
共に室温で２時間振とうした。上述と同一の洗浄方法に
従い３回洗浄した後、ビーズを新しい管に移動させた。
ｐＨ４，０の０．０１Ｍ＜えん酸緩衝液２００μＬを６
管に添加し、そしてその管を［ターナ−争デザインズ・
ルミノメータ・モデル２０］中に配置した。
管に添加し、そしてその管を［ターナ−争デザインズ・
ルミノメータ・モデル２０］中に配置した。
化学ルミネッセンス反応は、３チ過酸化水素溶液２μｔ
を含有する、ｐＨ１０，５の０．５Ｍはう酸塩緩衝液２
００μｔの急速注入によシ開始された。庖疹ヴイールス
希釈度と相対光発生との関係は第■表中に示す。
を含有する、ｐＨ１０，５の０．５Ｍはう酸塩緩衝液２
００μｔの急速注入によシ開始された。庖疹ヴイールス
希釈度と相対光発生との関係は第■表中に示す。
第 ■ 表
００．１
０．８ ０．２
１．６ ０．４
３．１ ０．６
６．２ １．１
１２．５ ２．５
２５．０ ４．３
５０．０ ８・５
１００．０ １５．６
２００．０ ２０・３
第 ■ 表
０ ヴイールス ０．７３１：３２００
希釈度 １．４４１：１６００ 希釈
度 ２．３７１：８００ 希釈度
３．０４１：１００ 希釈度 １
２．９７上記の説明および実施例は、特許法によシ求め
られるように、本発明の最良の態様および実施態様を例
示している。しかしながら、本発明はそれらによシ、も
しくはそれらに関して限定されるものと解釈されるべき
ではなく、むしろ当該技術分野において現われる変形お
よび変更の包含が意図されるものである。
希釈度 １．４４１：１６００ 希釈
度 ２．３７１：８００ 希釈度
３．０４１：１００ 希釈度 １
２．９７上記の説明および実施例は、特許法によシ求め
られるように、本発明の最良の態様および実施態様を例
示している。しかしながら、本発明はそれらによシ、も
しくはそれらに関して限定されるものと解釈されるべき
ではなく、むしろ当該技術分野において現われる変形お
よび変更の包含が意図されるものである。
第１図は本発明の化合物を化学ルミネッセンス化合物と
して用いる家兎ＩｇＧ Ｌ Ｉ Ａ標準曲線、第２図は
明確化のため拡大された第１図の曲線の一部を示す図で
ある。 特許出願人 マリンクロット・インコーホレイテッド
ＩＧ Ｉ ＩＧ ２
して用いる家兎ＩｇＧ Ｌ Ｉ Ａ標準曲線、第２図は
明確化のため拡大された第１図の曲線の一部を示す図で
ある。 特許出願人 マリンクロット・インコーホレイテッド
ＩＧ Ｉ ＩＧ ２
Claims (15)
- （１）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、Ｒは炭素数１乃至５のアルキル基、Ｘはスルフ
エート、アルキルスルフエート、ハロスルフエートおよ
びハロゲン化物から成る群から選択されるアニオン、そ
してＹはアミノ基、カルボキシル基、あるいは対象とす
る分析物質またはたんぱく質中に通例見出されるその他
の基と結合可能な化学的部分である）で示される化学ル
ミネツセンス化合物。 - （２）化合物が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、ｎは０乃至５の整数である）で示される特許請
求の範囲第１項記載の化学ルミネツセンス化合物。 - （３）化合物が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される特許請求の範囲第２項記載の化学ルミネツセ
ンス化合物 - （４）化合物が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される特許請求の範囲第２項記載の化学ルミネツセ
ンス化合物。 - （５）特許請求の範囲第１項記載の化合物から成る配合
体と抗体とを含んで構成されることを特徴とする発光計
量免疫検定法において有用な化学ルミネツセンス試薬。 - （６）特許請求の範囲第１項記載の化合物から成る配合
体と抗原とを含んで構成された、発光計量免疫検定法に
おいて有用な化学ルミネツセンス試薬。 - （７）試料溶液により固定された、抗原に対し特異性を
有する抗体および標識抗体の溶液を培養する工程と、 それにより固定されたサンドイツチを形成する工程と、 標識抗体の溶液を固定サンドイツチから分離する工程と
、 固定サンドイツチ中の標識抗体を酸化剤と反応させて光
の放射を行わせる工程と、 放射された光量を測定して抗原の存在を決定する工程と
を含んで構成され、かつ前記標識抗体が抗体の配合体と
式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、Ｒは炭素数１乃至５のアルキル基、ｘはスルフ
エート、アルキルスルフエート、ハロスルホネートおよ
びハロゲン化物から成る群から選択されるアニオン、そ
してＹはアミノ基、カルボキシル基、あるいは対象とす
る分析物質またはたんぱく質中に通例見出されるその他
の基と結合可能な化学的部分である）で示される化学ル
ミネツセンス化合物とを含んでいる試料中の抗原を検出
するための発光計量免疫検定法。 - （８）標識抗体の溶液を添加する以前に、試料溶液を固
定抗体から分離する特許請求の範囲第７項記載の発光計
量免疫検定法。 - （９）試料溶液で固定された抗体および標識抗原を培養
する工程と、 結合抗原を非結合抗原から分離する工程と、結合標識抗
原を酸化剤と反応させて光の放射を行わせる工程と、 放射された光量を測定して非標識抗原の存在を決定する
工程とを含んで構成され、かつ前記標識抗体が抗原の配
合体と、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、Ｒは炭素数１乃至５のアルキル基、ｘはスルフ
エート、アルキルスルフエート、ハロスルホネートおよ
びハロゲン化物から成る群から選択されるアニオン、そ
してＹはアミノ基、カルボキシル基、あるいは対象とす
る分析物質またはたんぱく質中に通例見出されるその他
の基と結合可能な化学的部分である）で示される化学ル
ミネツセンス化合物とを含んでいる試料中の抗原を検出
するため。発光計量免疫検定法。 - （１０）化学ルミネツセンス化合物が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、ｎは０乃至５の整数である）で示される特許請
求の範囲第７項および第８項記載の発光計量免疫検定法
。 - （１１）化学ルミネツセンス化合物が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される特許請求の範囲第１０項記載の発光計量免疫
検定法。 - （１２）化学ルミネツセンス化合物が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される特許請求の範囲第１０項記載の発光計量免疫
検定法。 - （１３）化学ルミネツセンス化合物が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、ｎは０乃至５の整数である）で示される特許請
求の範囲第９項記載の発光計量免疫検定法。 - （１４）化学ルミネツセンス化合物が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される特許請求の範囲第１３項記載の発光計量免疫
検定法。 - （１５）化学ルミネツセンス化合物が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される特許請求の範囲第１３項記載の発光計量免疫
検定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/626,781 US4687747A (en) | 1984-07-02 | 1984-07-02 | Phenanthridinium ester as a labelling compound in luminometric immunoassay |
| US626781 | 1984-07-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6176464A true JPS6176464A (ja) | 1986-04-18 |
| JPH0662570B2 JPH0662570B2 (ja) | 1994-08-17 |
Family
ID=24511829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60142668A Expired - Lifetime JPH0662570B2 (ja) | 1984-07-02 | 1985-07-01 | 化学ルミネッセンス化合物およびこれを用いる発光計量免疫検定法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4687747A (ja) |
| EP (1) | EP0170415B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0662570B2 (ja) |
| AT (1) | ATE33671T1 (ja) |
| CA (1) | CA1258424A (ja) |
| DE (1) | DE3562267D1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5310687A (en) * | 1984-10-31 | 1994-05-10 | Igen, Inc. | Luminescent metal chelate labels and means for detection |
| US5238808A (en) * | 1984-10-31 | 1993-08-24 | Igen, Inc. | Luminescent metal chelate labels and means for detection |
| ATE111083T1 (de) * | 1986-10-22 | 1994-09-15 | Abbott Lab | Chemilumineszierende acridinium- und phenantridiniumsalze. |
| NZ227506A (en) * | 1987-12-31 | 1992-06-25 | London Diagnostics Inc | Specific binding assays using chemiluminescent compounds |
| DE3844954C2 (de) * | 1988-02-20 | 1998-07-16 | Hoechst Ag | Spezielle chemilumineszierende Acridinderivate und ihre Verwendung in Lumineszenzimmunoassays |
| US6002007A (en) * | 1988-02-20 | 1999-12-14 | Dade Behring Marburg Gmbh | Special chemiluminescent acridine derivatives and the use thereof in luminescence immunoassays |
| AU3342689A (en) * | 1988-03-24 | 1989-10-16 | Igen Incorporated | Luminescent chimeric proteins |
| WO1990005301A1 (en) * | 1988-11-03 | 1990-05-17 | Igen, Inc. | Electrochemiluminescent assays |
| US5202264A (en) * | 1989-10-27 | 1993-04-13 | Health Research, Incorporated | ELISA using multi-species antibodies for detection of von Willebrand factor in multiple species |
| US5830709A (en) * | 1989-10-27 | 1998-11-03 | Benson; Roger E. | Detection method for homologous portions of a class of substances |
| US5196311A (en) * | 1989-10-27 | 1993-03-23 | Health Research, Incorporated | Elisa test for von willebrand factor |
| US5395938A (en) * | 1992-08-21 | 1995-03-07 | Nichols Institute Diagnostics | Biotinylated chemiluminescent labels and their conjugates, assays and assay kits |
| US5491072A (en) * | 1993-05-17 | 1996-02-13 | Lumigen, Inc. | N-alkylacridan carboxyl derivatives useful for chemiluminescent detection |
| US5523212A (en) * | 1993-05-17 | 1996-06-04 | Lumigen, Inc. | Aryl N-alkylacridanthiocarboxylate derivatives useful for chemiluminescent detection |
| US5691158A (en) * | 1993-10-15 | 1997-11-25 | Mary Kay Cosmetics, Inc. | System and method for determining efficacy of sunscreen formulations |
| US6056923A (en) * | 1997-06-25 | 2000-05-02 | Clmp, Inc. | Dual injector for chemiluminescence immunoanalyzing system |
| US7745142B2 (en) | 1997-09-15 | 2010-06-29 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays |
| US7632651B2 (en) | 1997-09-15 | 2009-12-15 | Mds Analytical Technologies (Us) Inc. | Molecular modification assays |
| US7070921B2 (en) | 2000-04-28 | 2006-07-04 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays |
| WO2019116234A1 (en) | 2017-12-12 | 2019-06-20 | Nestec S.A. | Methods for determining microbiome ribosomal rna composition changes |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE376077B (ja) * | 1973-09-13 | 1975-05-05 | Asea Ab | |
| GB1461877A (en) * | 1974-02-12 | 1977-01-19 | Wellcome Found | Assay method utilizing chemiluminescence |
| SE7811630L (sv) * | 1977-11-17 | 1979-05-18 | Welsh Nat School Med | Metod for uppteckt eller mengdbestemning av substanser med anvendning av merkningsteknik |
| US4193983A (en) * | 1978-05-16 | 1980-03-18 | Syva Company | Labeled liposome particle compositions and immunoassays therewith |
| CA1185177A (en) * | 1981-07-17 | 1985-04-09 | Larry E. Morrison | Non-radiative energy transfer immunochemical technique |
| DE3279029D1 (en) * | 1981-12-11 | 1988-10-20 | Welsh Nat School Med | Luminescent labelling materials and procedures |
-
1984
- 1984-07-02 US US06/626,781 patent/US4687747A/en not_active Expired - Fee Related
-
1985
- 1985-06-28 CA CA000486034A patent/CA1258424A/en not_active Expired
- 1985-06-28 AT AT85304640T patent/ATE33671T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-28 DE DE8585304640T patent/DE3562267D1/de not_active Expired
- 1985-06-28 EP EP85304640A patent/EP0170415B1/en not_active Expired
- 1985-07-01 JP JP60142668A patent/JPH0662570B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| US4687747A (en) | 1987-08-18 |
| ATE33671T1 (de) | 1988-05-15 |
| CA1258424A (en) | 1989-08-15 |
| JPH0662570B2 (ja) | 1994-08-17 |
| EP0170415A1 (en) | 1986-02-05 |
| DE3562267D1 (en) | 1988-05-26 |
| EP0170415B1 (en) | 1988-04-20 |
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