JPS6311627B2 - - Google Patents
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- JPS6311627B2 JPS6311627B2 JP54071096A JP7109679A JPS6311627B2 JP S6311627 B2 JPS6311627 B2 JP S6311627B2 JP 54071096 A JP54071096 A JP 54071096A JP 7109679 A JP7109679 A JP 7109679A JP S6311627 B2 JPS6311627 B2 JP S6311627B2
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Description
本発明は遊離被分析物質の定量法に関する。本
発明の目的のためには、遊離被分析物質とは、試
料中ある物質の一部は未結合で、一部は受容体へ
結合している試料中のある物質を意味する。一般
に該物質の大部分は、受容体へ確実ではあるが可
逆的に結合する。また多くの場合該受容体は、質
量作用の法則に従つて溶液中に非常に少量の遊離
被分析物質が存在していても、追加の被分析物質
を結合し得る部位を持つであろう。受容体は普通
可溶性で、そして多くの場合タンパクである。 遊離被分析物質の重要性は、多数の薬剤および
ホルモンの生理学的作用はそれらの総血中濃度よ
りも循環している遊離の薬剤またはホルモンの濃
度に関係するという事実にある。このような遊離
被分析物質およびそれらの受容体の例は、甲状腺
ホルモンおよびチロキシン結合タンパク
（TBP）、アルドステロン、プロゲステロン、お
よびテストステロンと性ホルモン結合グロブリ
ン、ジフエニルヒダントインとアルブミン、抗血
友病フアクターとその阻害因子、タンパク分解酵
素とその阻害剤または賦活剤、コルチゾールとコ
ルチゾール結合タンパク、そしてビタミンB12と
内因子である。そのほかにも多数の例が知られ、
または将来知られるであろう。これらシステムの
もつとも完全に研究され、そしてもつとも重要な
ものは、甲状腺ホルモン−TBP結合系である。
多くの従来技術はこの系に関しているので、遊離
甲状腺ホルモン定量が以下の議論の議題の大部分
である。しかしながら同じ問題と方法が他の遊離
被分析物質にも通用することを記憶すべきであ
る。 甲状線代謝機能の状態は、普通甲状腺ホルモン
チロキシン（化学名３，５，3′，5′−Ｌ−テトラ
ヨードチロニン、T4）の全血清含量の測定によ
つて評価される。循環しているT4の99.5％以上
は、一義的にはチロキシン結合グロブリン
（TBG）、および二次的にはチロキシン結合プレ
アルブミン（TBPA）およびアルブミン（これ
らを総称してチロキシン結合タンパク（TBP）
という）へ結合して血清中へ輸送せられた代謝的
に不活性な貯蔵庫として役立つ。循環している
T4の残りの0.1％以下の遊離または未結合分画が
組織中へ拡散しその作用を発揮するので生理的に
活性であり、その濃度はホルモン除去率の重要な
測定であり、そしてTBPの異常は通常その濃度
に影響しないことについて非常に沢山の証拠が存
在する。それは、やはり血清中に遊離およびタン
パク結合型として存在するトリヨードチロキシン
（T3）の前駆物質であると考えられている。再び
遊離T3濃度は甲状腺機能の状態に最も良く関連
する。 試料中のT4の絶対量は、遊離または結合型に
関係なく総T4試験によつて測定される。通常の
操作は、T4の大部分を溶液中へ放出させるよう
にTBPをアルコールで変性するか、またはサリ
チル酸塩のような置換剤を加え、次いでラジオア
イソトープ標識T4と、イオン交換樹脂または不
溶性抗体のようなT4受容体を添加する。試料と
標識T4とは受容体の限られた部位に競合するこ
とが許容され、次に受容体を可溶性反応剤から分
離し、受容体へ結合した放射能が測定される。こ
の放射能は当初存在した試料T4の量に反比例す
る。しかしながら甲状腺機能正常人のTBPレベ
ル、特にTBGレベルによつて上下するので、結
合タンパクの濃度を変化させるフアクターによつ
て甲状腺機能異常が誤つて示されることがある。
アンドローゲン、エストローゲン、同化ホルモ
ン、グルココルチコイド、および正常な妊娠も
TBGレベルを変える。このように総T4定量だけ
では甲状腺状態の信頼できる表示とはなり得ない
ことが発見された。 普通TBGレベルの変化は、視床下部甲状腺軸
のネガテイブフイードバツク機構が遊離T4濃度
を一定に保つように作用するので、総T4レベル
がシフトすることによつて補償される。従つて血
清中のチロキシンの未結合または遊離部分は、甲
状腺代謝状態の最も有用な一定した指示である。
未結合チロキシンの量は質量作用の法則に支配さ
れ、そして大部分総循環T4とTBG濃度の関数で
ある。 総T4へ甲状腺代謝状態を関連されることの因
難は、甲状腺ホルモン吸収定量の発達へ導いた。
この試験は血清TBP結合能力の相対量、すなわ
ち生体中甲状腺ホルモンの吸収によつて未だ占領
されていない相対量を測定する。甲状腺ホルモン
吸収イムノアツセイは、通常血清サンプル中へ標
識したT3を該T3が不飽和TBP結合部位によつて
吸収されるまで加え、混合物をイオン交換樹脂ま
たは抗体のような不溶性T3受容体に接触させる
ことによつて未吸収T3を反応混合物から除去し、
そして除去した標識T3を測定することによつて
実施される。T4も使用することができる。不溶
性受容体へ結合した標識甲状腺ホルモンの比例的
に低い量によつて比例的に多数の未占領結合部位
が示される。 直接の遊離T4測定の代りに、甲状腺ホルモン
の吸収のパーセントは、遊離チロキシン指数（ク
ラークら、J.Clin.Endocrinol.25：39−45〔1965〕）
に到達するように、同じ試料についての総T4ま
たはタンパク結合ヨード定量の結果と乗算され
る。遊離チロキシン指数は、吸収結果は血清中の
不飽和TBPへ反比例すること、そして遊離T4は
総T4に正比例しそして未推定TBPレベルに反比
例して変化するとの前提を基礎にしている。この
遊離チロキシン指数は各種の欠点を蒙る。それは
限られた感度および精度が可能で、別々の定量が
必要であり、そして指数が基礎とする吸収テスト
は病気の甲状腺機能正常患者、遺伝性TBG欠乏
症人、高TBG濃度人、そしてフエニルブタゾン、
ジフエニルヒダントイン、サリチル酸およびプレ
ドニソンのような薬剤の治療を受けている患者に
使用するときは誤つた値を与えることがある。 二つの別箇の定量の必要性は、米国特許第
4046876号に開示された動的遊離T4定量法の必須
部分である。この方法では二系列の試験管が定量
される。両系列とも、最初標識したT4、内分泌
試料T4およびTBPの間に平衡が確立される。一
方の系列にはT4の大部分をTBPから置換する試
薬が存在する。すなわちこの系列は総T4の測定
を与える。他方の系列はこのような試薬を含まな
いから、それは主としてT4吸収測定を与える。
次に各反応混合物は不溶性T4抗体へ加えられ、
設定した期間インキユベートされ、相分離し、そ
して固相の標識を定量する。二系列における相対
反応速度を各試験管のペアについて計算し、結果
を標準プロツトと比較する。各測定について二系
列の定量を必要とする不利のほかに、密接に関連
する遊離チロキシン指数と同様に、この方法は複
雑な計算を必要とする。またこの方法は動的方法
であるので、これは高度に時間に依存し、そのた
め同時に多数の測定を正確に実施することを困難
にする。 米国特許第3799740号は、一本の容器中で遊離
T4の測定、有効チロキシン比を得るための技術
を開示する。しかしながらこの方法はなお本質的
に甲状腺ホルモン吸収と総T4の二重測定を基本
にしている。この方法によれば、試料T4はTBG
から抽出され、この抽出液の部分標本が標識T4
とTBGとの複合体と、そして同じ試料からの不
飽和TBGの部分標本と合併される。陰イオン選
択樹脂が次に反応混合物へ添加され、注意深く制
御された期間インキユベートされ、樹脂を除去
し、上清中の標識の量を測定する。この方法の分
析操作の一部は一本の容器中で実施することがで
きるが、T4抽出操作は厄介であり、測定へ相当
の誤差を導入する。他の誤差は二つの試料の部分
標本の取り扱い時に導入される。最後にこの方法
は全体として操作的に複雑である。 同様に米国特許第3941504号は単一の容器内で
実施し得る遊離T4定量法を記載する。こゝでは
試料と標識T4の部分標本が合併され、標識およ
び未標識T4が高PHでデキストランゲルカラム上
で血清TBPから抽出される。添加した全部の標
識のいくらかのパーセントは、不飽和TBPおよ
びあらかじめ抽出した試料での溶出の際にカラム
に残る。このパーセント、すなわち遊離チロキシ
ン当量は、適当なスタンダードとの比較で定量化
することのできる遊離T4の間接測定である。こ
の方法は操作の一部として総T4定量を明示的に
必要としないが、それにもかゝわらずT4および
標識T4をデキストランゲルカラム上に抽出する
間に導入される同じ誤差を蒙る。さらにカラムク
ロマトグラフイーは不便であり、不正確であり、
そして大規模の臨床使用には適していない。この
方法は誤差のもととなり易い二重の患者試料を取
り扱うことを必然的に伴い、そして過度に多数の
人手操作を含む。 遊離チロキシン試料と一般に呼ばれる他の関係
定量法のグループも、総内分泌T4の測定を必要
とする。これらの試験においては、血清と標識
T4とを、標識および未標識T4がTBPとT4の遊
離部分との間に均一に分布するまでインキユベー
トされる。このインキユベーシヨンと同時または
その後に、未結合T4が各種の技法、例えば炭末
もしくはデキストランゲン吸収、限外ロ過もしく
は透析を使用してTBP結合分画から分離される。 再び結果が同じ試料についての総T4測定の結
果と数学的に組み合わされる。従つてこれら試験
法は他の遊離T4法について記載した主な欠点、
すなわち二重定量の他のメンバーについて得られ
た遊離T4のパーセントを定量化するため総T4定
量を必要とする欠点を蒙る。これは各試験に含ま
れる誤差を倍化し、そして必要とする費用および
時間を二倍にする。これら方法ではいくつかの特
有の問題、例えば透析および限外ロ過技法中に高
度に精製した標識T4を必要とする問題に遭偶す
る。これら方法の例は、オツペンハイマーらの、
J.Clin.Investigation 42(11)：1762−1782（1963）お
よびキヤバレリらの、J.Nuclear Medicine10
(9)：566−570（1969）である。透析分離を使用す
るテストステロンについての類似の定量法も公知
である。 最後に遊離T4は、試料を透析し、透析物をガ
スクロマトグラフイーまたは電気泳動によつて定
量することによつて直接定量することができる。
これら方法は感度、精度および結合定量の簡便さ
を欠き、高度の熟練を必要とし、そして日常研究
室で使用するには時間がかゝり過ぎる。 従つて本発明の一般的目的は、既知の遊離被分
析物質の定量法の技術的および理論的不利と、そ
してこのような定量を実施するのに要する時間と
熟練度を減らすことである。 本発明の他の一目的は、既知の遊離被分析物質
定量法の精度を改良し、そのコストを低減し、そ
してそのような定量に必要とする試薬の数を減ら
すことである。 本発明の一主要目的は、遊離被分析物質濃度の
測定に総被分析物質定量の必要性をなくすことで
ある。 本発明の一目的は、遊離被分析物質の直接測定
法を提供することである。 本発明の他の目的は、遊離被分析物質濃度の定
量に試料被分析物質抽出をなくすことである。 本発明のさらに他の目的は、測定すべき試料の
二重の部分標本を取り扱うことをなくすことであ
る。 本発明の他の一目的は、内分泌性の結合被分析
物質を含む溶液から遊離被分析物質の除去を簡単
化することである。 これらおよび他の目的は、本発明を全体として
考えるときに明らかになるであろう。 上述の目的は、遊離被分析物質定量を本質的に
二工程で実施することによつて達成される。最初
の工程において、天然の試料は溶液から遊離被分
析物質を除去するために被分析物質の吸収剤と接
触させられる。二番目の工程において、吸収剤に
結合した被分析物質は、標識した被分析物質類縁
体または被分析物質の標識した受容体と接触させ
られる。次に以前の定量法と同様に可溶相を吸収
剤から除去し、どちらかの標識を測定する。しか
しながら既知の遊離被分析物質定量法と異なつ
て、本発明方法の結果は遊離被分析物質の直接定
量であつてパーセントではないので、そのとき総
被分析物質を測定する必要は全くない。結果は典
型的な標準曲線上に簡単にプロツトすることがで
き、遊離被分析物質は直接測定される。本発明は
既知の遊離被分析物質の技術の重荷を著しく軽減
し、エレガントな、感度の高い、精密な直接的な
操作に置き換える。 遊離被分析物質濃度を直接測定する開示する方
法は、(a)遊離型および結合型の被分析物質を含む
試料を該物質の標識してない受容体と接触させて
該物質の遊離型部分を選択的にを結合し、(b)該試
料を前記受容体との接触から除去し、(c)前記受容
体を(i)標識した被分析物質の類縁体または(ii)標識
した可溶性被分析物質受容体よりなる群から選ば
れた標識した試薬と接触させ、(d)該受容体を末結
合標識試薬から分離し、そして(e)結合した、また
は結合しない標識の量を測定することよりなる。 本発明方法は、どんな遊離被分析物質にも適用
可能である。このような被分析物質の多くは、比
較的低分子量化合物で、約3000までの分子量オー
ダにある。遊離被分析物質の支配的クラスは、薬
剤およびホルモンである。薬剤の例は、コルチゾ
ールおよびジフエニルヒダントインであり、一方
興味ある特定のホルモンはプロゲステロン、イン
シユリン、および甲状腺ホルモン、特にT4であ
る。 本発明方法には最低三種の被分析物質受容体が
含まれる。試料受容体は、被分析物質の種々の量
との複合体として試料中に発見される天然受容体
である。標識および未標識受容体は本発明方法で
使用される試薬である。未標識受容体は本発明の
すべての具体例において遊離被分析物質を結合す
るために用いられるが、標識受容体は一特定代替
法においてのみ用いられる。これら受容体の二種
または３種以上は同じでもよく、またはそれらは
すべて異なつてもよい。 被分析物質の未標識受容体は注意深く選定され
なければならない。一般的要件として、それは被
分析物質に対し高い親和力を持たなければならな
いが、しかし低い被分析物質結合能力を持つこ
と、すなわちそれは試料中に発見されることが期
待されるよりも有意に多量の被分析物質を吸収し
得てはならない。これは未標識受容体を試料と接
触させる工程は、通常は遊離の被分析物質を結合
することを目標とするからである。さもなければ
定量感度は悪影響され、そしてもし被分析物質の
十分に多量の割合が被分析物質複合体から吸収さ
れると、この操作は実質上総被分析物質濃度を測
定することになる。さらにもし未標識受容体の能
力および親和性が試料被分析物質受容体のそれと
過度に異なると、試料受容体による被分析物質の
その複合体からの徐々の除去によつて発生する、
第一工程吸収における時間依存性の程度が定量へ
も導入される。多くの場合、スタンダードおよび
対照において平行的な吸収がおこるので、この除
去は人為的に高いレベルの遊離被分析物質ではお
こらないが、しかしスタンダード、対照および試
料のインキユベーシヨン時間は密に制御しなけれ
ばならない。 好適な未標識受容体は弱イオン交換樹脂、米国
特許第3666854号に記載のような無機吸収材料、
または被分析物質抗体のようなタンパクである。
未標識被分析物質受容体を試料と接触させる前に
不溶化する場合には、試料被分析物質受容体複合
体に見出されるのと同じ被分析物質受容体、例え
ばTBGを使用することができる。しかしながら
被分析物質抗体が好ましく、そして遊離チロキシ
ン定量については約1.4×1011リツトル／モルの
計算親和定数が満足であることが判明した。 未標識受容体は、試料を該受容体との接触から
除去するのを容易にするため普通不溶化される。
遊離被分析物質の結合前、結合中または結合後
に、受容体はそれが不溶性になるまで、それを不
活性表面へ吸収するか、もしくは共有結合し、ま
たは例えば公知手法によつてポリエチレングリコ
ール沈デンまたはグルタルアルデヒド架橋によ
り、受容体を凝集もしくは共有結合的に架橋する
ことによつて不溶化することができる。特に好ま
しい慣用手法の一つは、被分析物質抗体を試料と
の接触前にプラスチツク試験管内壁へ吸収させる
ことである。この場合試験管は遊離被分析物質の
測定全体の唯一の反応容器となり、この方法を実
施するのに不溶分を可溶分から分離するのに遠心
やロ過が必要でないから、試薬の取り扱いが相当
に単純化される。未標識受容体をそれが遊離被分
析物質と結合してから後に不溶化することも本発
明の範囲内であるが、このような場合不溶化手法
は試料受容体まで不溶化しないことが明瞭に必要
である。試料と未標識受容体とが免疫学的に区別
できる場合には、未標識受容体は、未標識受容体
の免疫沈デンを生成させるため単に十分な未標識
受容体抗体を加えることにより、遊離被分析物質
の吸収後そして試料受容体の存在下において沈デ
ンすることができる。 使用する未標識受容体の量は、定量条件下にお
ける被分析物質に対するその能力および親和性の
関数である。しかしながら結合部位だけで表現さ
れたその量は、通常試料中に見出されるべき遊離
被分析物質の推定範囲よりも多く、しかも標識試
薬および推定遊離被分析物質の合計よりも少な
い。標識試薬が標識被分析物質類縁体である場合
は、未標識受容体結合部位は限定される。例えば
総T4のような総被分析物質測定に以前使用され
ていた慣用の抗体吸収試験管が満足である。 標識被分析物質受容体は可溶性でなければなら
ず、そして被分析物質が二つの受容体、すなわち
未標識および標識受容体を同時に結合できる場合
のみそのような受容体を使用するのが実際的であ
る。例えば未標識および標識受容体の両者が被分
析物質抗体である場合には、被分析物質は多エピ
トープ性でなければならない。その結果、標識受
容体は普通少なくとも二つの結合部位を有する可
能性ある高分子量被分析物質に使用される。標識
受容体およびその製法はよく知られ、このような
受容体はある時期サンドイツチイムノアツセイお
よび組織化学に使用された。この特別の標識試薬
を使用するとき標識受容体の被分析物質への最高
の結合が望まれるので、受容体は被分析物質を最
高に結合するようにできるだけ高い親和性と能力
によつて選定されるのが好ましい。ラジオアイソ
トープで標識した被分析物質抗体を使用するのが
好ましい。 標識した被分析物質類縁体もやはり良く知られ
た種類の試薬である。これらは天然被分析物質の
最低一原子を、通常ラジオアイソトープまたは酵
素である検出可能な基で置換することによつて製
造される。該検出基は、被分析物質へ担体基によ
つて、または被分析物質原子の直接置換によつて
結合される。後者の例は、ヨード原子の一つを
125Iまたは 131Iのような放射性ヨードで置換した
T4である。 被分析物質であれ、被分析物質受容体であれ、
標識試薬のための適当な標識は公知である。例え
ば酵素およびラジオアイソトープのほかに、安定
フリーラジカル、補酵素またはケミルミネツセン
ト化合物のような螢光化合物または反応剤を使用
することも本発明の範囲内である。 本発明の方法においては、遊離被分析物質およ
び結合被分析物質を含む試料が未標識受容体と接
触させられる。上述のように、未標識受容体は好
ましくはプラスチツク容器、例えばポリプロピレ
ン試験管の内表面へ吸収された被分析物質抗体で
ある。もし受容体がタンパクであれば、それはグ
ルタルアルデヒドで架橋することができ、そして
アメリカ特許第4069352号によつて表面へ吸収す
ることができる。 一般に全強度の試料を使用することは、特に試
料が血清の場合は有利ではない。このような試料
の高い溶質濃度は被分析物質受容体の性能に悪く
影響することがある。さらに抗体塗布表面は比較
的低能力、低親和性受容体である。試料中にしば
しば見られる遊離被分析物質の極端に低い濃度に
ついてそれらの有効な使用は、試料の希釈によつ
て相当に助けられる。試料の希釈は少量の被分析
物質をその受容体から移動させ、それは遊離被分
析物質と合わされるとき、後で受容体へ結合した
被分析物質の測定を実施するための表面へ十分な
被分析物質が結合する結合となる。このように試
料へ試料を未標識受容体と接触する前か、その最
中に試料体積の２ないし15倍の水または緩衝液を
添加するのが好ましい。通常試料を少量のウシ血
清アルブミンを含む0.01Mリン酸緩衝食塩水中へ
１：11希釈度とするのがよい。 標識試薬を含有しない反応混合物は、受容体が
遊離被分析物質の少なくとも有意割合を吸収する
のに十分な期間と温度でインキユベートされる。
被分析物質が受容体と結合するのに有利な平衡
は、内分泌被分析物質と受容体との複合体の解離
のそれよりも相当に大であるので、この時点では
短かいインキユベーシヨン、例えば５ないし30分
間、および反応成分が安定な温度でのインキユベ
ーシヨンを使用するのが好ましい。遊離T4測定
に好ましいインキユベーシヨンは、上述の試料希
釈度およびT4抗体親和性を使用するとき、約37
℃において約10分である。 インキユベーシヨン後未標識受容体結合被分析
物質は他の反応成分から分離される。これは前述
の受容体不溶化テクニツクによつて達成すること
ができる。しかしながら受容体塗布試験管の液体
成分の吸引または傾しやが最も便利である。不溶
性受容体結合被分析物質の緩衝液または水による
洗浄は、不溶性物質が試料受容体または試料受容
体結合被分析物質を含まないことを確実にするた
めに好ましい。 次に結合した被分析物質の量は、標識した被分
析物質類縁体または標識可溶性被分析物質受容体
のいずれかを添加し、不溶相を可溶相から分離
し、該相の少なくとも一つの標識含量を測定する
ことによつて定量される。好ましくは標識被分析
物質類縁体が使用され、その場合は不溶性受容体
結合部位は被分析物質および標識被分析物質の約
合計より少なくし、競合的置換平衡が生起するよ
うにしなければならない。さもないと受容体結合
部位の量は、非特異的標識受容体結合が問題でな
い限り、一般に不適当である。標識した被分析物
質類縁体の量は重要でない。標識した受容体の量
は未標識受容体結合被分析物質の量より多くなけ
ればならない。標識した試薬は通常緩衝液として
添加される。 通常標識試薬は、相分離前に不溶性受容体結合
被分析物質と平衡化するのを許容される。標識試
薬を受容体結合被分析物質の有意量が溶液中へ解
離する以前に除去することによつて定量感度を増
すことが可能である。しかしながらどの位解離が
生起するかは時間により、従つて試料の大グルー
プについて定量を行うのは困難である。その代り
に反応混合物が堅実な状態に到達することを許容
することが好ましい。平衡は未標識受容体による
被分析物質結合と同じ要因に依存し、そして当業
者には容易に決定することができる。T4の場合
約37℃において約１時間が満足である。 相分離は遠心、ロ過、または塗布試験管を使用
するときは傾しやもしくは吸引のような公知の手
法で有効に実施される。不溶性生成物は次に水ま
たは緩衝液で、前工程と同様に洗浄することがで
きる。好ましくは不溶性物質はその標識含量につ
いて定量されるが、残在可溶性標識試薬も測定す
ることができる。次に試料についての結果が同様
に試験された対照およびスタンダードと内挿法に
よつて比較され、遊離被分析物質の直接定量に到
達する。 本発明は以下の実施例を参照することによつて
さらに完全に理解されるであろう。 実施例 １ この実施例は、本発明方法を使用して二人の患
者の試料中の遊離T4の定量が実施できる容易さ
を例示する。T4に対するウサギ抗体を塗布した
ポリプロピレン試験管を、以下の方式に従つて二
通りマークした。
発明の目的のためには、遊離被分析物質とは、試
料中ある物質の一部は未結合で、一部は受容体へ
結合している試料中のある物質を意味する。一般
に該物質の大部分は、受容体へ確実ではあるが可
逆的に結合する。また多くの場合該受容体は、質
量作用の法則に従つて溶液中に非常に少量の遊離
被分析物質が存在していても、追加の被分析物質
を結合し得る部位を持つであろう。受容体は普通
可溶性で、そして多くの場合タンパクである。 遊離被分析物質の重要性は、多数の薬剤および
ホルモンの生理学的作用はそれらの総血中濃度よ
りも循環している遊離の薬剤またはホルモンの濃
度に関係するという事実にある。このような遊離
被分析物質およびそれらの受容体の例は、甲状腺
ホルモンおよびチロキシン結合タンパク
（TBP）、アルドステロン、プロゲステロン、お
よびテストステロンと性ホルモン結合グロブリ
ン、ジフエニルヒダントインとアルブミン、抗血
友病フアクターとその阻害因子、タンパク分解酵
素とその阻害剤または賦活剤、コルチゾールとコ
ルチゾール結合タンパク、そしてビタミンB12と
内因子である。そのほかにも多数の例が知られ、
または将来知られるであろう。これらシステムの
もつとも完全に研究され、そしてもつとも重要な
ものは、甲状腺ホルモン−TBP結合系である。
多くの従来技術はこの系に関しているので、遊離
甲状腺ホルモン定量が以下の議論の議題の大部分
である。しかしながら同じ問題と方法が他の遊離
被分析物質にも通用することを記憶すべきであ
る。 甲状線代謝機能の状態は、普通甲状腺ホルモン
チロキシン（化学名３，５，3′，5′−Ｌ−テトラ
ヨードチロニン、T4）の全血清含量の測定によ
つて評価される。循環しているT4の99.5％以上
は、一義的にはチロキシン結合グロブリン
（TBG）、および二次的にはチロキシン結合プレ
アルブミン（TBPA）およびアルブミン（これ
らを総称してチロキシン結合タンパク（TBP）
という）へ結合して血清中へ輸送せられた代謝的
に不活性な貯蔵庫として役立つ。循環している
T4の残りの0.1％以下の遊離または未結合分画が
組織中へ拡散しその作用を発揮するので生理的に
活性であり、その濃度はホルモン除去率の重要な
測定であり、そしてTBPの異常は通常その濃度
に影響しないことについて非常に沢山の証拠が存
在する。それは、やはり血清中に遊離およびタン
パク結合型として存在するトリヨードチロキシン
（T3）の前駆物質であると考えられている。再び
遊離T3濃度は甲状腺機能の状態に最も良く関連
する。 試料中のT4の絶対量は、遊離または結合型に
関係なく総T4試験によつて測定される。通常の
操作は、T4の大部分を溶液中へ放出させるよう
にTBPをアルコールで変性するか、またはサリ
チル酸塩のような置換剤を加え、次いでラジオア
イソトープ標識T4と、イオン交換樹脂または不
溶性抗体のようなT4受容体を添加する。試料と
標識T4とは受容体の限られた部位に競合するこ
とが許容され、次に受容体を可溶性反応剤から分
離し、受容体へ結合した放射能が測定される。こ
の放射能は当初存在した試料T4の量に反比例す
る。しかしながら甲状腺機能正常人のTBPレベ
ル、特にTBGレベルによつて上下するので、結
合タンパクの濃度を変化させるフアクターによつ
て甲状腺機能異常が誤つて示されることがある。
アンドローゲン、エストローゲン、同化ホルモ
ン、グルココルチコイド、および正常な妊娠も
TBGレベルを変える。このように総T4定量だけ
では甲状腺状態の信頼できる表示とはなり得ない
ことが発見された。 普通TBGレベルの変化は、視床下部甲状腺軸
のネガテイブフイードバツク機構が遊離T4濃度
を一定に保つように作用するので、総T4レベル
がシフトすることによつて補償される。従つて血
清中のチロキシンの未結合または遊離部分は、甲
状腺代謝状態の最も有用な一定した指示である。
未結合チロキシンの量は質量作用の法則に支配さ
れ、そして大部分総循環T4とTBG濃度の関数で
ある。 総T4へ甲状腺代謝状態を関連されることの因
難は、甲状腺ホルモン吸収定量の発達へ導いた。
この試験は血清TBP結合能力の相対量、すなわ
ち生体中甲状腺ホルモンの吸収によつて未だ占領
されていない相対量を測定する。甲状腺ホルモン
吸収イムノアツセイは、通常血清サンプル中へ標
識したT3を該T3が不飽和TBP結合部位によつて
吸収されるまで加え、混合物をイオン交換樹脂ま
たは抗体のような不溶性T3受容体に接触させる
ことによつて未吸収T3を反応混合物から除去し、
そして除去した標識T3を測定することによつて
実施される。T4も使用することができる。不溶
性受容体へ結合した標識甲状腺ホルモンの比例的
に低い量によつて比例的に多数の未占領結合部位
が示される。 直接の遊離T4測定の代りに、甲状腺ホルモン
の吸収のパーセントは、遊離チロキシン指数（ク
ラークら、J.Clin.Endocrinol.25：39−45〔1965〕）
に到達するように、同じ試料についての総T4ま
たはタンパク結合ヨード定量の結果と乗算され
る。遊離チロキシン指数は、吸収結果は血清中の
不飽和TBPへ反比例すること、そして遊離T4は
総T4に正比例しそして未推定TBPレベルに反比
例して変化するとの前提を基礎にしている。この
遊離チロキシン指数は各種の欠点を蒙る。それは
限られた感度および精度が可能で、別々の定量が
必要であり、そして指数が基礎とする吸収テスト
は病気の甲状腺機能正常患者、遺伝性TBG欠乏
症人、高TBG濃度人、そしてフエニルブタゾン、
ジフエニルヒダントイン、サリチル酸およびプレ
ドニソンのような薬剤の治療を受けている患者に
使用するときは誤つた値を与えることがある。 二つの別箇の定量の必要性は、米国特許第
4046876号に開示された動的遊離T4定量法の必須
部分である。この方法では二系列の試験管が定量
される。両系列とも、最初標識したT4、内分泌
試料T4およびTBPの間に平衡が確立される。一
方の系列にはT4の大部分をTBPから置換する試
薬が存在する。すなわちこの系列は総T4の測定
を与える。他方の系列はこのような試薬を含まな
いから、それは主としてT4吸収測定を与える。
次に各反応混合物は不溶性T4抗体へ加えられ、
設定した期間インキユベートされ、相分離し、そ
して固相の標識を定量する。二系列における相対
反応速度を各試験管のペアについて計算し、結果
を標準プロツトと比較する。各測定について二系
列の定量を必要とする不利のほかに、密接に関連
する遊離チロキシン指数と同様に、この方法は複
雑な計算を必要とする。またこの方法は動的方法
であるので、これは高度に時間に依存し、そのた
め同時に多数の測定を正確に実施することを困難
にする。 米国特許第3799740号は、一本の容器中で遊離
T4の測定、有効チロキシン比を得るための技術
を開示する。しかしながらこの方法はなお本質的
に甲状腺ホルモン吸収と総T4の二重測定を基本
にしている。この方法によれば、試料T4はTBG
から抽出され、この抽出液の部分標本が標識T4
とTBGとの複合体と、そして同じ試料からの不
飽和TBGの部分標本と合併される。陰イオン選
択樹脂が次に反応混合物へ添加され、注意深く制
御された期間インキユベートされ、樹脂を除去
し、上清中の標識の量を測定する。この方法の分
析操作の一部は一本の容器中で実施することがで
きるが、T4抽出操作は厄介であり、測定へ相当
の誤差を導入する。他の誤差は二つの試料の部分
標本の取り扱い時に導入される。最後にこの方法
は全体として操作的に複雑である。 同様に米国特許第3941504号は単一の容器内で
実施し得る遊離T4定量法を記載する。こゝでは
試料と標識T4の部分標本が合併され、標識およ
び未標識T4が高PHでデキストランゲルカラム上
で血清TBPから抽出される。添加した全部の標
識のいくらかのパーセントは、不飽和TBPおよ
びあらかじめ抽出した試料での溶出の際にカラム
に残る。このパーセント、すなわち遊離チロキシ
ン当量は、適当なスタンダードとの比較で定量化
することのできる遊離T4の間接測定である。こ
の方法は操作の一部として総T4定量を明示的に
必要としないが、それにもかゝわらずT4および
標識T4をデキストランゲルカラム上に抽出する
間に導入される同じ誤差を蒙る。さらにカラムク
ロマトグラフイーは不便であり、不正確であり、
そして大規模の臨床使用には適していない。この
方法は誤差のもととなり易い二重の患者試料を取
り扱うことを必然的に伴い、そして過度に多数の
人手操作を含む。 遊離チロキシン試料と一般に呼ばれる他の関係
定量法のグループも、総内分泌T4の測定を必要
とする。これらの試験においては、血清と標識
T4とを、標識および未標識T4がTBPとT4の遊
離部分との間に均一に分布するまでインキユベー
トされる。このインキユベーシヨンと同時または
その後に、未結合T4が各種の技法、例えば炭末
もしくはデキストランゲン吸収、限外ロ過もしく
は透析を使用してTBP結合分画から分離される。 再び結果が同じ試料についての総T4測定の結
果と数学的に組み合わされる。従つてこれら試験
法は他の遊離T4法について記載した主な欠点、
すなわち二重定量の他のメンバーについて得られ
た遊離T4のパーセントを定量化するため総T4定
量を必要とする欠点を蒙る。これは各試験に含ま
れる誤差を倍化し、そして必要とする費用および
時間を二倍にする。これら方法ではいくつかの特
有の問題、例えば透析および限外ロ過技法中に高
度に精製した標識T4を必要とする問題に遭偶す
る。これら方法の例は、オツペンハイマーらの、
J.Clin.Investigation 42(11)：1762−1782（1963）お
よびキヤバレリらの、J.Nuclear Medicine10
(9)：566−570（1969）である。透析分離を使用す
るテストステロンについての類似の定量法も公知
である。 最後に遊離T4は、試料を透析し、透析物をガ
スクロマトグラフイーまたは電気泳動によつて定
量することによつて直接定量することができる。
これら方法は感度、精度および結合定量の簡便さ
を欠き、高度の熟練を必要とし、そして日常研究
室で使用するには時間がかゝり過ぎる。 従つて本発明の一般的目的は、既知の遊離被分
析物質の定量法の技術的および理論的不利と、そ
してこのような定量を実施するのに要する時間と
熟練度を減らすことである。 本発明の他の一目的は、既知の遊離被分析物質
定量法の精度を改良し、そのコストを低減し、そ
してそのような定量に必要とする試薬の数を減ら
すことである。 本発明の一主要目的は、遊離被分析物質濃度の
測定に総被分析物質定量の必要性をなくすことで
ある。 本発明の一目的は、遊離被分析物質の直接測定
法を提供することである。 本発明の他の目的は、遊離被分析物質濃度の定
量に試料被分析物質抽出をなくすことである。 本発明のさらに他の目的は、測定すべき試料の
二重の部分標本を取り扱うことをなくすことであ
る。 本発明の他の一目的は、内分泌性の結合被分析
物質を含む溶液から遊離被分析物質の除去を簡単
化することである。 これらおよび他の目的は、本発明を全体として
考えるときに明らかになるであろう。 上述の目的は、遊離被分析物質定量を本質的に
二工程で実施することによつて達成される。最初
の工程において、天然の試料は溶液から遊離被分
析物質を除去するために被分析物質の吸収剤と接
触させられる。二番目の工程において、吸収剤に
結合した被分析物質は、標識した被分析物質類縁
体または被分析物質の標識した受容体と接触させ
られる。次に以前の定量法と同様に可溶相を吸収
剤から除去し、どちらかの標識を測定する。しか
しながら既知の遊離被分析物質定量法と異なつ
て、本発明方法の結果は遊離被分析物質の直接定
量であつてパーセントではないので、そのとき総
被分析物質を測定する必要は全くない。結果は典
型的な標準曲線上に簡単にプロツトすることがで
き、遊離被分析物質は直接測定される。本発明は
既知の遊離被分析物質の技術の重荷を著しく軽減
し、エレガントな、感度の高い、精密な直接的な
操作に置き換える。 遊離被分析物質濃度を直接測定する開示する方
法は、(a)遊離型および結合型の被分析物質を含む
試料を該物質の標識してない受容体と接触させて
該物質の遊離型部分を選択的にを結合し、(b)該試
料を前記受容体との接触から除去し、(c)前記受容
体を(i)標識した被分析物質の類縁体または(ii)標識
した可溶性被分析物質受容体よりなる群から選ば
れた標識した試薬と接触させ、(d)該受容体を末結
合標識試薬から分離し、そして(e)結合した、また
は結合しない標識の量を測定することよりなる。 本発明方法は、どんな遊離被分析物質にも適用
可能である。このような被分析物質の多くは、比
較的低分子量化合物で、約3000までの分子量オー
ダにある。遊離被分析物質の支配的クラスは、薬
剤およびホルモンである。薬剤の例は、コルチゾ
ールおよびジフエニルヒダントインであり、一方
興味ある特定のホルモンはプロゲステロン、イン
シユリン、および甲状腺ホルモン、特にT4であ
る。 本発明方法には最低三種の被分析物質受容体が
含まれる。試料受容体は、被分析物質の種々の量
との複合体として試料中に発見される天然受容体
である。標識および未標識受容体は本発明方法で
使用される試薬である。未標識受容体は本発明の
すべての具体例において遊離被分析物質を結合す
るために用いられるが、標識受容体は一特定代替
法においてのみ用いられる。これら受容体の二種
または３種以上は同じでもよく、またはそれらは
すべて異なつてもよい。 被分析物質の未標識受容体は注意深く選定され
なければならない。一般的要件として、それは被
分析物質に対し高い親和力を持たなければならな
いが、しかし低い被分析物質結合能力を持つこ
と、すなわちそれは試料中に発見されることが期
待されるよりも有意に多量の被分析物質を吸収し
得てはならない。これは未標識受容体を試料と接
触させる工程は、通常は遊離の被分析物質を結合
することを目標とするからである。さもなければ
定量感度は悪影響され、そしてもし被分析物質の
十分に多量の割合が被分析物質複合体から吸収さ
れると、この操作は実質上総被分析物質濃度を測
定することになる。さらにもし未標識受容体の能
力および親和性が試料被分析物質受容体のそれと
過度に異なると、試料受容体による被分析物質の
その複合体からの徐々の除去によつて発生する、
第一工程吸収における時間依存性の程度が定量へ
も導入される。多くの場合、スタンダードおよび
対照において平行的な吸収がおこるので、この除
去は人為的に高いレベルの遊離被分析物質ではお
こらないが、しかしスタンダード、対照および試
料のインキユベーシヨン時間は密に制御しなけれ
ばならない。 好適な未標識受容体は弱イオン交換樹脂、米国
特許第3666854号に記載のような無機吸収材料、
または被分析物質抗体のようなタンパクである。
未標識被分析物質受容体を試料と接触させる前に
不溶化する場合には、試料被分析物質受容体複合
体に見出されるのと同じ被分析物質受容体、例え
ばTBGを使用することができる。しかしながら
被分析物質抗体が好ましく、そして遊離チロキシ
ン定量については約1.4×1011リツトル／モルの
計算親和定数が満足であることが判明した。 未標識受容体は、試料を該受容体との接触から
除去するのを容易にするため普通不溶化される。
遊離被分析物質の結合前、結合中または結合後
に、受容体はそれが不溶性になるまで、それを不
活性表面へ吸収するか、もしくは共有結合し、ま
たは例えば公知手法によつてポリエチレングリコ
ール沈デンまたはグルタルアルデヒド架橋によ
り、受容体を凝集もしくは共有結合的に架橋する
ことによつて不溶化することができる。特に好ま
しい慣用手法の一つは、被分析物質抗体を試料と
の接触前にプラスチツク試験管内壁へ吸収させる
ことである。この場合試験管は遊離被分析物質の
測定全体の唯一の反応容器となり、この方法を実
施するのに不溶分を可溶分から分離するのに遠心
やロ過が必要でないから、試薬の取り扱いが相当
に単純化される。未標識受容体をそれが遊離被分
析物質と結合してから後に不溶化することも本発
明の範囲内であるが、このような場合不溶化手法
は試料受容体まで不溶化しないことが明瞭に必要
である。試料と未標識受容体とが免疫学的に区別
できる場合には、未標識受容体は、未標識受容体
の免疫沈デンを生成させるため単に十分な未標識
受容体抗体を加えることにより、遊離被分析物質
の吸収後そして試料受容体の存在下において沈デ
ンすることができる。 使用する未標識受容体の量は、定量条件下にお
ける被分析物質に対するその能力および親和性の
関数である。しかしながら結合部位だけで表現さ
れたその量は、通常試料中に見出されるべき遊離
被分析物質の推定範囲よりも多く、しかも標識試
薬および推定遊離被分析物質の合計よりも少な
い。標識試薬が標識被分析物質類縁体である場合
は、未標識受容体結合部位は限定される。例えば
総T4のような総被分析物質測定に以前使用され
ていた慣用の抗体吸収試験管が満足である。 標識被分析物質受容体は可溶性でなければなら
ず、そして被分析物質が二つの受容体、すなわち
未標識および標識受容体を同時に結合できる場合
のみそのような受容体を使用するのが実際的であ
る。例えば未標識および標識受容体の両者が被分
析物質抗体である場合には、被分析物質は多エピ
トープ性でなければならない。その結果、標識受
容体は普通少なくとも二つの結合部位を有する可
能性ある高分子量被分析物質に使用される。標識
受容体およびその製法はよく知られ、このような
受容体はある時期サンドイツチイムノアツセイお
よび組織化学に使用された。この特別の標識試薬
を使用するとき標識受容体の被分析物質への最高
の結合が望まれるので、受容体は被分析物質を最
高に結合するようにできるだけ高い親和性と能力
によつて選定されるのが好ましい。ラジオアイソ
トープで標識した被分析物質抗体を使用するのが
好ましい。 標識した被分析物質類縁体もやはり良く知られ
た種類の試薬である。これらは天然被分析物質の
最低一原子を、通常ラジオアイソトープまたは酵
素である検出可能な基で置換することによつて製
造される。該検出基は、被分析物質へ担体基によ
つて、または被分析物質原子の直接置換によつて
結合される。後者の例は、ヨード原子の一つを
125Iまたは 131Iのような放射性ヨードで置換した
T4である。 被分析物質であれ、被分析物質受容体であれ、
標識試薬のための適当な標識は公知である。例え
ば酵素およびラジオアイソトープのほかに、安定
フリーラジカル、補酵素またはケミルミネツセン
ト化合物のような螢光化合物または反応剤を使用
することも本発明の範囲内である。 本発明の方法においては、遊離被分析物質およ
び結合被分析物質を含む試料が未標識受容体と接
触させられる。上述のように、未標識受容体は好
ましくはプラスチツク容器、例えばポリプロピレ
ン試験管の内表面へ吸収された被分析物質抗体で
ある。もし受容体がタンパクであれば、それはグ
ルタルアルデヒドで架橋することができ、そして
アメリカ特許第4069352号によつて表面へ吸収す
ることができる。 一般に全強度の試料を使用することは、特に試
料が血清の場合は有利ではない。このような試料
の高い溶質濃度は被分析物質受容体の性能に悪く
影響することがある。さらに抗体塗布表面は比較
的低能力、低親和性受容体である。試料中にしば
しば見られる遊離被分析物質の極端に低い濃度に
ついてそれらの有効な使用は、試料の希釈によつ
て相当に助けられる。試料の希釈は少量の被分析
物質をその受容体から移動させ、それは遊離被分
析物質と合わされるとき、後で受容体へ結合した
被分析物質の測定を実施するための表面へ十分な
被分析物質が結合する結合となる。このように試
料へ試料を未標識受容体と接触する前か、その最
中に試料体積の２ないし15倍の水または緩衝液を
添加するのが好ましい。通常試料を少量のウシ血
清アルブミンを含む0.01Mリン酸緩衝食塩水中へ
１：11希釈度とするのがよい。 標識試薬を含有しない反応混合物は、受容体が
遊離被分析物質の少なくとも有意割合を吸収する
のに十分な期間と温度でインキユベートされる。
被分析物質が受容体と結合するのに有利な平衡
は、内分泌被分析物質と受容体との複合体の解離
のそれよりも相当に大であるので、この時点では
短かいインキユベーシヨン、例えば５ないし30分
間、および反応成分が安定な温度でのインキユベ
ーシヨンを使用するのが好ましい。遊離T4測定
に好ましいインキユベーシヨンは、上述の試料希
釈度およびT4抗体親和性を使用するとき、約37
℃において約10分である。 インキユベーシヨン後未標識受容体結合被分析
物質は他の反応成分から分離される。これは前述
の受容体不溶化テクニツクによつて達成すること
ができる。しかしながら受容体塗布試験管の液体
成分の吸引または傾しやが最も便利である。不溶
性受容体結合被分析物質の緩衝液または水による
洗浄は、不溶性物質が試料受容体または試料受容
体結合被分析物質を含まないことを確実にするた
めに好ましい。 次に結合した被分析物質の量は、標識した被分
析物質類縁体または標識可溶性被分析物質受容体
のいずれかを添加し、不溶相を可溶相から分離
し、該相の少なくとも一つの標識含量を測定する
ことによつて定量される。好ましくは標識被分析
物質類縁体が使用され、その場合は不溶性受容体
結合部位は被分析物質および標識被分析物質の約
合計より少なくし、競合的置換平衡が生起するよ
うにしなければならない。さもないと受容体結合
部位の量は、非特異的標識受容体結合が問題でな
い限り、一般に不適当である。標識した被分析物
質類縁体の量は重要でない。標識した受容体の量
は未標識受容体結合被分析物質の量より多くなけ
ればならない。標識した試薬は通常緩衝液として
添加される。 通常標識試薬は、相分離前に不溶性受容体結合
被分析物質と平衡化するのを許容される。標識試
薬を受容体結合被分析物質の有意量が溶液中へ解
離する以前に除去することによつて定量感度を増
すことが可能である。しかしながらどの位解離が
生起するかは時間により、従つて試料の大グルー
プについて定量を行うのは困難である。その代り
に反応混合物が堅実な状態に到達することを許容
することが好ましい。平衡は未標識受容体による
被分析物質結合と同じ要因に依存し、そして当業
者には容易に決定することができる。T4の場合
約37℃において約１時間が満足である。 相分離は遠心、ロ過、または塗布試験管を使用
するときは傾しやもしくは吸引のような公知の手
法で有効に実施される。不溶性生成物は次に水ま
たは緩衝液で、前工程と同様に洗浄することがで
きる。好ましくは不溶性物質はその標識含量につ
いて定量されるが、残在可溶性標識試薬も測定す
ることができる。次に試料についての結果が同様
に試験された対照およびスタンダードと内挿法に
よつて比較され、遊離被分析物質の直接定量に到
達する。 本発明は以下の実施例を参照することによつて
さらに完全に理解されるであろう。 実施例 １ この実施例は、本発明方法を使用して二人の患
者の試料中の遊離T4の定量が実施できる容易さ
を例示する。T4に対するウサギ抗体を塗布した
ポリプロピレン試験管を、以下の方式に従つて二
通りマークした。
【表】
【表】
二系列試料は、定量の必須要件のためでなく、
統計学的理由から使用した。以下の試薬が室温に
達するのを許容し、そして二系列の対応試験管へ
加えた。 (a) 遊離T4血清ブランク、0nｇ／dl、100マイク
ロリツトル (b) 濃度0.25、1.0、2.9、4.9および7.35nｇ／dlの
各遊離T4血清スタンダードの100マイクロリツ
トル (c) 各試料の100マイクロリツトル 100マイクロリツトルの部分標本のピペツト採
取は再現できるように、そしてスタンダードと試
料の両方について同じやり方で行われるように注
意しなければならない。37℃に加温した、ウシ血
清アルブミンを含むPH7.4の0.01Mリン酸緩衝化
食塩水1.0mlを試料、スタンダードおよびブラン
クを希釈するために各試験管へ加えた。試験管全
部を次に37℃の水浴で10分間インキユベートし、
その後試験管の内容物を吸引した。サリチル酸ナ
トリウム0.006M、８−アニリノ−１−ナフタレ
ンスルホン酸0.004Mおよび塩化ナトリウム0.7M
を含むトリス緩衝液中の 125IT4 1.0ml（0.5uCi）
PH8.5を加え、次に試験管を37℃で60分間インキ
ユベートした。全部の試験管の内容物を吸引し、
次に試験管の放射能をガンマカウンター中で窓を
ヨード125に調節して１分間カウントした。この
定量の結果を以下の表２中に示す。スタンダード
の１分間あたりのカウントをセミ対数グラフ用紙
上にプロツトし、そして患者血清未知試料中の遊
離T4濃度を内挿法によつて決定した。患者血清
の結果も第２表に示す。
統計学的理由から使用した。以下の試薬が室温に
達するのを許容し、そして二系列の対応試験管へ
加えた。 (a) 遊離T4血清ブランク、0nｇ／dl、100マイク
ロリツトル (b) 濃度0.25、1.0、2.9、4.9および7.35nｇ／dlの
各遊離T4血清スタンダードの100マイクロリツ
トル (c) 各試料の100マイクロリツトル 100マイクロリツトルの部分標本のピペツト採
取は再現できるように、そしてスタンダードと試
料の両方について同じやり方で行われるように注
意しなければならない。37℃に加温した、ウシ血
清アルブミンを含むPH7.4の0.01Mリン酸緩衝化
食塩水1.0mlを試料、スタンダードおよびブラン
クを希釈するために各試験管へ加えた。試験管全
部を次に37℃の水浴で10分間インキユベートし、
その後試験管の内容物を吸引した。サリチル酸ナ
トリウム0.006M、８−アニリノ−１−ナフタレ
ンスルホン酸0.004Mおよび塩化ナトリウム0.7M
を含むトリス緩衝液中の 125IT4 1.0ml（0.5uCi）
PH8.5を加え、次に試験管を37℃で60分間インキ
ユベートした。全部の試験管の内容物を吸引し、
次に試験管の放射能をガンマカウンター中で窓を
ヨード125に調節して１分間カウントした。この
定量の結果を以下の表２中に示す。スタンダード
の１分間あたりのカウントをセミ対数グラフ用紙
上にプロツトし、そして患者血清未知試料中の遊
離T4濃度を内挿法によつて決定した。患者血清
の結果も第２表に示す。
【表】
実施例 ２
妊婦からの血清試料のシリーズをT3摂取パー
セントについてと、実施例１記載の方法によつて
定量した。最初２回の定量についての結果から遊
離チロキシン指数（FTI）を計算し、実施例１の
方法と比較した。以下の第３表から見られるよう
に本発明方法によつて得られた結果は、これまで
用いられた遊離チロキシン指数とよく相関関係に
ある。
セントについてと、実施例１記載の方法によつて
定量した。最初２回の定量についての結果から遊
離チロキシン指数（FTI）を計算し、実施例１の
方法と比較した。以下の第３表から見られるよう
に本発明方法によつて得られた結果は、これまで
用いられた遊離チロキシン指数とよく相関関係に
ある。
【表】
上述の実施例およびこゝに含まれる特定の情報
は例証目的のみのためである。当業者に自明な変
更および修飾は、特許請求の範囲によつてのみ本
発明は規定されることを留意して本発明の範囲と
精神内に属するものと考えるべきである。
は例証目的のみのためである。当業者に自明な変
更および修飾は、特許請求の範囲によつてのみ本
発明は規定されることを留意して本発明の範囲と
精神内に属するものと考えるべきである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 被分析物質のある割合が試料中のその受容体
へ結合している形で存在し、残りが遊離未結合状
態で存在している試料中の該遊離未結合被分析物
質を直接定量する方法であつて、 (a) 前記試料を、前記試料中の受容体へ結合した
被分析物質を吸着しない該分析物質に対する未
標識受容体と接触させることにより試料中の前
記遊離未結合被分析物質を選択的に結合し、 (b) 前記試料を前記未標識受容体との接触から除
去し、 (c) 前記未標識受容体を(i)標識した前記被分析物
質の類縁体、または(ii)標識した可溶性被分析物
質受容体よりなる群から選ばれた標識試薬と接
触させ、 (d) 前記(c)工程の未標識受容体を未結合の前記標
識試薬から分離し、 (e) 前記未標識受容体へ結合した、または結合し
なかつた標識の量を測定し、 (f) 前記(e)工程において測定した測定量を試料中
の前記遊離被分析物質の量と相関させることを
特徴とする前記方法。 ２ 標識はラジオアイソトープである特許請求の
範囲第１項の方法。 ３ 前記被分析物質未標識受容体は抗体である特
許請求の範囲第１項の方法。 ４ 前記抗体が容器の内表面の少なくとも一部に
塗布される特許請求の範囲第３項の方法。 ５ 少なくとも遊離の試料被分析物質の実質上す
べてが試料から吸収される特許請求の範囲第１項
の方法。 ６ 前記標識されていない被分析物質受容体は、
試料被分析物質と接触後ではあるが標識した試薬
と接触前に洗浄される特許請求の範囲第１項の方
法。 ７ 試料は標識されていない受容体と接触前また
は接触時希釈される特許請求の範囲第４項の方
法。 ８ 標識した試薬は、標識した被分析物質類縁体
である特許請求の範囲第１項の方法。 ９ 前記未標識受容体の量は、その結合部位の数
が試料被分析物質と標識被分析物質類縁体との総
量以下であるような量である特許請求の範囲第８
項の方法。 １０ 前記未標識受容体と前記標識被分析物質類
縁体とは、標識被分析物質類縁体および試料被分
析物質がそれぞれ安定な平衡点まで未標識受容体
と結合または解離するまで接触させられる特許請
求の範囲第９項の方法。 １１ 前記標識試薬は標識した被分析物質受容体
である特許請求の範囲第１項の方法。 １２ 前記未標識受容体の量は、その結合部位の
数が少なくとも試料被分析物質の量に等しいよう
な量である特許請求の範囲第１１項の方法。 １３ 試料被分析物質は薬剤および性ホルモンで
ある特許請求の範囲第１項の方法。 １４ 薬剤および性ホルモンはジフエニルヒダン
トイン、コルチゾール、テストステロンまたはプ
ロゲステロンである特許請求の範囲第１３項の方
法。 １５ 試料被分析物質は甲状腺ホルモンである特
許請求の範囲第１項の方法。 １６ 甲状腺ホルモンはチロキシンである特許請
求の範囲第１５項の方法。 １７ 前記未標識受容体は、容器の内表面の少な
くとも一部に塗布されたチロキシン抗体であり、
試料は希釈された液である特許請求の範囲第１５
項の方法。 １８ 遊離チロキシンの少なくとも実質上すべて
が前記液から吸収される特許請求の範囲第７項の
方法。 １９ 前記液は約１ないし15倍に希釈された血清
である特許請求の範囲第７項の方法。 ２０ 前記未標識受容体と標識されたホルモンと
は、遊離受容体結合部位が標識されたホルモンで
占められるまで、しかし試料ホルモンが受容体か
ら実質上いくらかでも解離する以前まで接触させ
られる特許請求の範囲第１６項の方法。 ２１ 前記未標識受容体が標識および試料甲状腺
ホルモンと平衡に達するまで、受容体は標識され
たホルモンと接触させられる特許請求の範囲第２
０項の方法。 ２２ 前記未標識受容体は前記液から分離された
後洗浄される特許請求の範囲第７項の方法。 ２３ チロキシン抗体は、該チロキシン抗体が前
記表面に塗布される前にグルタルアルデヒドと反
応させられる特許請求の範囲第１７項の方法。 ２４ 前記未標識受容体へ結合した標識ホルモン
が定量される特許請求の範囲第１５項の方法。 ２５ 標識はラジオアイソトープである特許請求
の範囲第１５項の方法。 ２６ ラジオアイソトープは放射性ヨードである
特許請求の範囲第２５項の方法。 ２７ 液は希釈した血清であり、希釈剤が血清へ
前記未標識受容体を血清から分離する以前に加え
られる特許請求の範囲第１７項の方法。 ２８ 血清を約１ないし15倍に希釈するのに十分
な量の希釈剤が加えられる特許請求の範囲第２７
項の方法。
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|---|---|
| JPS5539089A JPS5539089A (en) | 1980-03-18 |
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