JPS584782B2 - チロキシンを定量するための放射免疫測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は放射免疫測定方法に関し、更に特定するならば
、未抽出血清中のＬ−｝リョードチロニンおよびチロキ
シンを試験管内測定するための放射免疫測定方法、試薬
及びパッケージ式試験キットに関する。

Ｌ−４リョードチロニン（３，５．３’一Ｌ−｝リョー
ドチロニン又はＴ３）は１９５２年に発見されて以来ず
つと注目されてきた。

何故なら、この天然産ホルモンは、たとえ血清中に存在
するその濃度がチロキシン（Ｔ４）よりはるかに低くて
もその生物学的効力がＴ４より大きいからである。

或る時期、Ｔ４は、血液中の有機よう素含有物質の約９
０％を構成すると認められた。

血漿中のＴ４が最初に実証された後、Ｔ３が第二の循環
ヨードーアミノ酸として同定された。

そして、Ｔ３はＴ４と同様に通常の甲状腺分泌物である
ことが示された。

Ｔ３とＴ４は放射性よう素で容易に標識され、而してそ
の容易さにより、実験動物はもとより人におけるこれら
化合物の代謝に関する詳細で且つ多くの動力学的研究が
可能になった。

Ｔ３は、その血清中でのレベルがＴ４と比べて低いにも
かかわらず甲状腺ホルモンの熱生産効力の大部分を与え
ることで評価されている。

更に、Ｔ３は有効甲状腺ホルモンであるがＴ４は前駆体
又はプロホルモンとして働くにすぎないとさえ示唆され
てきた。

いずれにせよ、甲状腺障害の診断においては、Ｔ３レベ
ルの定量を考慮せねばならない。

初期の血漿中のＴ３測定は、抽出及び精製、そしてこれ
に続くペーパークロマトグラフィー、気液クロマトグラ
フイー又は置換分析によっていた。

これら各種の方法で遭遇される技術上の大きな問題及び
方法間の矛盾のために、得られた値は仮りのものにすぎ
ぬと考えられた。

最近、放射免疫測定（ＲＩＡ＝ｒａｄｉｏｉｒｒｍｕｎ
ｏａｓｓａｙ）方法が未抽出血清中のＴ３を直接定量す
べく開発された。

この方法は、たん白質結合剤として競合的に抗体とたん
白結合する（ＣＰＢ＝ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ）の原理に基いており、他の
試験管内甲状腺試験よりも大きい固有の特異性及び感度
を示す方法を可能にするものである。

放射免疫測定の競合的抑制の原理に従えば、未知の血清
試料中の標識されてない又は非放射性の抗原（Ｔ３）が
標識された放射性抗原（Ｔ３）と競合して抗体と結合し
而してそれにより標識された抗原の結合が減少する。

未知試料中のＴ３抗原の濃度を定量するためには、未知
試料中で観察される競合的抑制の度合が、既知の標準溶
液で得られたものと比較される。

文献（ＳｅＫａｄｄｅ等、ＣＩｉｎ．Ｃｈｅｍ． １９
／９、１０１６〜１０２１（１９７３））に報告されて
いるように、Ｔ３を定量するための既知の放射免疫測定
方法は、一定量のＴ３抗体に標識されてないＴ３の標準
物又は未知溶液を添加し次いで一定量の標識された放射
性Ｔ３を添加することに基いている。

また、この混合物には、Ｔ３がチロキシン結合性グロプ
リンに結合するのを抑制する禁止剤が具合よく添加され
る。

得られた混合物は普通４℃で１６〜７２時間温置され、
続いて抗体に結合したＴ３が、多くの方法のいずれかに
よって未結合Ｔ３から分離される。

ＳｅＫａｄｄｅ等が報告せるＴ３の放射免疫測定方法に
おいては、チロキシン結合性グロプリンにＴ３が結合す
るのを抑制する禁止剤８−アニリノー１−ナフタリンス
ルホン酸（ＡＮＳ）を含む緩衝溶液がピペットで一連の
試験管に入れられる。

また、試験管の或るものには、既知量のＴ３を含有する
一連の標準溶液が夫々添加され、他の試験管には未知の
血清試料が添加される。

更に、標準溶液を入れた試験管全てに、Ｔ３を含まない
血清が添加される。

次いで、緩衝溶液、抗体及び放射性Ｔ３がこれら試験管
に加えられ、得られた混合物は３７℃で３０分間温置さ
れる。

冷却後、ポリエチレングリコール溶液が加えられて抗体
結合Ｔ３錯体を沈澱させ、上澄み流体がアスピレータで
除去され、そしてこの沈澱がガンマ線シンチレーション
計数管によりカウントされる。

次いで、Ｔ３値が記述の如く算出される。著者はＴ３を
含まない血清は毎週調製すべきであり、且つ８−アニリ
ノー１−ナフタリンスルホン酸の緩衝溶液は毎日調製す
べきであることを述べている。

Ｍｉｔｓｕｍａ等は、ガラス管への未知血清試料又は標
準Ｔ３−Ｔ４溶液、放射性Ｔ３及びＴ４の溶液、禁止剤
溶液及び抗体溶液を順次添加し続いて検定混合物の３７
℃、９０分間を温置することを包含する。

未抽出血清中のＴ３及びＴ４の同時定量のための放射免
疫測定を説示している。

［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏ
ｎｓ Ｖｏｌ．４６、Ａ６、Ｐ２１０７〜２１１３（１
９７２）工この温置後、抗体結合Ｔ３と未結合Ｔ３の分
離がデキストランー炭の溶液を使用して行なわれ、生じ
た二つの面分はガンマ線計数管でカウントされる０ また、類似の処理工程を含む未抽出血清中のＴ３を定量
するための他の放射免疫測定方法が文献に報告されてい
る。

〔例えば、Ｈｕｆｅｒ等、Ａｃｓａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏ１ｏｇｉｃａ，７２（１９７３）、４６４〜４７４；
Ｈｕｆｎｅｒ等、ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａ Ａｃ
ｔａ，４４（１９７３）、１０１〜１０７；Ｈｅｓｃｈ
等、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ
、１９７３、１、６４５〜６４８及びＤｏｃｔｅｒ等、
Ｅｕｒｏｐ−Ｊ−Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ａｂｓｔｒ
ａｃｔｓ，Ｖｏｔ．３、Ａ３（１９７３）、２２４−２
２５）。

未抽出血清中のＴ３を定量するための知られた或る種の
放射免疫測定方法は臨床用途に適するかもしれないが、
これらの方法は、時間がかかり且つ（又は）技術者側に
多くの手順操作を要求しそのため誤差が生じやすく測定
結果の精度及び再現性に影響するのでその有用性には限
りがある。

したがって、Ｔ３放射免疫測定方法を実施するのに用い
られる市販の試験キットは典型的には多数の試薬を含み
、それらの臨床的な使用は、試薬の調製及び（又は）放
射免疫測定の実施に多くの時間を費す操作を必要とする
。

前述のように、斯界においては、チロキシン結合性グロ
プリンによるＴ３の結合を抑制する禁止剤を用いること
が普通で、文献にもサリチル酸ナトリウム、メルチオレ
ートジランチン及びテトラクロルチロニンのような各種
の禁止剤の使用が報告されている。

また、８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸が禁止
剤として使用されることが前出のＭｉｔｓｕｍａ等によ
り提案された。

しかしながら、この化合物はチロキシン結合性グロプリ
ンによるＴ３の結合の有力な禁止剤であり、また今まで
に試験された中で最も有効な禁止剤として報告されてき
たけれども、それはＴ３の抗体結合性を抑制するという
重大な欠点を有している。

（Ｈｕｆｎｅｒ等、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ
Ａｃｔａ ４４（１９７３）、１０１〜ｌ０７］。

さらに、８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸は、
最高純度のものでなければ有効な禁止剤として機能しな
いか又は再現性ある結果を生じないことがわかった。

また、Ｔ４の放射免疫測定の知られた方法は、チログロ
プリンに対する抗血清（Ｃｈｏｐｒａ，Ｉ．Ｊ．Ｊ．Ｃ
Ｉｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．３４：９３８（１９７２）〕、
Ｔ４と牛血清アルプミン（ＢＳＡ）との結合体及び人血
清アルプミン（ＨＡＳ）と卵白アルプミン（ＯＡ）との
結合体に対するＴ４一特異性抗体（Ｍｅｉｎｈｏｌｄ，
Ｈ．及びＷｅｎＺｅｌ，Ｋ．Ｗ．，Ｈｏｒｍ−Ｍｅｔａ
ｂ．Ｒｅｓ．６（１９７４）１６９〜１７０〕、並びに
Ｔ４アルプミン結合体の注射に呼応して産生される抗体
の使用を包含してきた。

しかしながら、特異性及びアビデイテイ（ａｖｉｄｉｔ
ｙ）の高いＴ４抗血清を使って、Ｔ４定量のための放射
免疫測定方法に高い感度と改善された再現性をもたらす
ようにすることが望ましい。

本発明の目的をいくつか挙げるなら、それは比較的迅速
に実施することができ、しかも測定を行なう技術者の側
の所要手順操作が少ない未抽出血清中のＬ−トリヨード
チロニンを定量するための改良された放射免疫測定方法
を提供すること；測定結果の感度、精度又は再現性に影
響することなく所要手順操作を少くした如上の方法を提
供すること；未抽出血清中のＬ−｝リョードチロニンを
定量するための放射免疫測定方法の実施を容易にする新
規な組合せ試薬を提供すること：放射免疫測定によって
未抽出血清中のＬ−｝リヨードチロニンを敏感に定量す
るための実用的且つ簡便な手段を与える新規なパッケー
ジ式試験キットを提供すること；未抽出血清中のチロキ
シンを定量するための改良された放射免疫測定方法を提
供すること；高い特異性および感度ならびに改善された
再現性を示す上記測定方法を提供すること；チロキシン
の放射免疫測定に用いられる新規な抗血清および抗血清
を産生ずる新規なインムノーゲンを提供することである
。

その他の目的は一部は明らかであり、また一部は以下に
おいて指摘する。

概括するに、本発明は、放射性Ｌ−｝リヨードチロニン
とＬ一トリョードチロニンのチロキシン結合性グロプリ
ンに対する結合を抑制する禁止剤とを含有する緩衝溶液
から本質上なる試薬にＬ−トリョードチロニン含量を定
量しようとする血清試料を混合し、この混合物にＬ−｝
リョードチロニンと免疫反応できる抗体を含有する抗血
清を添加し、得られた混合物を抗体結合Ｌ−｝リヨード
チロニンと未結合Ｌ一トリョードチロニンとの実質的平
衡をもたらすのに十分な時間或る温度で温置し、抗体結
合Ｌ−｝リョードチロニンから未結合Ｌ−｝リョードチ
ロニンを分離し、抗体結合放射性Ｌ−｝リョードチロニ
ンと未結合放射性Ｌ−トリョードチロニンとの相対量を
決定する諸工程を包含する、未抽出血清中のＬ−｝リョ
ードチロニンを試験管内定量するための放射免疫測定方
法に関する。

本発明のＴ３放射免疫測定方法の他の具体例においては
、血清試料と混合する試薬が、放射性Ｌ一トリョードチ
ロニン、Ｌ−｝リョードチロニンのチロキシン結合性グ
ロプリンに対する結合を抑制する禁止剤及びＬ−｝リョ
ードチロニンと免疫反応できる抗体を含有する抗血清を
含む緩衝溶液から本質上なる。

また、本発明は、本発明のＴ３放射免疫測定方法に用い
られる上記試薬に関する。

さらに、本発明は、（ａ）放射性Ｌ−｝リヨードチロニ
ントＬ−｝リヨードチロニンのチロキシン結合性グロプ
リンに対する結合を抑制する禁止剤とを含有する緩衝溶
液、（ｂ）Ｌ−｝リョードチロニンと免疫反応できる抗
体を含む抗血清を含有する緩衝溶液、及び（ｃ）イオン
交換樹脂より本質上なる膜の複数個の比較的薄いストリ
ップの組合せよりなる、前記放射免疫測定方法に用いら
れるパッケージ式試験キット、並びに緩衝溶液（ａ）が
さらにＬ−トリョードチロニンと免疫反応できる抗体を
含有する抗血清を含むパッケージ式試験キットに関する
。

さらに、本発明の他の特色は、Ｌ−｝リョードチロニン
のチロキシン結合性グロプリンに対する結合を抑制する
禁止剤として８−アニリノー１ーナフタリンスルホン酸
のマグネシウム、カルシウム及びアルカリ金属塩を使用
することにある。

本発明のＴ４放射免疫測定方法において、その方法は、
牛血清アルプミンに結合したチロキシンのＮ−アセチル
誘導体と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノブロビ
ル）カルボジイミドとの結合体を含むインムノーゲンか
ら産生された、チロキシンと免疫反応できる抗体を含有
する抗血清を使って実施される。

この新規な抗血清とこれを産生ずるインムノーゲンは本
発明のこの具体例の別の特徴を構成する。

第１図は、Ｌ−｝リョードチロニンのナノグラムパーセ
ント（ｎｇ％）として表わしたＬ−｝リョードチロニン
の標準溶液濃度に対し結合放射性Ｌ−｝リヨードチロニ
ンのバーセント（％）をプロットすることにより得られ
た標準曲線の例を示すグラフである。

第２図は、チロキシンのミクログラムパーセント（μｔ
％）として表わしたチロキシンの標準溶液濃度に対し結
合放射性チロキシンのパーセント（％）をプロットする
ことにより得られた標準曲線の例を示すグラフである。

本発明に従えば、前記の目的及び他の目的は、未抽出血
清中のＴ３を定量するための知られた放射免疫測定方法
を修正変更することによって達成される。

本発明のＴ３放射免疫測定方法の一具体例（第一具体例
）において、放射免疫測定方法の第一工程は、Ｌ−｝リ
ョードチロニン含量を測定しようとする血清試料に組合
せ試薬を混合することよりなる。

本発明に従うこの組合せ試薬は、放射性Ｔ３とＴ３のチ
ロキシン結合性グロプリン（ＴＢＧ）に対する結合を抑
制する禁止剤とを含有する緩衝溶液から本質上なる。

しかして、緩衝剤、放射性Ｔ３及び禁止剤が溶液形態で
混合され且つ冷凍状態で相当長い期間（例えば３ケ月）
貯蔵してもその活性を保持できることが見出された。

このような組合せ試薬の使用は、技術者側のいくつかの
手順工程を有利に排除し而して該工程に付随する誤差の
可能性をなくする。

かかる望ましい試薬の組合せは技術者側に課される時間
浪費型操作を排除するだけでなく測定の精度、感度又は
再現性に悪影響を与えずにこの目的を達成することがわ
かった。

この組合せ試薬は、知られた有効量のべロナール緩衝溶
液、放射性Ｔ３及びＴ３がＴＢＧに結合するのを抑制す
る禁止剤を含有する。

試薬中の放射性Ｔ３の初期定量は試薬の初めにガンマ線
計数管で行なわれる。

放射性Ｔ３はよう素−１２５を含有するＴ３が好ましい
が、よう素−１３１又は他の放射性同位体を含有するＴ
３も本発明の実施に用いられうる。

ベロナール緩衝溶液はナ｝リウムバルビタールを用いて
調製されるが、またこのものは望ましくない金属イオン
をキレート化するためにエチレンジアミン四酢酸のよう
なキレート剤を含有し且つまたナトリウムアジドの如き
保存剤も含有する。

好ましくは、この緩衝溶液は８．６〜８．８のｐＨを有
する。

試薬の禁止剤成分としては、斯界に知られた各種禁止剤
の任意のものが用いられうるが、就中サリチル酸ナトリ
ウム、メルチオレート、ジランチン、テトラクロルチロ
ニン及び８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸を挙
げることができる。

しかしながら、後者の禁止剤は、Ｔ３の抗体結合性を抑
制するものとして報告されてきた。

また、８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸は、高
純度でないと再現性のない結果を生じる。

然るに本発明に従えば、８−アニリノー１−ナフタリン
スルホン酸のマグネシウム、カルシウム及びアルカリ金
属塩はＴＢＧに対するＴ３結合性を抑制する有効な禁止
剤であるが、Ｔ３の抗体結合性を有意には抑制しないこ
とがわかった。

かくしてこれらの塩類は８−アニリノー１−ナフタリン
スルホン酸の精製形と見なすことができる。

マグネシウム塩は、本発明の放射免疫測定方法及び試薬
に使用するのに好ましい禁止剤であるが、その他の塩類
も同様に使用されうる。

後記する如く、８−アニリノー１−ナフタリンスルホン
酸マグネシウムの製造では、遊離酸出発物質はタール状
生成物を含むべきでない。

同様の態様でカルシウム及びアルカリ金属塩（例えば、
ナトリウム及びカリウムが製造されうる。

８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸のマグネシウ
ム塩は、−２０℃のデシケータ中で貯蔵するときは少な
くとも４ケ月安定である。

血清の未知試料と組合せ試薬との混合後、このものに、
Ｔ３と免疫反応できる抗体を含有する抗血清が加えられ
る。

存在する抗体はＴ３に対する特異性を有するが、しかし
それは、Ｔ４又はモノ及びジョードチロシンと試験管内
で免疫反応できない。

かくして、所定量の抗体により結合された放射性Ｔ３の
量は標識されてないＴ３の存在で未知の血清試料から減
少し、而してその効果は標識されてないホルモンの濃度
に正比例する。

本発明に用いられるＴ３と免疫反応できる抗体を含有す
る抗血清を製造するのに斯界で知られた方法が使用され
うる。

例えば、Ｔ３に対して非常に特異的な抗体を含有する抗
血清はＨｅｓｃｈ及びＨｕｆｎｅｒがＥｕｒｏｐｅａｎ
Ｔｈｙｒｏｉｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｂｅｒｎ
（１９７１）及びＡｃｔａ ｂｉｏｌ−ｍｅｄ．ｇｅｒ
ｍａｎｉｃａ ２８（１９７２）、３５１並びにＡｃｔ
ａ ｅｎｄｏｃｒ．７２（１９７３）、４６４〜４７４
に報告した方法によって製造することができる。

この抗血清は、斯界に知られた１−エチル−３−（３−
ジメチルアミンプロピル）カルポジイミド方法によって
牛血清（ＢＳＡ）に結合させたＴ３−メチルエステル塩
酸塩を兎に注射することにより産生される。

Ｔ３に対して優れた特異性を示す抗体を有する抗血清は
、カルボジイミドで牛血清アルプミンに結合したＴ３を
兎に注射することにより産生される。

［Ｓｉｅｇｅｌ等、Ｊ．ＣＩｉｎ−Ｅｎｄｏｃ．３７、
５２６〜５３２（１９７３））。

また、Ｔ３と免疫反応できる抗体を含有する有用な抗血
清は、カルボジイミドで牛血清アルブミンに結合したＴ
３のＮ−アセチル誘導体を用いても産生されうる。

この結合体又はＴ３−メチルエステル塩酸塩一ＢＳＡ結
合体を有用な抗血清産生のためのインムノーゲンとして
使用することは好ましい。

なぜなら、かかる結合体は、Ｔ３の遊離アミン基又は遊
離カルボキシル基を除去することによってＴ３−Ｔ３錯
体の形成を防止するからである。

Ｔ３に対し特異性を示す抗体を含有する他の抗血清例え
ばＴ３一人血清アルプミン結合体を用いて産生されたも
のも本発明の実施に使用されうろことは理解されよう。

抗血清を本発明の放射免疫測定方法に用いるには、トレ
ーサー量の放射性Ｔ３が６０〜７５係結合している程度
に抗血清を希釈することが好ましい。

即ち、このための希釈度は１：１００より太きい。

抗血清が血清試料と前記組合せ試薬との混合物に加えら
れたなら、それによって生じた混合物は、抗体結合Ｔ３
と未結合Ｔ３との実質的平衡をもたらすに十分な時間或
る温度で温置される。

温置の間、希釈された抗血清中の抗体は放射性Ｔ３及び
血清Ｔ３（又はＴ３標準溶液）の存在下で免疫性錯体を
形成する。

Ｔ３ｅ定量するための放射免疫測定方法では上記混合物
は４℃で１６〜７２時間慣例的に温置されるけれども、
３７℃でのさらに短い温置時間が報告されている（Ｓｅ
ｋａｄｄ＃７）前出文献）。

本発明を実施するのに従来の温置時間及び温度が用いら
れうるが、温置工程は３７℃でほゞ１時間行なわれるこ
とが好ましく、しかる後抗体によるＴ３の結合が実質的
平衡に達するとわかった。

温置工程が完了したならば、未結合のＴ３が抗体結合Ｔ
３から分離される。

分離は斯界に知られた種々の方法で実施され得る。

かくして未結合Ｔ３と抗体結合Ｔ３は、例えば、混合物
を別の抗体とともに温置して抗体結合画分を沈澱させる
ことにより分離されうる。

この抗体結合画分はまた、硫酸アンモニウム、硫酸ナト
リウム及びトリクロル酢酸の如き物質並びにジオキサン
、エチルアルコール、アセトン又はポリエチレングリコ
ールの如き溶剤により非特異的に沈澱せしめられうる。

さらに、結合Ｔ３と遊離放射性Ｔ３の分離は、粒形陰イ
オン交換樹脂、デキストラン被覆炭、タルク及びカオリ
ンの如き物質による吸着によって達成されうる。

本発明の好ましい具体例では、分離は室温でほぼ１時間
にわたり、混合物をイオン交換樹脂より木質上なる膜の
比較的薄いストリップと接触させることによって具合よ
く行なわれる。

本発明に用いられうるイオン交換樹脂膜は、解離性陽イ
オン基又は陰イオン基の結合した不溶性重合体マトリッ
クスよりなる固体含水ゲル（好ましくは、或る種の適当
な繊維質材料で補強されている）の比較的薄いストリッ
プ、シート又はフィルムである。

この種の有用な樹脂膜は多数知られている。

例えば、これらのものに米国特許第２７３０７６８号同
２７８０６０４号、同２８００４４５号及び同２８６０
０９７号に記載されているものがある。

例えば、本発明に有用な市販の陰イオン選択性樹脂は、
商品名［ＡＲ−１１１」（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
州Ｗａｔｅｒ−ｔｏｗｎ所在のＩｏｎｉｃｓ Ｉｎｃｏ
ｐｏｒａｔｅｄ社製）として市販されているものである
。

この樹脂ストリップを試験びん及び標準又は対照びんに
入れたならば、これらのびんに栓をし、室温で１時間回
転させるが如くしてその内容物を温置する。

回転時間は未知試料と対照試料とで同じくすべきである
。

温置工程の終了後、樹脂ストリップは鉗子によって取出
し、廃棄する。

しかして抗体結合放射性Ｔ３と未結合放射性Ｔ３の相対
量が決定される。

好ましくは、これは各びん中の放射性Ｔ３をガンマ線計
数管で測定することにより達成される。

Ｔ３の血清濃度は、樹脂ストリップを取り出しタ後のび
ん内成分のカウント数によって示される。

抗体結合した放射性Ｔ３の百分率は次のようにして算出
される。

非放射性Ｔ３（患者又は標準試料）の増量に伴って、抗
体に結合した放射性Ｔ３の係は減少する。

この原理に基いて、一連のＴ３標準試料の各々と結合し
た放射性Ｔ３の係をその個々のＴ３濃度に対しプロット
することによって標準曲線が作製される（第１図の例示
的な標準曲線を参照）。

而して、患者の血清試料中の結合放射性Ｔ３のｉ標準曲
線と比較することにより、患者の全循環血清Ｔ３濃度が
容易に決定される。

本発明のＴ３放射免疫測定方法の別の具体例（第二具体
例）においてＴ３の放射免疫測定の第一工程として未知
の血清試料と混合される組合せ試薬は、放射性Ｔ３、Ｔ
３のチロキシン結合性グロプリンに対する結合を抑制す
る禁止剤及びＴ３と免疫反応できる抗体を含有する抗血
清を含む緩衝溶液より構成される。

この測定方法の残る後続工程は、前掲の第一具体例に関
して記述した通りである。

この第二具体例の放射免疫測定方法は、放射免疫測定方
法による数多くのＴ３定量を毎日又は毎週行なう病院、
臨床研究所などで用いるのに特に有利である。

緩衝剤、放射性Ｔ３、禁止剤及びＴ３抗血清を有効且つ
正確な量で含有する新規な組合せ試薬は、１日又は１週
間の如き所定の期間病院又は研究所などの需要を満すに
十分な容量で大量調製することができる。

しかして、放射免疫測定方法は、Ｔ３含量を定量しよう
とする血清試料を単に試薬と混合するだけで開始され、
後は既述の如きこの方法の後続工程を以て進められる。

かくして、組合せ試薬を用いることによって、個々の試
薬の調製と（例えば、ピペットによるが如き）混合での
技術者側の手順工程が省かれ、それによって技術者が出
す誤差の重要原因が排除される。

従来技術は、Ｔ３とＴ３抗体との間の反応が不可逆的で
あるという一般に認められた前提の下に操作されてきた
。

それ故、実際にＴ３放射免疫測定を行なうまでは、抗血
清を試験系の他の成分に添加し又は混合することはなか
った。

しかしながら、本発明に従って、抗血清を放射性Ｔ３及
び禁止剤を含有する緩衝溶液と組合せるならば、該組合
せ試薬に未知の血液試料を混合し且つこの混合物を例え
ば（そＬて好ましくは）３７℃でほぼ１時間温置すると
き、Ｔ３と抗血清中に含有される抗体との間で依然免疫
反応が進行することが期せずして見出された。

特に、これらの好ましい温置条件下如上の組合せ試薬が
該試薬の調製後約１０日までの期間本発明の放射免疫測
定方法に効果的に使用されうろことがわかった。

この期間を過ぎると、未知血清試料と組合せ試薬との混
合物を長期間（例えば３時間以上）温置することが必要
となる。

本発明の放射免疫測定方法の実施で使用すべく、必要な
試薬及び材料を含むパッケージ式試験キットが提供され
る。

既述の第一具体例を実施するのに好ましいパッケージ式
試験キットの必須成分には、放射性Ｔ３と禁止剤を含有
する緩衝溶液、抗血清を含有する緩衝溶液及びイオン交
換樹脂膜の複数個の比較的薄いストリップが包含される
。

既述の第二具体例を実施するのに好ましいパッケージ式
試験キットには、緩衝剤、放射性Ｔ３、禁止剤及び抗血
清を含む組合せ試薬並びに複数個のイオン交換樹脂膜ス
トリップが包含される。

また、いずれのキットもＴ３を種々の量で含有する複数
個のＴ３減少血清溶液を包含し得、且つまた８．６〜８
．８のｐＨを供するに適したバルビタール緩衝溶液を包
含しうる。

本発明のＴ４放射免疫測定方法に従えば、牛血清アルブ
ミンに結合したチロキシンのＮ−アセチル誘導体と１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロビル）カルボジ
イミドとの結合体よりなるインムノーゲンから産生され
る抗血清を用いることによって改良結果が得られるとわ
かった。

この抗血清を以てすれば、他のＴ４抗体より高い特異性
が得られ、加えて高いアビディティすなわち抗血清中の
抗体と抗原との強靭な結合がもたらされる。

また、このことによって、高い感度と再現性の高い試験
結果が得られる。

以下に説示する如く、本発明によって産生される新規な
抗血清及びインムノーゲンは、向上せる感度並びに再現
性の高い試験結果を実現可能なものとする。

例えば、本発明の抗血清を、チロキシンのＮ−アセチル
誘導体よりはむしろ遊離チロキシンを以て産生された抗
血清と比較研究した結果、前者は後者のおよそ五分の一
の標準偏差を与えることが示された。

而して、本発明の新規な抗血清を用いるとき、Ｔ４の回
収値の変動は低い。

本発明のＴ４放射免疫測定方法を実施するに当り、先ず
、チロキシン含量を定量しようとする血清試料が、放射
性チロキシンとチロキシンのチロキシン結合性グロプリ
ンに対する結合を抑制する禁止剤とを含有する緩衝溶液
から本質上なる試薬と混合される。

この禁止剤としては、Ｔ３試験方法に関連して先に示し
た禁止剤のいずれもが使用されうる。

次いで、上記混合物に、後述の如く牛血清アルブミンに
結合したチロキシンのＮ−アセチル誘導体と１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
との結合体を含む新規なインムノーゲンから産生される
本発明の前記新規な抗佃清が加えられる。

それによって得られる混合物は、抗体結合Ｔ４と未結合
Ｔ４との実質的平衡をもたらすに十分な時間或る温度で
温置される。

本発明のＴ４放射免疫測定におけるこの温置工程は、好
ましくは、３７℃の温度でおよそ３０分間行なわれる。

これより長い温置時間が用いられうるがしかしそれは有
利でない。

温置工程が終了した後、未結合のＴ４は抗体結合したＴ
４から分離される。

この分離は、Ｔ３放射免疫測定試験方法に係わって既述
した種々の手段のいずれによっても遂行されうるが、し
かしそれは、室温でほぼ３０分間にわたり、混合物をイ
オン交換樹脂より木質上なる膜の比較的薄いストリップ
と接触させることによって好ましく実施される。

この目的には、先に開示したイオン交換樹脂膜が有用で
ある。

温置工程の終了後、樹脂ストリップは鉗子によって試験
びん、及び標準びんから取出され、廃棄される。

而して、抗体結合放射性Ｔ４と未結合放射性Ｔ４の相対
量が決定される。

これは各びん中の放射性Ｔ４をガンマ線計数管で測定す
ることにより達成されうる。

Ｔ４の抑清濃度は、樹脂ストリップを取り出した後のび
ん内成分のカウント比によって示される。

抗体結合した放射性Ｔ４の係は次のようにして算出され
る。

結合したチロキシン 非放射性Ｔ４（患者又は標準）の増量に伴って、抗体結
合した放射性Ｔ４の係は減少する。

この原理に従って、一連のＴ４標準試料の各々と結合し
た放射性Ｔ４の係をその各Ｔ４濃度に対しプロットする
ことによって標準曲線が作製される。

（第２図は標準曲線の例示例である）。

而して、患者の全抑清チロキシンが、その抑清試料中の
結合放射性Ｔ４％を標準曲線と比較することにより容易
に決定される。

本発明のＴ４放射免疫試験方法を実施するためのパッケ
ージ式試験キットが提供される。

該キットには、放射性チロキシンとチロキシンのチロキ
シン結合性グロプリンに対する結合を抑制する禁止剤を
含有する緩衝溶液、新規なＴ４抗抑清を含有する緩衝溶
液及びイオン交換樹脂膜の複数個の比較的薄いストリッ
プが包含される。

本発明は更に下記の例によって例示される。

例１ 以下は、本発明のＴ３放射免疫測定試験方法の実施を例
示する。

ナトリウムバルビタール（ベロナール）緩衝剤１ｔビー
カ内の蒸留水（９００ｍ）にナトリウムバルビタール（
１０．３ｒ）を添加し、そしてこのナトリウムバルビタ
ールを穏和に温めながら機械的に攪拌して溶かすことに
より、８．６〜８．８のｐＨを有する０．０５Ｍペロナ
ール緩衝溶液を調製した。

ｐＨが８．７０吉０．０５に達するまで塩酸（２Ｎ）を
滴加した。

この溶液を１ｔメスフラスコに移し、保存剤としてナト
リウムアジド（１００７ｎｇ）を加えた。

エチレンジアミン四酢酸（０．３７２２ｙ）を加え、攪
拌しながら溶解した。

この溶液を最終容量１ｔに希釈し、４〜１０℃でシ貯蔵
した。

０．１％（ｗ／ｖ）の人匍清アルブミン（ＨＳＡ）ｔ−
含有する抗体希釈剤として使用すべく最終容量に調節す
る前に熱不活性ＨＳＡ溶液（４ゴ、２５％（ｗ／ｖ）；
５２℃±２℃、３０分間）を添加した。

８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸マグネシウム
の製造 攪拌棒を備えた８００ｍＪビーカに蒸留水（６０〇一）
を入れ、これに高純度の８−アニリノー１一ナフタリン
スルホン酸（３０ｇ，ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ社製）
を添加した。

この混合物を加熱攪拌しながら水酸化ナトリウム（５Ｎ
）を滴加した。

水酸化ナトリウムを約１６ｍｌ加え且つ温度がほぼ７５
〜８５℃になったときから可溶化が起った。

この熱い溶液を粗い焼結ガラスにより重力涙過し、Ｐ液
を広口のビーカに集め、１０℃に冷却した。

このＰ液に塩化マグネシウム飽和水溶液（２０ｍＡ）を
攪拌下で加えて８−アニリノー１−ナフタリンスルホン
酸マグネシウムを沈澱させた。

８〜１０℃で１０〜１５分放置しｉｉ、沈澱を粗い焼結
ガラスにより吸引枦過し、次いで氷冷水（３００ｍｌ）
で洗浄した。

この沈澱を加熱（７５℃）攪拌しながら水（３００ｍｌ
）に溶かした。

溶解したら、この溶液を水浴に入れて３０〜４５分間放
置した。

結晶を粗い焼結ガラスにより吸引沢過し、次いで氷冷水
（３００ｍｌ）で洗浄した。

その結晶を加熱（７５℃）攪拌しながら水（３００ｍｌ
）に再び溶解し、上記の如く急冷することによって再晶
出させた。

再度この物質を粗い焼結ガラスにより吸引沢過し、しか
る後氷冷水（３００ｍｌ）で洗浄した０８−アニリノー
１−ナフタリンスルホン酸マグネシウムをデシケータ中
暗所で恒量になるまで乾燥し、褐色の容器に貯蔵した。

収量および収率は２７．５ｇ，９１．６％であった。

放射免疫測定方法に使用する８−アニリノー１−ナフタ
リンスルホン酸マグネシウムの効力及び最適量は次のよ
うに決定された。

１ ８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸マグネシ
ウムを０．０５Ｍベロナール緩衝剤（ｐＨ−８．６ 〜
８．８）に浴かしてなる（３ｍ９／ｍｌ含有）溶液を調
裂した。

８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸マグネシウム
を溶かすには激しい攪拌が必要である。

この８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸マグネシ
ウム溶液を一連のびんに夫々０．０５ｍｌ，０．１０ｍ
ｌ，０．１５ｍｌ、０．２０ｍｌ及び０．３０ｍｌ人れ
た。

６個目のびんにベロナール緩衝剤溶液を入れた。

かかる各びんに正常な人の抑清（１００μｔ）を添加し
た。

更に各びんに、よう素−１２５を含有する放射性Ｌ−｝
リョードチロニン（ｌ２’Ｉ−Ｔ３；比放射能３５０〜
６００ｍＣｉ／ｍｇのもの４０〜６０ｐｇ）をベロナー
ル緩衝剤に溶かしてなる溶液を添加した。

ガンマ線シンチレーションウエル計数管を使って各びん
の初期カウントを決定した０ ２ 全てのびんを３７℃で１時間温置した（静止状態で
）。

３ 全てのびんにベロナール緩衝剤溶液（１．０ｍｌ）
を添加した。

４ 各びんにイオン交換樹脂（Ｉｏｎｉｃｓ社より商品
名「ＡＲ−１１１Ｊとして市販されている陰イオン選択
性樹脂）のストリップを入れて栓をした。

５ 各びんを室温（１５〜３２℃）で１時間回転した。

６ びんからストリップを注意深く取出し、廃棄した。

７ 各びんのカウントを測定した。

一次方眼紙に、結合した を８−アニリノー １−ナフタリンスルホン酸マグネシウムの添加量（μＶ
）に対しプロットする。

得られた曲線：は、２４０〜３００μｆＡＮｓ禁止剤で
最犬の効果（結合放射性Ｔ３の最小係）を示すはずであ
るＯ 抑制率係は次のように計算される。

抑制率の許容限界は５０％又はそれ以上である。

高比放射能１２５ＩＴ３の調製 ＮａＩ１２５（１２ｍＣｉ）を入れた反応びんに１：９
のＨ２ＳＯ４−Ｈ２０混合物ｉ滴と飽和Ｎａ２ＨＰＯ４
１滴を加えた。

１：１のＮＨ４０Ｈ−メタノール混合物に遊離酸として
の非放射性Ｔ３（所定純度のもの２０μｌ）を０．５ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で溶かした。

混合後、ｐＨハイドリオン試験紙を用いてｐＨを調べた
。

ｐＨは７．５〜８．５でなければならない。ｐＨ調節が
必要ならば、ＮａＯＨ又はＨ２ＳＯ４（１：９）が用い
られる。

混合しながら、飽和■２（４μｔ）を反応びんに添加し
た。

反応を２５秒間続けた。

亜硫酸ナトリウム溶液（１００■／一を含有）６滴を加
えた。

この混合物（１０μｔ）を亜硫酸ナトリウム（１５０ｍ
ｇ）一ぎ酸（２２７ｍｌ）−Ｈ２０（７７３ｍｌ）の溶
媒系を用いてペーパークロマトグラフイーした。

１２５Ｉ−Ｔ３を他の反応成分から薄層クロマトグラフ
イーによって分離した。

強度の許容限界一一３５０〜６００ｍＣｉ／ｍｇ上記の
如く調製した１２５Ｉ−Ｔ３のハプテン特異性を次のよ
うに試験した。

標定したＴ３抗抑清をベロナール緩衝剤中で１：５及び
１：１０に希釈した。

３個のびんに未希釈の抗抽清ｏ．１ｍｌと各緩衝剤希釈
物０．１ｍｌを添加した（二重反復試験）。

１２５Ｉ−Ｔ３をベロナール緩衝剤中で４００〜６００
ｐｇ／ｍｌに希釈し、０．１ｍｌを各びんに添加した。

この容量をベロナール緩衝剤で１．２ｍｌにした。

各びんの初期カウントを測定した。びんを３７℃で１時
間静かに温置した。

各びんにベロナール緩衝剤（１ｍｌ）とイオン交換樹脂
のストリップを添加した。

びんを室温（１５〜３２℃）で１時間回転させ、ストリ
ップを注意深く取出した。

びんの内容物をカウントし、そして結合１２５Ｉ一Ｔ３
の％を決定した。

特異性は、両希釈物が５０係以上の結合を示すとき本発
明の放射免疫測定方法に適するが、しかし未希釈Ｔ３抗
抑清の結合性は８５〜１００チであることが好ましい。

Ｔ３減少抑清の調製 Ｔ３は、下記の手順に従って正常な人廂清から抽出され
た。

１ 水中懸濁によって、イオン交換樹脂（８０ｇ、Ｒｏ
ｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ社より市販されている「Ａｍｂ
ｅｒ ｌｉｔｅ ＣＧ−４００」）から微粉を取除く。

２ 次いで、この樹脂を０．０５Ｍバルビタール緩衝剤
（ｐＨ８．６）を用いて平衝化する。

３ 緩衝剤中の樹脂スラリーを調製し、これを巾２７Ｃ
ｍ×高さ３５ｃｍの層をなすクロマトグラフカラムに注
ぎ入れる。

４ ４０，０００〜６０，０００ｃｐｍ／ｍｌを生ずる
のに十分な量の高比放射能１２５■−Ｔ３を抑清に添加
する。

５ この抑清にナトリウムアジドを０．１％濃度まで溶
解する。

６ この佃清をカラムに通し、両分を集める。

７ 画分の一定量をカウントして抽出効率を定める。

これは９７．５．％以上となるはずである。上記の如く
調製したＴ３減少抑清は、次いで、抽出後のチロキシン
結合性グロプリン（ＴＢＧ）含量を評価するために結合
力について下記のように試験される。

ベロナール緩衝剤（１．ｏｍｌ）を３個のびんの各各に
添加する（二重反復試験）。

また、各びんに１００μｔの１２５Ｉ−Ｔ３（５０ｐｇ
）を添加する。

そして第一のびんにはＴ３減少穐清（１００μｔ）を添
加し、第二のびんにはユーチロイド （ｅｕｔｈｙｒｏｉｄ）抑制抑清（１００μｔ）をまた
第三のびんにはハイパーチロイド （ｈｙｐｅｒｔｈｙｒｏｉｄ）抑制佃清（１００μｔ）
を添加する。

びんを１分間回転させて混合し、全てのびんを初期カウ
ントする。

各びんを３７℃で１時間（水浴、静止状態）温置する。

ベロナール緩衝剤（１ｍｌ）を添加する。

イオン交換樹脂のストリップを各びんに入れ、そしてこ
れらのびんを室温で１時間回転させる。

ストリップを注意深く取出し、びんの内容物をカウント
する。

各びんの結合Ｔ３＊％は、次のように算出される。

下記順序で高いカウント比が観察されるはずである。

ハイパーチロイド〈ユーチロイド＜Ｔ３減少抽清 ユーチロイド抑制佃清からＴ３減少力清への増分（△）
は８％以上となるはずである。

Ｔ３減少抽清は、Ｔ３標準試料が調製される（好ましく
は同じ日に調製）まで４℃に貯蔵されるＯ Ｔ３標準試料の調製 遊離酸形のＴ３が出発物質である。

このＴ３のメタノール性ＮＨ４０Ｈ溶液をクロマトグラ
フイーしてＴ４の不在を量定する。

標準溶液は次のように調製される。

１ デシケータ（−２０〜３０℃）内に貯蔵しておいた
Ｔ３を正確に１０■秤量してこれを１００一メスフラス
コに移す。

２ メタノールと濃ＮＨ４０Ｈ（９９：１）の混合物を
調製し、ほぼ１００ｍｌ上記メスフラスコに添加する。

３ Ｔ３が完全に溶解するまでこの混合物を攪拌し、而
して１００ｍｌなるように上記メタノールー水酸化アン
モニウム溶液を８Ｃ添加する。

濃度は１００μ２／ｍｌである。

４ １００μｆ／ｍｌのＴ３ １容をベロナール緩衝剤
（０．０５Ｍ，ｐＨ８．６〜８．８）９９容で希釈する
。

濃度は１μｒＴ３／ｍｌである。この１μｆ／ｍｌ溶液
を使ってＴ３を０．０．５，１．０．２０及び６．０ｎ
ｇ／ｍｌ含有するＴ３標準試料２５ｍｌを調製する。

４個の２５ｍｌメスフラスコに前述の如く調製したＴ３
減少匍清約１５ｍｌを添加する。

また、これらのフラスコに、Ｔ３を１０００ｎｆ／ｍｌ
含有するＴ３溶液を夫々１２．５μｔ１２５μｔ１５０
μｔ及び１５０μｔ加え、且つ２５ｍｌにするに十分量
のＴ３減少抑清を添加した。

Ｔ３抗抽清の調製と力価の評価 前掲文献に記載の如く完全なフロイド・アジュバンド中
で乳化させたＴ３−メチルエステル塩酸塩十ＢＳＡイン
ムノーゲンを使って兎又は山羊を過度免疫法に付すこと
により、Ｔ３抗抑清を産生じた。

この抗抽清の力価は次のように評価される。抗匍清を凍
結乾燥形態で貯蔵する。

このＴ３抗抑清（０．２ｃｃ）を既述の如く調製した０
．１％ＨＳＡ含有ベロナール緩衝剤（５ｍｌ）の添加に
より再組成する。

この５ｍｌは抗抑清の１：２５希釈物である。

１：２５希釈物１．２５ｍｌを０．１チＨＳＡ緩衝剤３
．７５ｍｌに添加して１：１００希釈物とする。

６個のびん（二重反復試験）にペロナール緩衝剤０．８
ｍｌを添加し、次いで（ａ）８−アニリノー１−ナフタ
リンスルホン酸マグネシウム溶液１００μｔ、（ｂ）Ｔ
３減少抽清１００μｔ及び（ｃ）１２５Ｉ−Ｔ３溶液（
４００〜６００ｐｒ／ｍｌ）１００μｔの順で連続添加
する。

１：１００希釈物から始まる一連のＴ３抗抑清５倍希釈
物は次のように調製される。

５個の試験管（５ｍＪ容量）にベロナール緩衝剤（０．
１％ＨＳＡを含有）０．８ｍｌを添加し、試験管に番号
を付す。

１：１００希釈物０．２ｍｌを第一の試験管に添加し（
希釈度１二５００）、この１：５００希釈物０．２ｍｌ
を第二の試験管に移して混合する（希釈度１：２５００
）。

この一連の５倍希釈法を続行して１：１２，５００、１
二６２，５００及び１：３１２，５００とする。

而して、試験管は、下記の如き種々の抗抑清希釈物０．
８ｍＡを含有する（ただし、最後の試験管は１．０ｍｌ
を含有する）。

１：１００希釈物１００μｔを第一のｒ倍びんに添加し
、そして上記の各希釈物１００μｔを残る５ｒ倍びんに
添加する。

びんの内容物を１分間混合し、ガンマ線計数管で初期カ
ウントを測る。

全てのびんを３７℃（水浴）で１時間温置する。

各びんにベロナール緩衝剤（１．０ｍｌ、ＨＳＡなし）
を添加する。

また、各びんにイオン交換樹脂ストリップを添加し、そ
してびんを室温（１５〜３２℃）で１時間回転させる。

樹脂ストリップを注意深く取出し、びん内容物の１２５
ＯＩ−Ｔ３をカウントする。

各希釈物の結合Ｔ３＊％は次のように算出される。

一次方眼紙に抗抑清希釈度に対する結合Ｔ３％のグラフ
を作成する。

検定に使用すべく７５％の結合性を与える希釈度が選択
される。

５０％の結合性終点が種々の抗抽清を比較するのに有用
である。

キット成分及びキットの調製 Ａ 反応びん ベロナール緩衝剤８部に８−アニリノー１−ナフタリン
スルホン酸マグネシウム（３ｍｇ／ｍｌ）１部と１２５
Ｉ−Ｔ３溶液（４００〜６０ｏｐｇ／ｍｌ）１部を添加
する。

１分間機械的に混合し、自動ピペット又は小出装置に移
す。

既述の如く調製した組合せ試薬１ｍｌを各反応びんに移
し、これらのびんを−２０℃（又はそれ以下）で貯蔵す
る。

Ｂ 既述の如く調製したＴ３減少抑清−Ｔ３標準試料。

Ｃ ４０〜６０ｐｖ量のｌ２５Ｉ−Ｔ３７５ ％と結合
する抗体希釈物を含有するように既述の如く希釈したＴ
３抗佃清。

Ｄ 既述の如く調製したべロナール緩衝剤。

Ｅ イオン交換樹脂ストリップ。

典型的なパッケージ式試験キットは下記の構成要素を含
む。

１ 夫々、組合せ試薬を１ｍｌ人れた１００個の反応び
ん。

２ Ｔ３減少抽清中で希釈したＴ３標準試料（０，０．
５，１．０，２．０及び６．Ｏｎｔ／ｍｌのＴ３標準試
料）を夫々１．５ｍｌ入れたびん。

３ 予め希釈しておいたＴ３抗匍清を夫々２．５ｍ／入
れた５個のびん。

４ ベロナール緩衝剤（０．０５Ｍ，ｐＨ８．６〜８．
８）１１０ｍｌの入った容器１個。

５ 夫々、塩水中のイオン交換樹脂ストリップを５０個
入れた２個の容器。

構成要素１，２及び３は冷凍状態で貯蔵且つ輸送される
。

要素４は３〜５℃で貯蔵又は冷凍されうる。

要素５は冷凍されず、室温で貯蔵されうる。Ｔ３放射免
疫測定試験方法。

本発明のＴ３放射免疫測定方法を実施するのに下記手順
が用いられる。

１ 所要数の反応びんを冷凍機から取出し、解凍中又は
解凍後の各びんについて１分当りの正味初期カウントを
決定する。

解凍された反応びんを静かに攪拌する。

好ましくは試験は二重反復して行なう。

２ ０，０．５，１．０，２．０及び６．Ｏｎｇ／ｍｌ
Ｔ３標準試料各々１００μｔを反応びんに添加し、また
他の反応びんに夫々患者の抑清１００μｔを添加する。

３ 各反応びんにＴ３抗抑清１００μｔを添加して栓を
する。

４ 回転機上で１分間１２〜１４ｒｐｍで回転させ又は
びん台を静かに揺り動かすことにより、びんの内容物を
混合する。

５ 反応びんを３７℃の水浴中で１時間±５分間温置す
る。

この際、びんは、その中の液面が水浴の液面と等しいか
又はこれを超えるような深さで水浴中に温置されるべき
である。

６ 各びんにベロナール緩衝剤（１．０ｍｌ）を添加す
る。

７ イオン交換樹脂ス｝リツプ１個を各反応びんに入れ
、栓をする。

８ 転倒式混合を生ずる回転機上で上記反応びんを１２
〜１４ｒｐｍ．周囲温度（１５〜３２℃）１時間回転応
せる。

９ 樹脂ス｝リツプを注意深く取出し、廃棄する。

このとき、樹脂ストリップは、栓をする前にストリップ
をびんの頂部に軽く触れさせてびん上で排液させるべき
である。

１０ 各びんの１分当りの正味後カウントを測定する０ １１結合Ｔ３Ｉ−１２５（％）は、正味ＣＰＭ後カウン
トを正味ＣＰＭ初期カウントで除し、１００倍すること
によって算出される。

１２ｎｇ％Ｔ３としての標準試料濃度に対する結合Ｔ３
Ｉ−１２５（％）を片対数グラフ用紙の等間隔軸（縦軸
）にプロットする。

１３ このようにして得られた標準曲線を基に、結合Ｔ
３Ｉ−１２５％より患者の抑清中の全循環Ｔ３濃度を読
み取ることができる。

第１図に示した標準曲線は、下記の数字をプロットする
ことにより作製された。

上記の放射免疫測定方法を用いることによって一ユーチ
ロイド範囲は７２〜２１４ｎｒ％Ｔ３＊、平均１２６±
２９であり、ハイパーチロイド患者の平均値は４８０±
１２７ｎ？％、そしてハイポチロイド患者の平均値は６
７±４６ｎｒ％であるとわかった。

この標準範囲を用いたとき、抑清Ｔ３は臨床的にハイパ
ーチロイドの患者の９８％で高く、臨床的にハイポチロ
イドの患者の５６％で標準範囲より下回わることがわか
った。

下記データは、前記の放射免疫測定方法を使って得られ
たもので、ユーチロイド抑制抑清及びハイバーチロイド
抑制抽清について４つの異なった各日に各測定で６回反
復した結果の平均値及び標準偏差を表わす。

例２ 以下は、本発明のＴ４放射免疫測定試験方法の実施を例
示する。

ナトリウムバルビタール（ベロナール）緩衝剤１ｔビー
カ内の蒸留水（９００ｍｌ）にナトリウムバルビタール
（脱水形）を加えることによって、８．６〜８．８のｐ
Ｈを有する０．０７５Ｍベロナール緩衝溶液を調製した
。

ナトリウムバルビタールの量は１５．４５ｇ／ｔであっ
た。

攪拌下ナトリウムバルビタールを溶かした後、保存剤と
してナトリウムアジド（１ｏＯ■）を加え、またエチレ
ンジアミン四酢酸（１．８６ｒ）を加えた。

かき混ぜて溶解した後、酸又は塩基を加えることによっ
てｐＨを８．６〜８．８に調整し、この溶液を最終容量
１ｔに希釈し、４℃で貯蔵した。

０．１％（ｗ／ｖ）の人匍清アルプミン（ＨＳＡ）を含
有する抗体希釈剤として使用すべく、最終容量に調整す
る前、熱不活性ＨＳＡ溶液〔４−、２５係（ｗ／ｖ）；
５２℃±２℃、６０分間〕を添加した０ ８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸マグネシウム
の製造 ５００ｍｌビーカに入れた蒸留水（２００ｍ／）に高純
度の８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸（Ｅａｓ
ｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．）（１０ｇ）を添加した
。

この混合物をホットプレート上で機械的にかき混ぜなが
ら、水酸化ナトリウム（５Ｎ）をビュレットから滴加し
た。

この水酸化ナトリウム溶液を約５．５一加え且つ温度が
７５℃〜８５℃になったときから可溶化が起った。

この熱い溶液を粗い焼結ガラスに通して重力涙過し、涙
液をビーカに集め、１０℃〜２０℃に冷却した。

この涙液に塩化マグネシウムの飽和水溶液を攪拌下で加
えて最大限の沈殿（一般には６〜７ｍｌ）が生ずるよう
にした。

沈殿物を粗い焼結ガラスにより吸引涙過し、残留物を氷
冷水で洗った。

粗製８−アニリ／−１−ナフタリンスルホン酸マグネシ
ウムヲ蒸留水（１５０ｍｌ）に加熱（７５〜８５℃）溶
解し、急冷によって再晶出せしめた。

実質上完全な結晶化を生ぜしめるに要した時間はおよそ
３０〜４５分であった。

次いでこのものを吸引枦過し、残留物を氷冷水で洗った
。

もう一度晶出する必要があった。

緑色〜黄色の８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸
マグネシウムを時計皿の上で恒量になるまで空気乾燥し
、次いでデシケータ（こはく色の容器）内−２０℃〜−
３０℃で貯蔵したＯ Ｔ４放射免疫測定試験方法に用いようとする８−アニリ
ノーｌ−ナフタリンスルホン酸マグネシウムの効力およ
び最適量は次のようにして決定された。

１ ８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸マグネシ
ウムをｏ．０７５Ｍベロナール緩衝剤（ｐＨ８．６〜８
．８）に溶かしてなる（６ｍｇ／ｍｌ含有）溶液を調製
した。

８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸マグネシウム
を溶かすには激しい攪拌が必要である。

この８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸マグネシ
ウム溶液ヲ５個のびんに夫々０．０５ｍｌ、０．１０ｍ
、０．１５ｍｌ、０．２０−および０．３０ｍｌ入れた
。

６個目のびんに、ベロナール緩衝溶液を０．３ｍｌ入れ
た。

各びんに、予めイオン交換樹脂で抽出しておいた正常な
人柚清（１０μｔ）を添加した。

更に各びんに、ベロナール緩衝溶液中のよう素一１２５
含有放射性チロキシン（１２５Ｉ−Ｔ４：３５０〜７０
０ｍＣｉ／ｍｌｇのもの１００ｐｆ±２０ｐｆ）を添加
した。

各びんの容量をベロナール緩衝液で１．２にした。

各びんの初期カウントを、ガンマ線シンチレーヨンウエ
ル計数管を使って測定した。

２ 全てのびんを３７℃で１時間（静止状態で）温置し
た。

３ 各びんにイオン交換樹脂（Ｉｏｎｉｃｓ社より市販
されている第四アンモニウム型）のストリップを添加し
、元通り栓をした。

４ びんを室温（１５℃〜３２℃）で３０分回転させた
。

５ びんからストリップを注意深く取出し、廃棄した。

６ 各びんのカウント比を決定した。

７ ８−７＝リ／−１−ナフタリンスルホン酸マグネ
シウムの添加量（μグ）に対し を一次方眼紙に プロットする。

得られた曲線は５００〜６００μｒＡＮｓ禁止剤で最犬
の効果（結合放射性Ｔ４の最小係）を示すはずである。

８ 抑制率（％）は次のようにして算出される。

抑制率の許容限界は８０係又はそれ以上である。

高比放射能１２５Ｉ−Ｔ４の調製 下記溶液を調製した。

Ａ ＩＮ水酸化ナトリウム（４０μｔ）の添加によりＴ
４遊離酸（４ｍｇ）を０．０５Ｍりん酸ナトリウム緩衝
液（１．０ｍｌ）に溶かし、次いでｔ−ブチルアルコー
ル（９．０ｍｌ）で希釈した。

Ｂ クロラミンＴ（２．６ｍｇ）を０．０５Ｍりん酸ナ
トリウム緩衝液（ｉ．ｏｍｌ）に溶かした。

Ｃ メタ重亜硫酸ナトリウム（５．０ｍｇ）をりん酸ナ
トリウム緩衝液（１．０ｍｌ）に溶かした。

Ｄ ぎ酸（２．３ｍｌ）をＳＰＦ水（７７ｍｌ）に加え
たＯ Ｅ 水酸化アンモニウム（０．５ｍ／）をメタノール（
５０ｍＡ）に加えた。

手順： １ 溶液Ｄｋ適当なクロマトグラフィー・チャンバーに
入れ、使用前少なくとも１時間平衡化した０ ２４ｃｃびんに次のものを入れた。

ａ Ｔ４ ２５μｔ（溶液Ａ１０μｆ） ｂ Ｉ−１２５よう化ナトリウム ５ｍＣｉＣ りん酸
ナトリウム緩衝剤２５μｔ ｄ クロラミンＴ１５μｔ（溶液Ｂ ３９μ２）ｅ ６
０秒間反応 ｆ メタ重亜硫酸ナトリウム２０μｔ（溶液Ｃ１００μ
ｇ） ３ 放射クロマトグラムに十分なだけ、ｆｉｎワットマ
ン紙クロマトグラフイーストリップにスポットした。

４ Ｔ４反応混合物の残留物を別のｌｉｎワットマン紙
クロマトグラフイーストリップにスポット した。

５ 両ストリップを溶液Ｄで２５〜３０ｃｍの高さまで
展開させた。

６ 工程４におけるストリップ上のＴ４バンドを位置付
け、而してそのＴ４を８〜１２ｍｌの溶液：Ｅで抽出し
た。

これに、飽和亜硫酸ナトリウム（ｌ５０μｔ）を添加し
た。

７ 工程３のス｝リツプを走査して比放射能を測定した
。

８ 工程６のＴ４溶液を、空気流れを用いて蒸発シ乾固
させた。

９ 乾燥したＴ４をＴ３／Ｔ４希釈剤（ＳＲＳ７８）６
０−で溶解した。

Ｔ４減少抑清の調製 Ｔ４ｍ清は、下記の手順に従って正常な人抑清３から抽
出された。

１ アニオン交換樹脂（処理される人抽清５ｒＩｌｌ毎
に１μｇ；Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ社より市販され
ているｒＡｍｂｅｒｌｉｔｅｃＧ−４００Ｊ、１００〜
２００メッシュ、第四アンモニウム型、３、３ｍｅｑ／
ｇ）をＯ．１５Ｍ塩水で洗って微粉を取除く。

次いでこれを粗い焼結ガラスに通して涙過する。

２ 匍清を８μミリポア・フィルター（ＭＦ）で瀝過し
て粒状物質を除き、次いで初期カウントごとして約５０
〜１００，ＯＯＯＣＰＭ／ｍｌを生ずるのに十分なトレ
ーサ量のｌ２５Ｉ−Ｔ４を添加したｏ ３ ガラス容器に入れた穐清に、生成混合物の高さが最
小限になるように含水樹脂を加えた。

こくの容器に攪拌棒を設置し、その内容物を４℃で１６
〜２０時間ゆっくりと混合した。

攪拌棒の速度は、単に内容物の沈降を防止するだけのも
のとすべきである。

攪拌棒は、容器直径のできるだけ多くにまたがるよう選
定される。

４ 上記混合物を１０．００Ｏｒｐｍ（ローター≠５５
３４、ＳｏｒｖａｌＬ．半径５．２５ｉｎ）で１時間４
℃±２℃で遠心分離した。

上澄み液をＭＦ（８μ細孔径）に注意深くデカンテーシ
ョンし、ｐ液を４℃で集めた。

３μＭＦ１次いで０．２２μＭＦを使つ１戸過操作を反
復した。

最後の枦液１−のカウントを測った。

およその収率−７０係又はそれ以上。

抽出効率Ｏ許容限界＝９２係又はそれ以上： 抽出されたＴ４（係）＝１００−Ａ 次いで、上の如く産生されたＴ４減少穐清の結合能力を
以下の如く調べた。

１ ２個のびんの各々にベロナール緩衝液（１．０９ｍ
ｌ）を入れる。

（二重反復）。２ 各びんに１００μｔの１２５Ｉ−Ｔ
４（１００ｐｒ±２０９ｆ）を添加する。

３ 一方のびんには出発佃清（１０μｔ）を加え別のび
んには抽出又は減少せる抑清（１０μｔを加える。

各びんの内容物を回転によって混合した後、カウントを
測定する。

４ びんを３７℃で３０分（水浴、静止状態で）温置す
る。

５ 各びんに樹脂ストリップを入れ、室温（１５℃〜３
２℃）で３０分回転させる。

６ ス｝リツプを注意深く取り除いた後、各びんのカウ
ントを測定する。

７ 各びんの結合Ｔ４１算出する。

減少抑清のカウントは出発物質のそれより△６チまで高
いか又はそれ以上の差があるはずである。

而して、如上の仕様を満たすＴ４減少抑清を、ナトリウ
ムアジド濃度が０．６％になるように調製し、そしてこ
れを標準物が調製されるまで４℃で貯蔵するＯ Ｔ４標準試料の調製 出発物質は遊離酸チロキシンである。

Ｔ４のメタノール性水酸化アンモニウム溶液をクロマト
グラフイーしてＴ３による汚染を見積り、而して目立つ
程のＴ３含量を示すロットははねる。

１ 減圧下−２０℃で貯蔵しておいたＴ４を正確に１０
■秤量し、これをメタノールとＮＨ４０Ｈ（９９：１）
の混合物で１００μｆ／ｍｌにする（溶液１） ２ 予め３７℃に温めておいたベロナール緩衝液（９９
ｍｌ）を溶液１（１．Ｏｍｌ）に加える（溶液２−１μ
１／ｍｌ）。

３ Ｔ４減少抑清で十分にゆすいでおいた５０ｍｌメス
フラスコに、下記表に示した容量の溶液２を入れて下記
表に記載の濃度にする。

４ Ｔ４減少柚清を加えて５０ｍｌとじ、これを４００
で貯蔵する。

Ｔ４インムノーゲンとＴ４抗匍清の産生 結晶性牛匍清アルプミン（ＢＳＡ）（１５０ｍｇ）を秤
量し、２〜８℃の蒸留水（７．５ｍ／）に溶かした。

Ｔ４のＮ−アセチル誘導体（Ｆａｘ Ｃｈｅｍｉｃａ１
社）（１００■）を秤量し、３７℃に加温しなからジメ
チルホルムアミド（３４ｍｌ）に溶かした。

溶けたなら、２．７〜４．５μＣｉの１２５Ｉ−Ｔ４を
加え混合した。

ｌ一エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド（ＥＣＤＩ）（１００ｍｇ）ｋ秤量し、蒸留
水（２ｍｌ）に室温で溶かした。

電磁攪拌棒を備えた容器にＢＳＡ溶液とＥＣＤＩ溶液を
入れ、静かにかき混ぜる。

０．０５Ｎ−ＨＣｔと０．０５Ｎ−ＮａＯＨでｐＨを５
．８に調整する。

１時間後、追量のＥＣＤＩ（５０ｍｇ）を固体形状で加
える。

Ｔ４の滴加後、上昇傾向にあるρＨを５．８に保つ。

２時間後、反応容器をアルミニウム箔で包み、２〜８℃
で１８〜２４時間かき混ぜる。

反応混合物（１ｍｌ）のカウントを測定する。

七七際、該容量はＯ．ｌｍｌの値まで出す。

この反応混合物をセロファン透析膜に入れて３日間蒸留
水に対し透析し、その間水を頻繁に取替える。

透析水対反応混合物の比は少くとも１５：１とすべきで
ある。

濁った液を透析袋から取出し、ｌｍｌのカウントを測定
する。

このときの容量は０．１ｍｌの桁まで出す。

結合したＴ４のｍｇ数は次のようにして算出される。

モル比は少くとも１０：１となるはずである。

かくして産生されたインムノーゲン調製物を５μ又はそ
れ以下で４８時間凍結乾燥する。

このようにするために、ＢＳＡを９ｍｇずつ分取する。

免疫賦与のため、凍結乾燥した調製物を蒸留水（３づ）
に懸濁させ、この不溶懸濁物を高速度均質化（Ｖｉｒｔ
ｉｓホモジナイザー、全速力）により微細にする。

完全なフロイド・アジュバンド（抗原補強体）（３ｍｌ
）を加え、この混合物を高速度均質化により乳化する。

前免疫法ブリード（ｂｘｅｅａ）後、動物に（山羊、羊
の場合）全投与量約３■で胸部２箇所に皮下注射し、ま
た（ラビットの場合）全投与量約３■で中間股筋、肩甲
骨下筋および胸部の４箇所に皮下又は筋肉内注射する。

この免疫賦与を２〜３周間のまをおいて反復し、定期的
に匍清試料を滴定によって試験する。

抗体力価がｉｏｏｏｏ又はそれ以上であるとき、動物か
ら大容量採抑して抗抑清を得る。

抗匍清は０．２ｃｃ量および１．Ｏｃｃ量ずつ貯蔵し凍
結乾燥する。

例えば、０． ２ｃｃ量を用いるとき、Ｔ４抗匍清は、
冷い蒸留水（０．２ｏｃ）を加えることによって再組成
される。

ベロナール−０．１チＨＳＡ緩衝溶液で希釈物を調製し
て予想沌る力価にブラケットを付す、希釈物は標識Ｔ４
及び８−アニリノー１−ナフタリンスルホン酸マグネシ
ウムを含有するマトリックス並びにＴ４減少抽清の存在
でのＴ４％の抗抽清結合性５０％の希釈物である。

マトリックスよりはむしろ個々の成分を書き入れた試料
プロトコール（実験記録）を下に示す。

各びんを１分間回転させた後、初期カウントを測定する
。

びんを水浴中３７℃で３０分温置する各びんに樹脂スト
リップを入れ、室温で３０分回転させる。

ストリップを取出して、びんの後カウントを測定する。

結合１２５Ｉ−Ｔ４％は次のようにして求められる。

結合Ｔ４”％の値を希釈度に対し縦軸にプロットし、而
してこのグラフから、標識物５０係が結合する希釈度（
５０％終点）が見出される。

キット成分及びキットの調製 Ａ 反応びん：ベロナール緩衝液８容に、１２５Ｉ−Ｔ
４のベロナール緩衝溶液（１００Ｐｆ±２０Ｐｆ／０．
１ｍ／）１容とＭｆＡＮＳのべロナール緩衝溶液（６■
／ｍｌ）１容を加える。

十分に混合したｌｍｌずつ分取する。

これらのびんを４℃に貯蔵する。

Ｂ Ｔ４抗力清：親液性ストッパー付き５ｍｌ血清びん
を用いる。

滴定グラフから、Ｔ４”の６５〜８０％結合性をもたら
す希釈度を読み取る。

もしこの力価が例えば１：１２００であれば、１：６０
０の希釈物が培強度ベロナール緩衝後（０．１５０Ｍ）
で調製される。

２７５ｍｌを匍清びんに入れ、親液性ストッパーを正し
くセットした凍結乾燥に付す。

使用の場合、凍結乾燥した抗体を蒸留水５．５ｍｌで再
組成する。

凍結乾、燥した抗体は４℃で貯蔵する。

Ｃ Ｔ４減少抑清一Ｔ４標準試料を既述の如く調製する
。

Ｄ イオン交換樹脂ストリップを０．９％塩水に浸漬し
て貯蔵する（びん１個につきストリップ ５０）。

典型的なパッケージ式試験キットは下記の構成要素を含
む。

１ ０．１ミリキュリーより少い（検定の日に）チロキ
シンＩ−１２５，６００μ？の８−アニリノー１−ナフ
タリンスルホン酸マグネシウム及び０．０７５モルのべ
ロナール緩衝液を入れた１一反応びん１２５個。

２ Ｔ４不含人柚清にＴ４を各々１，０、２．ｏ，５．
０、ｌＯ．０、２０．０及び４０．０μｇ含有させてな
るＴ４標準試料を夫々０．５ｍｌ入れたびん。

３ 凍結乾燥したＴ４抗抑清（１：１００より高い希釈
度の兎、羊又は山羊チロキシン抗体）。

各びんに、０．０７５Ｍのべロナール緩衝液と１．０係
の人力清アルブミンを入れる。

再組成物の容量は５．５−である。

４ イオン交換樹脂ストリップ Ｔ４放射免疫測定試験方法 本発明のＴ４放射免疫測定方法を実施するのに下記手順
が用いられる。

１ 凍結乾燥した抗匍清を蒸留水５．５ｍｌで再組成す
る。

所要の試験要素を冷凍機から取出し、室温（１５℃〜３
２℃）に平衡化せしめる。

これらの反応びんを穏和に渦運動させることによって混
合する。

試験は好まし〈は二重反復で行う。２ 工程１の温度平
衡化の過程で累積カウントが最小限１０，ＯＯＯＫなる
に十分な期間いくつかの反応びんの初期カウントを測定
する。

正味ＣＰＭ初期カウントを決定し記録する。

３ 各１．０、２．０、５．０、１０．０、２０．０及
び４０．０μ１％の標準試料１０μｔを一連の反応びん
に入れ、また他の反応びんに夫々１０μｔミクロピペッ
トを使って患者の血清１０μｔを入れる。

４ 各反応びんに抗穐清１００μｔを入れ、栓をする。

これは、半自動μｔピペット又は反復μｔ注射器によっ
て達成される。

５ これらのびんを３７℃の水浴中で（反応びん内の液
面に等しいか又はこれをわずかに越える深さにまで浴を
満たして）最小限３０分から４０分を越えない時間温置
する。

反応時間は全ての反応びんで同じでなければならない。

６ 水浴から反応びんを取出す。

各反応びんに樹脂ストリップ１個を入れて栓をする。

７ 反応びんを、転倒式混合を生ずる回転機上１２〜１
４ｒｐｍで最小限３０分から４０分を越えない時間室温
（１５〜３２℃）で回転させるこの分離時間は全ての反
応びんで同じでなければならない。

８ 直ちに樹脂ストリップを取出し、廃棄する。

取出す際、樹脂ス｝リツプをびんの頂部に軽く触れさせ
ることによってびん上で該ストリップから排液されるべ
きである。

元通り栓をする。９ 各反応びんについて、累積カウン
トが最小限１０，０００となるに十分な時間、後カウン
トを測定する。

正味ＣＰＭｌ＆カウントを決定し、これを記録する。

１０ 各反応びんの正味ＣＰＭＩカウント（工程９）を
平均正味ＣＰＭ初期カウント（王程２）で除す。

その商が抗体に結合したチロキシンＩ−１２５係である
。

１１ 片対数グラフ用紙の等間隔軸に、各標準試料に関
する二つの値の平均結合係を、標準試料の濃度関数とし
てμ１％でプロットする。

１２ 各患者の抑清の結合係を決定する。

その結合チに関するチロキシン濃度を標準曲線（例えば
、第２図を参照）から求める。

第２図に示した標準曲線は、下記表の数字をプロットす
ることにより作製された。

この放射免疫測定方法によって、ユーチロイド範囲は４
．５〜１２．０μｖ係、平均７．４±１．８であるとわ
かった。

また、ハイパーチロイド患者の平均値は１７．１±４．
８μｒ％、ハイボチロイド患者のそれは２．７±１．５
μ１％とわかった。

この標準範囲を用いたとき、力清Ｔ４は臨床的にハイパ
ーチロイド患者の９２係で高く、臨床的にハイボチロイ
ドの患者の８８係で標準範囲より下回わることがわかっ
た。

妊娠しているか又はエストロゲン治療法を受けている患
者の平均抽清Ｔ４は夫々１１，０±１．４μ２係および
１０．９±２．８μｆ％であるとわかった。

すなわち、標準範囲の高い方である。アンドローゲン療
法を受けている患者の平均Ｔ４は４．３±１．０μｆ％
であるとわかった。

新生児の平均抑清Ｔ４は１９．５±５．１μｔ％である
とわかった。

下記データは典型的なキットを用いて得られたもので、
既知濃度のＴ４に関する抑制面清について７つの異なっ
た各日に各測定で６回反復した結果の平均値及び標準偏
差を表わす。

各実験内の測定変化 下記データは典型的なキットを用いて得られたもので、
ハイポチロイド、ユーチロイド及びハイパーチロイド抑
制抑清について４つの異なった各日に各測定で６回反復
した結果の平均値及び標準偏差を表わす。

三実験間の測定変化 下記データは典型的なキツ｝ｋ用いて得られたもので、
ハイポチロイド、ユーチロイド及びハイパーチロイド抑
制匍清について４日続けて行った各測定で４回反復した
結果の平均値及び標準偏差を表わす。

本発明のＴ４測定方法の感度および再現性は、０．５μ
ｔ％Ｔ４が１μ１％および２μグチの標準試料間で区別
しうるが如きものである。

以上の説明から、本発明のいくつかの目的が達成され且
つ他の有利な結果が得られたことがわかる。

本発明の範囲から逸脱することなく上記方法及び物質に
ついて種々の変更がなし得るので、本明細書又は図面に
示された事項は全て本発明を例示するものであってこれ
を制限するものではない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｌ−｝リョードチロニンのナノグラムパーセ
ント（ｎｌ７％）として表わしたＬ一トリョードチロニ
ンの標準溶液濃度に対し結合放射性Ｌ−｝リョードチロ
ニンのパーセント（％）ｆプロットすることによって得
た標準曲線の例を示すグラフである。 第２図はチロキシンのミクログラムパーセント（■チ）
として表わしたチロキシンの標準溶液濃度に対し結合放
射性チロキシンのパーセント（チ）をプロットすること
によって得た標準曲線の例を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ チロキシン含量を測定しようとする血清試料を、放
   射性チロキシンとチロキシンのチロキシン結合性グロプ
   リンに対する結合を抑制する禁止剤とを含有する緩衝溶
   液から本質上なる試薬と混合し、 この混合物に、牛血清アルプミンに結合したチロキシン
   のＮ−アセチル誘導体と１−エチル−３−（３−ジメチ
   ルアミノプロピル）カルボジイミドとの結合体を含むイ
   ンムノーゲンから産生された、チロキシンと免疫反応で
   きる抗体を含有する抗血清を添加し、 得られた混合物を、抗体結合チロキシンと未結合チロキ
   シンとの実質的平衡をもたらすに十分な時間或る温度で
   温置し、 抗体結合チロキシンから未結合チロキシンを分離し、 抗体結合放射性チロキシノと未結合放射性チロキシンと
   の相対量を決定する 諸工程からなる、未抽出血清中のチロキシンを試験管内
   に定量するための放射免疫測定方法。 ２ 温置工程が３７℃の温度で約３０分間実施される特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 未結合チロキシンが、混合物をイオン交換樹脂より
   本質上なる膜の比較的薄いストリップと所定の時間接触
   させることによって抗体結合チロキシンから分離される
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 混合物が膜との接触状態を室温で約３０分間保持さ
   れる特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ 放射性チロキシンがよう素−１２５含有チロキシン
   およびよう素−１３１含有チロキシンからなる群より選
   ばれる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 未抽出血清中のチロキシンを試験管内定量するため
   の放射免疫測定用抗血清にして、牛血清アルプミンに結
   合したチロキシンのＮ−アセチル誘導体と１−エチル−
   ３−（３−ジメチルアミンプロピル）カルボジイミドと
   の結合体を含むインムノーゲンから産生された、チロキ
   シンと免疫反応できる抗体を含有する抗血清。