JPS61117454A - ジギトキシン測定用螢光分極試験法、その試薬および試薬の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野良 本発明は液体、特に血清や血漿の様な生理学的流体中の
ジギトキシン量測定用の方法と試薬および試薬の製法に
関する。特に本発明は螢光免疫試験法およびその方法に
試薬として使われるトレーサーに関する。

（従来技術〕 ジギトキジンはうつ血による心臓障害治療に使われる心
臓グリコシドである。ジギトキシンが心筋症収縮の力を
増すに非常に有効であるが、治療濃度が毒性水準に非常
に近いので服用量は精密を要する。個人個人その反応が
変るから薬剤の血清又は血漿水準を検べて治療を注意深
く監視することが重要である。

一般に競合結合性免疫試験は試験試料中の配位子測定に
使われる（ここで“配位子”は競合結合する免疫試験法
によって定量測定される生理学的興味ある物質である〕
。配位子はラベル付試薬、又は１配位子同族体“又は゛
トレーサー”と配位子又は配位子同族体に特異的な抗体
上の限られた数の受容体結合位置をせり合う０試料中の
配位子濃度は抗体に結合する配位子同族体量を決定する
。配位子と配位子同族体は各々それぞれの濃度に比例し
て抗体に結合するから、結合する配位子同族体の量は試
料中の配位子濃度に逆比例である。

従来患者の血清／血漿ジギトキシン量は配位子同族体上
の放射性よう素（１２５−Ｉ）を用いる不均一放射免疫
試験により測定された。しかしこの試験は欠点なしでは
ない。

一般に放射性試験用具は寿命短かく放射活性による取扱
いと廃棄問題をもたらす。また不均一法は結合しない放
射性トレーサー（配位子同族体〕が測定を読みとる前に
結合トレーサーから分離されることを必要とした。なお
他の欠点は放射免疫試験の要する比較的長い培養時間（
３０〜６０分）であった。

螢光分極は競合結合する免疫試験で生じたトレーサー−
抗体配合体の定量測定法を提供する。螢光分極法は螢光
ラベル付化合物が平面偏光によって励起されると回転速
度に反比例の分極度をもつ螢光を発するという原理に基
づく。

したがって螢光ラベルをもつトレーサー−抗体配合体が
平面偏光によって励起されると、光が吸収されまた発射
される時間間の回転から螢光団がしいられるので発射光
は非常に偏光のままのこる。反対に結合しないトレーサ
ーが平面偏光によって励起されるとその回転は対応する
トレーサー−抗体配合体よりずつと速く分７はより無秩
序に配列される。

結果として結合しないトレーサー分子からの発射光は復
極される。この螢光分極法はＷａ　ｎ　ｇ　　らの米国
特許第４，４２０゜５６８号に応用されておυ、それは
螢光団としてトリアジニルアミノフルオレセイン部分の
使用をさしづしている。

本発明はこの分野において非常に敏感なトレーサー、ト
レーサーの製法およびトレーサーを用いる試験法がジギ
トキシン測定に特に提供される点でＷｔｈｎｇ　（Ｄ％
許以上の進歩を提供するものである。本発明によって行
なわれる試験は下に説明するとおり特に正確である０ （発明の概要〕 本発明はジギトキシンの螢光分極試験用のトレーサー、
この試験実施法およびトレーサーの製法に関する。

本発明の第１の態様は新規の構造をもつ独特なトレーサ
ーの発見に関する。本発明の第１の態様によれば式：で
示されるＮ　−（３’−（３’−デオキシジギトキシゲ
ニン〕−Ｘ−カルボキシフルオレセイン−Ｘ−アミド（
但しＸは５又は６とする〕化合物が提供される。弐Ａを
もつ化合物はまた３−アミノ−３−デオキシジギトキシ
ゲニンと５−又は６−カルボキシフルオレセインの反応
生成物ということができる。式中点線は３−アミノ−３
−デオキシジギトキシゲニン部分がフルオレセイン部分
上の５又は６位置を占めることを示している。弐Ａをも
つ化合物は試薬の均質混合物中において血清中のジギト
キシン存在を定量的に測定する試薬として有用である。

本発明の第２の態様によれば合成法、即ち３−アミノ−
３−デオキシジギトキシゲニンと５−又は６−カルボキ
シ　′フルオレセインの反応による弐Ａをもつ化合物の
製法が提供される。現在好ましい実施態様において反応
生成物は５−又は６−カルボキシフルオレセインの溶液
を生成しこの溶液を１，３−ジシクロへキシルカルボジ
イミド（Ｎ、Ｎ　−ジシクロへキシルカルボジイミド〕
およびＮ−ヒドロキシサクシニミドと接触させた後５−
又は６−カルボキシフルオレセイン混合物を３−アミノ
−３−デオキシジギトキシゲニン溶液と反応させる様な
アミド結合生成条件のもとて見られる。最も好ましい実
施態様において５−カルボキシフルオレセインはよりぬ
きの出発物質である。

本発明の第３の態様は分析方法、即ち試薬として弐Ａを
もつ化合物使用試験方法に関する。本発明の第３の態様
により試料をジギトキシン抗血清および均質溶液中ジギ
トキシン抗血清の存在を検出できる螢光分極応答を生じ
うる螢光ラベル付ジギトキシゲニン誘導体と接触させ、
均質溶液に平面偏光をとおしさつそれからの螢光分極応
答を測定する工程より成る改良螢光分極試験法が提供さ
れる。

更に目的とそれに伴なう利点は次の式と共に明細書およ
び実施例によってよく諒解されるであろう。

式１（下記する。以下同じ）はジギトキシン分子の構造
を示しており、その濃度は本発明の分析法によって測定
される。

式２は式４をもつ化合物合成用の好ましい反応体である
５−カルボキシフルオレセイン分子の構造を示している
。

式３は式４をもつ化合物合成用の他の好ましい反応体で
ある３−アミノ−３−デオキシジギトキシゲニン分子の
構造を示している。

式４は本発明の好ましいトレーサー、Ｎ　−（３’−（
３’−デオキシジギトキシゲニン））−５−カルボキシ
フルオレセイン−５−アミドの構造を示している。

式５は式２をもつ反応体と別の６−カルボキシ−フルオ
レセイン分子の構造を示している。

弐６は式４のものと別の本発明のトレーサー、Ｎ−（３
’−（３′−デオキシジギトキシゲニン））−６−カル
ボキシフルオレセイン−６−アミドの構造を示している
。

式７は式３と６の両別構造を示す簡略法を示している９
弐８は表１に対応し表１に記載の構造を示している。

Ｃ０２）１ （発明の詳細な説明〕 本発明は改良螢光分極免疫試験法にトレーサーとして用
いる試薬、試薬の合成法および血清、血漿、を髄液等を
含む人間体液の様な液体中のジギトキシン存在を試薬を
用いて定量的に検出する分析法に関する。

明確にいえば本発明により３−アミノ−３−デオキシジ
キトキシゲニンと５−又は６−カルボキシフルオレセイ
ンの反応生成物がジギトキシン同族体（トレーサー）を
生成することが発見されている。このトレーサーはジギ
トキシンの螢光分極試験に非常に有効である。この試験
法は均質溶液、即ち結合トレーサーと結合していないト
レーサーを分離することなく共に含む溶液中で行なうこ
とができる。

トレーサー製法について反応生成物はアミド結合生成に
通常使われる条件のもとてカップルされる。活性エステ
ル法はこの特殊な状態において望むアミド結合生成に最
も有効なのでこの方法を使うとよい。この反応は０乃至
約１００℃、好ましくは約Ｏ乃至約８０℃の温度条件で
行なわれ、反応時間は約０．５乃至約１４４時間の間で
変えうるうトレーサー製造のり在の好ましい方法は実施
例に詳記しである。

本発明のトレーサーは一般にその酸とイオン化状態の間
で平衡しており、イオン化状態において本発明の方法に
効果がある。故に本発明は酸又はイオン化状態のいづれ
かのトレーサーを含んでおシ、便宜上その構造は酸型で
あられされている。本発明のトレーサーがそのイオン化
状態である場合はトレーサーは生理学的に許容される塩
型で存在する。本明細書で使う“生理学的に許容される
塩”とは本発明のトレーサーが本発明の方法に使われる
ときそのイオン化状態で存在できるナトリウム、カリウ
ム、アンモニウムの様な塩をいう。一般に本発明のトレ
ーサーは塩として溶液中に存在し、特定塩は使用緩衝液
からえられる。例えばりん酸ナトリウム緩衝液の存在で
本発明のトレーサーは一般にす）　ＩＪウム堪としてそ
のイオン化状態で存在する。

抗体に複合されないトレーサーは螢光の吸収および再放
射に要する時間よりも短時間で自由に回転するっ結果と
して再放射された光は比較的無秩序に配向されるので抗
体に複合しないトレーサーの螢光分極は低くゼロに近い
。特定抗体と複合すると生成トレーサー−抗体複合体は
比較的小さなトレーサー分子の回転よりもおそい抗体分
子回転となるので分極増加が認められる□故に配位子が
抗体位置についてトレーサーと競合つとトレーサー−抗
体複合体の螢光の認められる分極はトレーサーとトレー
サー−抗体複合体の分極の間の値となる。試料が菌濃度
の配位子を含むならば認められる分極値は自由配位子の
値に近い、即ち低い。

試験試料が低濃度配位子を含むならば分極値は結合配位
子のそれに近い、即ち高い。免疫試験の反応混合物を垂
直に、次いで水平に偏光で励起し発射光の垂直成分のみ
を分析することにより反応混合物中の螢光分極は正確に
測定できる。

分極と測定される配位子濃度間の正確な関係は既知濃度
をもつ補正液の分極値を測定して確立される。配位子濃
度はこの様にしてつくった標準曲線から外挿できる。

本発明によって生成された特定トレーサー、Ｎ−（３’
−（３′−デオキシジギトキシゲニン））−５−カルボ
キシフルオレセイン−５−アミドおよびＮ−（３’−（
３’−デオキシシキトキシゲニン））−６−カルボキシ
フルオレセイン−６−アミドは螢光分極試験法において
驚くべき良好結果を生じ、特に前者が後者よりもよいこ
とが発見されているっ試験におけるトレーサーの効果は
２要素の組合せによると信じられる。第１にジギトキシ
ンの比較的少量の加水分解生成物誘導体（即ち３−アミ
ノ−３−デオキシジギトキシゲニン〕はかなシ小さな螢
光団部分（即ち５−又は６−カルボフルオレセイン〕と
混合して使われるのて配位子と螢光団部分は緊密に−し
よになっているので抗血清と複合した場合偏光の吸収と
放射間の不用な回転は厳重に制限される。第２にそして
驚くべきことは本発明の特定トレーサーはジギトキシン
抗血清に複合した場合目立った結合性と移動性を示す。

当業者はトレーサーの構造とジギトキシン分子構造閘の
実質的差違を考えて抗血清によってトレーサーが十分認
められると予期しないであろうから優秀な結合性は驚き
である。ジギトキシンは３つの糖基をもちそれらはすべ
てトレーサーにはなり。トレーサーは糖の飽和環の代り
に芳香族環をもちジギトキシン分子中の糖のヒドロキシ
ル基を欠く。トレーサーとジギトキシン分子は共に比較
的小さいので、尚業者は抗血清結合がジギトキシン構造
のどんな変化にも選択的であり敏感であると予想するで
あろう様に優秀な結合性は特に驚きである。比較的小さ
いジギトキシンとトレーサー分子が著しくちがう構造を
もつという事実にも拘らず、本発明のトレーサーの結合
性は目立っており、これについては、下に十分説明する
。

結果は正味ミリ分極単位、スパン（ミリ分極単位におけ
る〕および強さによって表示できる。ミリ分極単位の測
定はトレーサーの最大量がジギトキシンの全くない状態
で抗体に結合した場合の最大分極を示す。正味ミリ分極
単位が高い程トレーサーの抗体への結合はよいっスパン
は正味ミリ分極と抗体に結合したトレーサーの最少貸間
の差の表示である。より大きなスパンはデータのより良
い分析数値を与える。強さは背景上の信号の強度測定で
ある。故により高い強さはより正確な測定値を与える。

強さは垂直分極強さと水平分極強さの２倍との合計とし
てトレーサーの約２ナノモル（即ち約１．８−２．２ナ
ノモル〕濃度において決定される。

表■は本発明のトレーサーの正味ミリ分極単位、スパン
および強さについての結果がジギトキシゲニンと関連し
て他のどんな螢光団部分が使われた時えられた結果より
もずっとよいことを示している。また加水分解されない
ジギトキシン分子と関連してフルオレスセイン誘導体使
用の試みは成功しなかった。上に記載のとおシより大き
な分子が抗体受体位置に結合するときその分極保持力が
比較的よりいので本発明のトレーサーの利点はジギトキ
シゲニン部分とフルオレセイン部分の接近から生ずると
信じられる。しかしこの理論応用の驚くべき点は比較的
小さなジギトキシンとトレーサー分子間構造における実
質的差違のため本発明のトレーサーがジギトキシン特定
の抗血清によってうまく認められるということを予期し
なかった点である。故に本発明によってえられる驚くべ
き良好結果を説明するこの理論的仮説は限定と解釈すべ
きでないが、単にこの成功のもつともらしい説明として
考えられるのである０表　　１ １　５−カルボキシフルオレセ　２０８　　　　１１９
．４８　　約３０００イン（アミ申合をもつ〕 ■　　６−カルポキシフルオレセ　２００　　　　１０
０　　　　約１８００イン（アミド結合をもつ〕 ■　　４−アミノベンゾイル−５１１４，２９３８２４
００−力ルボキシフルオレセイ ン ■　　ピペラジニル６−カルホキ　　６８　　　　３５
　　　　３５００シフルオレセインウレタン ■　　ピペラジン　ＤＴＡＦ　　　　　１５．３５　　
（１０２４００（異性体Ｉ〕 ■　　ピペラジン　ＤＴＡＦ　　　　　５０．２７　　
　０　　　　２２００（異性体■） ■　ＤＴＡＦ（異性体１　）　　　　７６．３３　　５
０　　　２２００■　ＤＴＡＦ（異性体Ｉｔ）　　　　
２０　　　（１０２Ｂ００表１（つづき〕 ンーアミン（異性体Ｉ） ｘ　　４−アミノブチリル−５−２２０２３００カルボ
キシフルオレセイン Ｘ　　ヒドロキシルアミン　０−　　１１　　　　　（
１０１９００酢酸フルオレセインアミ ン（異性体■〕 刈　　サクシネート　フルオレセ　　２２　　　　　（
１０２２００インアミン（異性体Ｉ） アミン（異性体Ｉ） ＸＶ５−カルボキシフルオレセ　　３．８４　　　　０
　　　２７００イン（アミド結合なし、 エステル結合あシ〕 Ｘ■　トリジギトクソーゼ　５−　　０　　　　　　。

　　　３９０゜フルオレセイン 註・・・ｍＰはミリ分極。

＊・・・構造ＩからＸ■までの結合け３−デオキシジギ
トキシゲニンの３位置に対してである。構造ＸＭは末端
糖に結合した５−カルボキシフルオレセインをもつジギ
トキシンである。

本発明の試験法によればジギトキシンを含む又は含むと
思われる試料は式４又は６に示される様なトレーサーの
生理学的に許容される塩およびジギトキシンとトレーサ
ーに特定の抗体と混合される。トレーサーはカルボキシ
フルオレセインジギトキシゲニン誘導体である。ジギト
キシンとトレーサーは限定された抗体位置をせシ合いジ
ギトキシンー抗体およびトレーサー−抗体複合物を生成
する。トレーサーと抗体の濃度を一定に保つことにより
生成したジギトキシンー抗体複合物対トレーサー−抗体
複合物の比は試料中にあるジギトキシン量に直接比例す
る。故に混合物を平面偏光で励起してトレーサーとトレ
ーサー−抗体複合物によって放射された螢光の分極を測
定すれば試料中のジギトキシン景を定量測定できる。

本発明の方法実施におけるｐＨはジギトキシゲニントレ
ーサーをそのイオン化状態におくに十分でなければなら
ない。ｐＨは約３乃至１２、好ましくは約５乃至１０、
最も好ましくは約６乃至９でよいつ試験方法実施中ｐＨ
を保つに種々の緩衝剤が使用できる。代表的緩衝剤には
ボレイト、ホスフェイト、カーボネート、トリス、バル
ビタール等がある。本発明に使用する特定緩衝剤は重要
ではないが、トリスとホスフェート緩衝剤が好ましい。

緩衝剤の陽イオン部分が一般に溶液中のトレーサー塩の
陽イオン部分を決定するだろう。

本発明の螢光分極試験法用試薬はジギトキシンに特定の
抗体およびトレーサー、Ｎ−（３’−（３’−デオキシ
ジキトキシゲニン））−５−カルボキシフルオレセイン
−５−アミドとＮ　−（３’−（３’−デオキシジギト
キシゲニン））−６−カルボキシフルオレセイン−６−
アミドのいづれか（前者が好ましい〕より成る。またジ
ギトキシン前処理液、稀釈緩衝液、ジギトキシン補正液
およびジギトキシン対照液も便利につくられる。

これらの試薬の好ましい溶液はイリノイ州アボット　パ
ークのアボット　ラボラトリーズから市販されているっ
現在好ましいトレーサー調合液はｐＨ７，５における０
、１モルトリス緩衝液；０．１％（重量／容量〕ナトリ
ウム　ドデシルサルフェート；０．１％ナトリウムアザ
イドおよび０．０１チ牛ガンマグロブリン中の１８．２
ナノモルトレーサーである。抗血清調合液はエチレンク
リコール２％（重４／容量〕を含むＴＤ−稀釈緩衝液で
稀めた兎血清より成る。稀釈緩衝液はｐＨ７，５におけ
る０、１モル　ナトリウムホスフェート：０．１％（重
量／容量〕ナトリウムアザイド：および０．０１％（重
量／容量）牛ガンマグロブリンより成る。前処理液はｐ
Ｈ７，５における０、１モルトリス緩衝液；０．１チ（
重量／容量〕ナトリウムアザイド；０．５％（重量／容
量〕銅サルフェート；および１０．０％（重量／容量〕
５−スルホサリチレートより成る。ジギトキシン補正液
はジギトキシンと通常の人血清より成りミリリットル中
０．０．５．０．１０．０．２０．０．４０．０および
８０ナノグラム濃度とし０．１チナトリウムアザイド保
存剤を含む。ジギトキシン対照液はジギトキシンと通常
の人血清より成シミリリットル”５Ｆ）７．５．１５，
０および３５．０ナノグラム濃度とし０．１％ナトリウ
ムアザイド保存剤を含む。

本発明の好ましい改良試駆法を更に詳述するっジギトキ
シンの血清蛋白質への非常に強い結合性（＞９０）のた
め血清試料中の蛋白質を沈澱させる抽出工程が使われる
が、存在ジギトキシンの９７％が回収される。しかし試
験は“均質試験法”であり、それは結合トレーサーが結
合しないトレーサーから分離されない溶液から最終分極
読みがとられることを意味する。これは例えば読みをと
る前に結合放射性トレーサーを結合していない放射性ト
レーサーから分離する必要がある放射免疫試験法よりも
明らかに利点である。

本発明の好ましい試験法によればジギトキシン補正液、
対照液および未知試料は同じ方法でつくる必要があるつ
アボツ）　ＴＤｘ”分極分析器に関連して使う様設定さ
れた好ましい方法では１００μｔの血清又は血漿試料を
ラベル付き遠心分離管にピペットでとる。ＴＤ−プレシ
ジョンディスペンサーの様なピペットはメタノールで満
され気泡を抜いである。次いで配分注射器先端を遠心分
離管壁につけメタノールを流して各管にメタノール３０
０μｔを分配する。試料を全部ピペットでとった後者遠
心分離管の栓をしてヴオルテツクス混合機上で３〜５秒
間混合した。管を遠心分離機ヘッド内におき遠心分離機
ヘッドがバランスする補管は平均して分散させておく必
要がある。試料は次に９５００）ｌにおいて少なくも３
分間又は透明上澄液と変質蛋白質の硬い緻密なペレット
がえられるまで遠心分離されるっ遠心分離完了後、各管
の栓をとり上澄液をＴＤｘ■試料カートリッジ又は同様
のものの対応する試料容器に傾瀉する。好ましいＴＤｘ
試験法によれば３００μｔの上澄液試料が必要なので試
料容器に上澄液の最後の一滴を移すまで注意を要する。

これは試料カー）　ＩＪッジ端上で遠心分離管をたたい
てできる。

ＴＤＸジギトキシン試験試験用炉箱Ｄｘ分析器と共に使
われるならば、ＴＤｘジギトキシン試薬包み中の３びん
の各栓をとりＴＤＸ分極分析器内の指定容器に入れこの
時点から試験法は十分自動でなされる。

入力試験法がなされるならば処理試料が稀釈緩衝液と混
合される。抗体と前処理液を試料入り試験管に入れ基本
読みをとる。次いでトレーサーと稀釈緩衝液を試料に加
え培養後螢光分極読みをとる。

補正液、対照液および試料量々の螢光分極値が測定され
アボットＴＤＸ分極分析器の様な器機の出力テープ上に
プリントされる。非直線回帰分析を用いて各補正液の分
極Ｐ対その濃度をプロットして標準曲線を器機内につく
った。

各対照液と試料の濃度は貯えられた補正曲線をよみ出力
テープにプリントする。

前記の好ましい方法に関してはジギトキシントレーサー
、抗体、前処理液、補正液および対照液は約２乃至約８
℃の貯蔵所から出した直後使用する必要があるが、稀釈
後緩衝液は室温で貯えねばならないのである。標準曲線
と対照液は２週間毎に試験する必要があシ、各補正液と
対照液は２個で試験する。対照液は名バッチ毎に試験を
要しまた試料は全部２個で試験する。遠心分離は沈澱蛋
白質の硬い緻密なペレットをつくるために十分な時間（
普通少なくも約３分、時にはもう少し長く）する必要が
あるのである。沈澱しない蛋白質の浮遊片はプローブを
つめサンプリングの再現性をわるくする。結局新しい血
漿試料、異常に高い蛋白質含量をもつ試料又は極めてリ
ペミツクな試料は望む３００μを上澄液をえることがで
きないのでちる。この場合遠心分離時間は例えば５分ま
で延ばすことができ又は試料量を１５０μｔに増すこと
ができ又は遠心分離時間は３分に保つがメタノール量を
４５０μｔに増すことができる。試験の感度はジギトキ
シンー当９１．０ナノグラムでありまた試験のジギトキ
シンに対するクロス反応性は１０チ以下である。１７８
臨床試料を用いる市販の放射免疫試験法に比べた時線最
少２乗回帰分析法は１．０６０のスロープ、０．７２９
のインターセプトおよび０．９６７の相関係数を与えた
。

前記明細書と下記実施例は例証のためのものであるが、
本発明の範囲を限定するものではない。種々の修正法も
この分野の知識ある者には明白であろう。本発明の範囲
は特許話求範囲によって説明されていると考える。

実施例Ｉ アセトン４−中にジギトキシゲニン０．２２の温溶液に
Ｊｏｎｅｓ　　試薬０．２ｍｌを加えた０溶液を室温で
約３０分攪拌し水１５−で稀め冷凍機で冷したつピペッ
トで溶媒をとり結晶性ケトンを分離した。水１５ｆｎｔ
で水洗後、固体をメタノール２−にとかしアンモニウム
アセテ−）０．３４Ｆとナトリウムシアノボロハイドラ
イド０．０４５’を加えた。室温において１８時間攪拌
後溶液に水２０ｍ１を加えクロロホルム２０ｍで３回抽
出した。クロロホルムを真空除去して白色泡状物をえた
。これを最少クロロホルムにまたとがし４倍量のヘキサ
ンで稀め１時間後沢過して生成物３−アミノ−３−デオ
キシジギトキシゲニン白色結晶をえた。

実施例■ Ｎ　−（３’−（３’−デオキシジギトキシゲニン））
−５−カルボキシフルオレセイン−５−アミドの製造乾
燥ピリジン０．５−中の５−カルボキシフルオレセイン
０．０１４３ｒ、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド０．０１
３７オよび１，３−ジシクロへキシルカルボジイミド０
．０２１５２の溶液を室温において１８時間攪拌した。

これに乾燥ピリジン０．２ｍｔ中に３−アミノ−３−デ
オキシジギトキシゲニン０．０２Ｓ’の液を加え室温に
おいて１０時間撹拌した。

２０Ｘ２０ＣｒＲ１０，５燗シリカゲル板上クロマトグ
ラフ法によ、９６０／４０／２比のエチルアセテート／
ヘキサン／酢酸を用いまたメタノールで適当バンドを集
めて稍不純物のある生成物をえた。２０Ｘ２０Ｃｎ１０
．５＋ｍシリカゲル２板上でクロマトグラフ法によ５２
４０／１０／１比のジエチルエーテル／メタノール／酢
酸を用い数回溶離して３−アミノ−３−デオキシジギト
キシゲニンの５−カルボキシフルオレセイン配合物をえ
た。

実施例■ Ｎ−（３’−（３’−デオキシジギトキシゲニン））−
６−カ乾煉ピリジン０．５ｒｎｔ中の６−カルボキシフ
ルオレセイン０．０１Ｆ、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド
０．ＯＯ’ｌおよびジシクロへキシルカルボジイミド０
．０１ＦＭの溶液を室温で２時間撹拌しこれに乾燥ピリ
ジン０．２葱中に３−アミノ−３−デオキシジギトキシ
ゲニン０．０１４ｒの溶液を加えた。これを室温で１８
時間攪拌後２０Ｘ２０ｍシリカゲル板上に入れ２０／３
０／１比のヘキサン／エチルアセテート／酢酸で溶離し
た。メタノールで適尚バンドを集め純６−カルボキシフ
ルオレセイン　３−アミノ−３−デオキシジギトキシゲ
ニン配合物をえたつ 特許出願人　　アボット　　ラボラトリーズ代理人　弁
理士　斉Ｂ　ｍ：：彦７’）：、ｆ：！〃　　　　　〃
　　　川　瀬　良　治っ４゛−１！蔦 −、−、’、：　／

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、３−アミノ−３−デオキシジギトキシゲニンと５−
   カルボキシフルオレセイン又は６−カルボキシフルオレ
   セインの反応生成物より成ることを特徴とするジギトキ
   シンの定量測定用試薬。 ２、試薬がＮ−（３′−（３′−デオキシジギトキシゲ
   ニン））−５−カルボキシフルオレセイン−５−アミド
   より成る特許請求の範囲第１項に記載の試薬。 ３、試料をジギトキシン抗血清と接触させ、えた溶液を
   、ジギトキシン抗血清の存在を検出できる螢光分極応答
   を生じまた均質試験溶液を生成しうるカルボキシフルオ
   レセインジギトキシゲニン誘導体と接触させ、 均質試験溶液に平面偏光をとおして螢光分極応答をえ、
   該応答から試料中のジギトキシン量を測定する工程より
   成ることを特徴とするジギトキシンの濃度測定法。 ４、カルボキシフルオレセインジギトキシゲニン誘導体
   がＮ−（３′−（３′−デオキシジギトキシゲニン））
   −５−カルボキシフルオレセイン−５−アミドである特
   許請求の範囲第３項に記載の方法。 ５、カルボキシフルオレセインジギトキシゲニン誘導体
   がＮ−（３′−（３′−デオキシジギトキシゲニン））
   −６−カルボキシフルオレセイン−６−アミドである特
   許請求の範囲第３項に記載の方法。 ６、５−カルボキシフルオレセイン又は６−カルボキシ
   フルオレセインと３−アミノ−３−デオキシジギトキシ
   ゲニンを反応させる工程より成ることを特徴とするＮ−
   （３′−（３′−デオキシジギトキシゲニン））−５−
   カルボキシフルオレセイン−５−アミド又はＮ−（３′
   −（３′−デオキシジギトキシゲニン））−６−カルボ
   キシフルオレセイン−６−アミドの製法。