SE450296B - Forfarande for direkt bestemning av fri obunden analyt - Google Patents

Description

450 296 aldosteron, progesteron och testosteron med könshormonbindan- de globulin, difenylhydantoin och albumin, antihemofil faktor och dess inhibitorer, proteolytiska enzymer och deras inhi- bitorer eller aktivatorer, kortisol och kortisolbindande protein samt vitamin B12 med "intrinsic factor". Många andra är kända eller kommer att bli kända framöver. Det system som har undersökts mest ingående och som är mest betydande är thyroidhormon-TBP-bindningssystemet. Eftersom teknikens stånd- punkt huvudsakligen hänför sig till detta system kommer ana- lysen av fri thyroid i stor utsträckning att bli föremål för diskussionen i det följande. Det skall emellertid observeras att samma problem och metoder är relevanta med avseende på bestämningen av andra fria analyter.

Man har vanligtvis utvärderat funktionell thyrometabolisk - status genom mätning av den totala serumhalten av thyroid- hormonet thyroxin (3,5,3',5'-L-tetrajodthyronin, T4). Mer än 99,95% av det cirkulerande T4 tjänstgör som en metaboliskt inert reservoar, som transporteras i serum, primärt bundet till thyroxinbindande globulin (TBG) och sekundärt till thyroxinbindande prealbumin (TBPA) och albumin, för vilka man använder samlingsbegreppet thyroxinbindande protein (TBP).

Det är mycket som talar för att resterande mindre än O,1% av den fria eller obundna fraktionen av cirkulerande T4 är fysio- logiskt aktiv, eftersom denna fraktion diffunderar in i väv- naderna för att utöva sin verkan, dess koncentration är en viktig determinant för hormonavlägsningshastigheten och ano- malier i TBP normalt icke påverkar dess koncentration. Man tror att T4 är en förstadieförening till trijodthyronin (T3), som också är närvarande i serum i fri och i proteinbunden form. I likhet med vad som gäller för T4 är nivån fritt T3 bäst korrelerad till funktionell thyroidstatus.

Den absoluta mängden av T4 i prover, oavsett dess fria eller bundna status, har hittills uppmätts genom uppmätning av to- tal mängd T4. Det normala förfarandet innefattar denaturering 450 296 av TBP med alkohol och tillsats av ett förträngningsmedel, såsom salicylat, för att frigöra en stor del av T4 i lösning, följt av tillsatsen av radioisotopmärkt T4 och en T4-recep- tor, såsom ett jonbytarharts eller olöslig antikropp. Prov och isotopmärkt T4 medges konkurrera om begränsade positio- ner på receptorn. Receptorn avskiljs därefter från de lös- liga reaktanterna och den till receptorn bundna mängden ra- dioaktivitet bestäms. Denna radioaktivitet är omvänt propor- tionell mot mängden ursprungligen närvarande T4 i provet.

Då den totala mängden T4 ökar och minskar med TBP-, i synner- het TBG-nivåerna hos den" euthyroida individen kan en abnorm thyroidfunktion emellertid felaktigt indikeras genom vilken som helst faktor som ändrar koncentrationen av de bindande proteinerna. Androgener, estrogener, anaboliska steroider, glukokortikoider och normal graviditet ändrar TBG-nivåernan Enbart analys av total mängd T4 har således icke visat sig vara en pålitlig indikator för den thyrometaboliska statusen. Ändringar i TBG-nivåerna kompenseras vanligtvis genom en änd- ring i nivåerna av total mängd T4, eftersom hypothalam-thyro- idaxelns negativa tillbakaföringsmekanism verkar i riktning_ mot att hålla koncentrationen av fri T4 konstant. Den obund- na eller "fria" delen av thyroxin i serum är därför den mest användbara konstantindikatorn på thyrometabolisk status.

Mängden av obunden thyroxin styrs av massverkans lag och är i hög grad en funktion av den totala mängden cirkulerande T4 och koncentrationen av TBG.

Svârigheterna vid korrelation av thyrometabolisk status till den totala mängden T4 har lett till utvecklingen av thyroid- hormonupptagningsanalyser. Vid denna bestämning mäter man den relativa mängden TBP-bindande kapacitet i serum, dvs. den mängd som icke redan är upptagen genom upptagning av thyroid- hormon in vivo. Thyroidupptagningsimmunoanalyser utförs van- ligtvis genom tillsats av -märkt T3 till ett serumprov till dess T3 har absorberats av de omättade TBP-bindande po- sitionerna, avlägsnande av oabsorberat T3 från reaktionsbland- 450 296 ningen genom att blandningen bringas i kontakt med en olös- ' lig T3-receptor, såsom ett jonbytarharts eller antikropp, och uppmätning av avlägsnat märkt T3. T4 kan även ut- nyttjas. Ett förhållandevis stort antal obesatta bindnings- positioner indikeras genom motsvarande låga mängd märkt thyroidhormon bundet till den olösliga receptorn.

-I stället för en direkt mätning av fri T4 multipliceras den procentuella thyroidhormonupptagningen med resultaten av en analys av total mängd T4 eller proteinbundet jod, som har ut- förts på samma prov,för bestämning av fritt-thyroxin-index (Clark et al., "Journal Clin. Endocrinol." 2§:39-45 (l965)).

Fritt-thyroxin-indexet baserar sig på den förutsättningen att resultatet av upptagningen är omvänt proportionellt mot omättat TBP i serum och att fritt T4 varierar direkt med den totala mängden T4 och omvänt proportionellt med icke beräkna- de TBP-nivåer. Fritt-thyroxin-indexet lider av många brister.

Det är i stånd till att ge begränsad känslighet och precision, separata bestämningar är nödvändiga och det upptagningstest varpå indexet baserar sig kan ge felaktiga värden, när det används på sjuka euthyroida patienter, personer med ärftlig TBG-brist, personer med förhöjda TBP-koncentrationer och pa- tienter som behandlas med läkemedel såsom fenylbutazon, dife- nylhydantoin, salicylat och prednison.

Ett krav på två separata bestämningar utgör även en integre- rad del av den kinetiska analys av fritt T4 som avslöjas i den amerikanska patentskriften 4 046 876. Enligt nämnda pa- tentskrift analyseras två serier provrör. I båda serierna etableras först en_ jämvikt mellan märkt T4, endogent T4-prov och TBP. I den ena serien är ett medel närvarande för att ersätta en stor del av T4 från TBP, dvs. denna serie ger en bestämning av den totala mängden T4. Eftersom den andra serien_icke innehåller något sådant medel kommer den väsent- ligen att tillhandahålla en bestämning av T4-upptagningen.

Varje reaktionsblandning sätts därefter till olöslig T4-anti- kropp och inkuberas under en fastställd period, varefter fa- 450 296 serna separeras och den första fasen analyseras med avseen- de på märkämnet. De relativa reaktionshastig- heterna i de två serierna beräknas för varje par av provrör och resultaten jämförs med en standardkurva. Förutom olägen- heten att det krävs två analysserier för varje bestämning, liksom i fallet med den närbesläktade bestämningen av fritt- thyroxin-index, kräver denna metod lângrandiga beräkningar.

Eftersom metoden är en kinetisk metod är den dessutom synner- ligen tidsberoende, vilket gör det svårt att nöjaktigt utfö- ra ett stort antal bestämningar samtidigt.

Den amerikanska patentskriften 3 799 740 beskriver en teknik för att i en enkel behållare erhålla ett mått på den fria mängden T4, den s.k. effektivt-thyroxin-kvoten. Denna metod baserar sig emellertid i väsentlig utsträckning på en dubbel- bestämning av thyroinhormonupptagningen och total mängd T4.

I överensstämmelse med denna metod extraheras prov-T4 från TBG och en alikvot av detta extrakt kombineras med ett kom- plex av -märkt T4 med TBG och med en alikvot omättat TBG från samma prov. Ett anjonselektivt harts sätts därefter till reaktionsblandningen, som inkuberas under en noggrant regle- rad period, hartset avlägsnas och mängden märkämne i den överliggande vätskan bestäms. Även om en del av analys- stegen vid denna metod kan utföras i en enkel behållare är T4-extraktionsprocessen besvärlig och inför avsevärda fel i bestämningen. Det andra felet införs vid hanteringen av de två provalikvoterna. Metoden är överhuvudtaget procedurtek- niskt komplicerad.

Den amerikanska patentskriften 3 941 504 avslöjar likaledes en analys av fritt T4, som kan utföras i en enkel behållare.

I detta fall kombineras ett prov och en alikvot av märkt T4, varefter märkt och omärkt T4 från serum-TBP extraheras på en dextrangelkolonn vid högt pH-värde. En pro- centuell mängd av det totalt tillsatta märkämnet kvarhâlls av kolonnen efter eluering med omättat TBP och en del av det förextraherade provet. Denna procentuella andel, 450 296 fritt-thyroxin-ekvivalenten, är ett indirekt mått på fritt T4, som kan kvantifieras genom jämförelse med lämpliga stan- dardprover. Även om denna metod icke uttryckligen kräver en analys av den totala mängden T4 som en del av förfarandet uppvisar den icke desto mindre samma felkällor, som införs genom extraktionen av T4 och märkt T4 från TBG på dextrangelkolonnen. Vidare är kolonnkromatografering en obe- kväm och oexakt metod, som icke är lämpad för kliniskt bruk i stor skala. Denna metod innebär även hantering av dubbla patientprover, en omedelbar felkälla, och innefattar ett o- rimligt antal hanteringssteg.

En annan grupp besläktade analyser, generiskt betecknade fritt- thyroxin-tester,kräver även bestämning av den totala halten endogent T4. Vid dessa bestämningar inkuberas serum med märkt T4 till dess märkt och omärkt T4 har fördelat sig jämnt mellan TBP och den fria delen av T4. Samtidigt med eller efter denna inkubation avskiljs obundet T4 från den TBP- bundna fraktionen under användning av olika tekniker, exem- pelvis träkol- eller dextrangelabsorption, ultrafiltrering eller dialys. Även i detta fall kombineras resultatet matema- tiskt med resultaten från en bestämning av den totala mängden T4 på samma prov. Dessa tester uppvisar därför den principi- ella olägenhet som har noterats vid andra metoder för analys av fritt T4, dvs. behovet av en analys av den totala mängden T4 för kvantifiering av den procentuella andelen fritt T4, vilket resultat erhålls genom den andra av de tvâ analyserna.

Detta multiplicerar de vid varje test involverade felen och fördubblar kostnaderna och tiden. Man stöter även på några speciella problem vid dessa metoder, exempelvis behovet av ett kraftigt renat märkt T4 vid dialys- och ultrafil- treringsteknikerna. Exempel på dessa metoder beskrivs av Oppenheimer et al: “Journal of Clinical Investigation" gg (ll) (1963) 1769-1782 och Cavaleri et al: “Journal of Nuclear Medicine" lg (9) (1969) 566-570. En liknande analys för be- stämning av fritt testosteronwntær amwàmming av dialyssepa- ration är känd. 450 296 Slutligen har fritt T4 bestämts direkt genom dialys av ett prov och analys av dialysatet genom gaskromatografi eller elektrofores. Dessa metoder är i avsaknad av bindningsanaly- sernas känslighet, precision och enkelhet, kräver stor tek- nisk sakkunskap och är för långsamma för rutinmässigt labora- toriebruk.

Det är således ett allmänt ändamål med uppfinningen att re- ducera de tekniska och teoretiska bristerna vid de kända analyserna av fri analyt och den tid och den sakkunskap som krävs för att genomföra dylika analyser. Ett annat ändamål är att förbättra precisionen hos de kända metoderna för ana- lys av fri analyt, att nedbringa kostnaden och att reducera antalet reagens som krävs vid dylika analyser.

Ett huvudändamål med uppfinningen är att undvika behovet av en analys av den totala mängden analyt vid bestämning av kon- centrationen fri analyt. Ett annat ändamål är att tillhanda- hålla ett förfarande för direkt bestämning av fri analyt, att eliminera provanalytextraktioner i analyser för bestäm- ning av koncentrationen fri analyt, att undvika hanteringen av dubbla alikvoter av prover som skall analyseras och att förenkla avlägsnandet av fri analyt från lösningar innehåll- ande endogent bunden analyt. Dessa och andra ändamål framgår närmare av beskrivningen.

Uppfinningen avser därför ett förfarande för direkt bestämning av fri obunden analyt i ett prov, som innehåller en andel ana- lyt bunden till en receptor i provet, varvid med uttrycket “ana- lyt bunden till en receptor i provet" ej avses “antingen-anti- kropp" utan systemen thyroidhormoner och thyroxinbindande pro- teiner (TBP), aldosteron, progesteron och testosteron med köns- hormonbindande globulin, difenylhydantoin och albumin, anti- hempfil faktor och dess inhibitorer, proteolytiska enzymer och deras inhibitorer eller aktivatorer, kortisol och kortisolbin- dande protein samt vitamin B12 med “intrinsic factor", varvid förfarandet utmärkes av att man 450 296 a) bringar provet i kontakt med en känd mängd av en omärkt receptor för analyten i syfte att binda den fria analyten; b) avlägsnar provet från kontakt med den omärkta receptorn; c) bringar den omärkta receptorn i kontakt med ett märkt rea- gens i form av i) en märkt analytanalog eller ii)n en märkt löslig analytreceptor; d) avskiljer receptorn i steg (c) från obundet märkt reagens; e) bestämmer mängden bundet eller obundet märkt reagens; och f) korrelerar den uppmätta mängden i steg (e) till mängden fri analyt i provet.

Det är i motsats till vid de hittills kända metoderna för be- stämning av fri analyt fullständigt onödigt att bestämma den totala mängden analyt, eftersom resultatet av förfarandet enligt uppfinningen innebär ett direkt kvantitativt mått på fri analyt och icke en procentandel. Resultaten kan enkelt jämföras med en typisk standardkurva och den fria analyten kan bestämmas direkt.

Uppfinningen eliminerar på ett anmärkningsvärt sätt svårigheter- na vid de hittills kända metoderna för bestämning av fria analy~ ter och ersätter dessa med ett förfinat, känsligt, exakt och enkelt förfarande.

Det är minst tre analytreceptorer involverade i förfarandet enligt uppfinningen. Provreceptorn är den naturliga receptor som finns i provet som ett komplex med olika mängder analyt.

De märkta och omärkta receptorerna är båda reagens, som an- vänds vid förfarandet. Medan den omärkta receptorn används till att binda fri analyt vid alla utföringsformer enligt uppfinningen används den märkta receptorn endast i ett spe- cifikt alternativ. Två eller flera av dessa receptorer kan vara lika eller olika. 45Û 296 Den omärkta receptorn för analyten måste väljas med omsorg.

Som allmän princip gäller att den bör ha en mycket hög affi- nitet till analyten men låg kapacitet för bindning av analy- ten, dvs. den bör icke vara i stånd att absorbera signifikant större mängder analyt än vad som förväntas förekomma i fri form i provet. Skälet härtill är att det steg som innebär att man bringar omärkt receptor i kontakt med provet går ut på 7 att binda den normalt förekommande fria analyten. Det är icke föredraget att avdraga analyt från analyt-receptorkomplexet i provet, eftersom analyskänsligheten kan pâverkas ogynnsamt.

Om en tillräckligt stor del av analyten absorberas från ana- lyt-receptorkomplexet kommer förfarandet i huvudsak att mäta koncentrationen totalanalyt. Om vidare_kapaciteten och affi- niteten hos den omärkta receptorn avviker radikalt från prov- anahmreceptorn kommer en grad av tidsberoende att införas i analysar;förstastegsabsorption, vilket orsakas av det grad- visa avlägsnandet av analyt från dess komplex med provrecep- torn. I de flesta fall kommer detta avlägsnande icke att re- sultera i artificiellt höga nivåer av fri analyt, eftersom en parallell absorption äger rum i standardproverna och kon- trollproverna, men inkubationstidenfför standardproverna, kon- trollproverna och de för analys avsedda proverna bör kontrol- leras noggrant.

Lämpliga omärkta receptorer är svaga jonbytarhartser, oorga- niskt sorptionsmaterial, såsom avslöjas i den amerikanska patentskriften 3 666 854, eller proteiner såsom analytanti- kropp. När den omärkta analytreceptorn insolubiliseras före kontakt med provet kan man använda samma analytreceptor som finns i provanalyt-receptorkomplexet, exempelvis TBG. Analyt- antikropp föredras emellertid och för analys av fritt thyroxin l . har en beräknad affinitetskonstant av ca 1,4 x 10 O liter/mol visat sig vara tillfredsställande.

Den omärkta receptorn insolubiliseras vanligtvis för att un- derlätta avlägsnandet av provet från kontakten med receptorn.

Receptorn kan före, under eller efter bindningen av fri ana- 450 296 10 lut insolubiliseras genom att den absorberas eller binds ko- valent till en inert yta eller genom att den aggregeras eller tvärförbinds kovalent till dess den har blivit olöslig, exem- pelvis genom polyetylenglykolutfällning eller glutaraldehyd- tvärförbindning i överensstämmelse med känd teknik. Metoder för absorbering eller bindning av receptorer, såsom prote- iner, till olösliga bärare är även kända.

En speciellt föredragen konventionell teknik innebär absorp- tion av en analytantikropp på innerväggen av plastprovrör före kontakten med provet. I detta fall blir provröret den enda reaktionsbehållaren för hela bestämningen av fri analyt och hanteringen av reagensen förenklas betydligt, eftersom man icke behöver tillgripa centrifugering eller filtrering för att separera lösligt material från olösligt material vid utförandet av förfarandet. Även om det ligger inom ramen för uppfinningen att insolubilisera den omärkta receptorn efter att den har bundit den fria analyten, är det klart nödvän- digt att insolubiliseringstekniken i sådana fall icke också gör provreceptorn olöslig.

När provreceptorn och den omärkta receptorn skiljer sig åt immunologiskt kan den omärkta receptorn utfällas efter absorp- tion av fri analyt och i närvaro av provreceptorn genom att man helt enkelt tillsätter en tillräcklig mängd omärkt recep- torantikropp för att åstadkomma immunprecipitation av omärkt receptor.

Den använda mängden omärkt receptor är en funktion av dess kapacitet och affinitet med avseende på analyten under analys- betingelserna. Emellertid är mängden, uttryckt enbart som bindningspositioner, vanligtvis större än den uppskattade mängden fri analyt i provet men mindre än summan av det märk- ta reagenset och den uppskattade mängden fri analyt. När det märkta reagenset är en märkt analytanalog måste den omärkta receptorns bindningspositioner vara begränsande. Konventio- nella antikroppsabsorberade provrör, som hittills har använts 450 296 ll för bestämning av total analyt, exempelvis totalt T4, är tillfredsställande.

Den märkta analytreceptorn måste vara löslig och det är en- dast praktiskt genomförbart att använda en sådan receptor, där analyten samtidigt kan binda två receptorer, dvs; omärkt och märkt analytreceptor. Så exempelvis måste analyten vara polyepitopisk, när både den omärkta och den märkta receptorn är analytantikroppar. Såsom en följd härav används märkta receptorer vanligtvis för analyter med hög molekylvikt som med större sannolikhet uppvisar minst två bindningspositioner.

Märkta receptorer och förfaranden för framställning därav är välkända. Dylika receptorer har sedan någon tid tillbaka an- vänts vid s.k. sandwich-immunoanalyser och histokemi. Efter- som man önskar maximal bindning av märkt receptor till ana- lyt vid användning av detta speciella märkta reagens, är det föredraget att man väljer en receptor med så hög affinitet och kapacitet som möjligt, så att en maximal mängd analyt binds. Det är föredraget att använda analytantikropp, som har märkts radioisotopiskt.

De märkta analytanalogerna utgör också en välkänd klass av reagens. De framställs genom att man ersätter minst en atom i den nativa analyten med en detekterbar grupp, vanligtvis en radioisotop eller ett enzym, som kan sammankedjas med ana- lyten med hjälp av en bärargrupp eller genom direkt substi- tution av en analytatom. Ett exempel på sistnämnda är T4, vari en av jodatomerna är ersatt med en radioisotop av jod, såsom 1251 eller l3lI.

Lämpliga märkämnen är kända för det märkta reagenset, vare sig detta är analytanalogen eller analytreceptorn. Sâ exem- pelvis ligger det inom ramen för uppfinningen att utöver ovan- nämnda enzymer och radioisotoper använda stabila fria radika- ler, fluorescerande föreningar eller reaktanter, såsom coen- Izymer eller kemiluminiscenta föreningar. 450 296 12 Vid förfarandet enligt uppfinningen bringas ett prov innehål- lande fri analyt och receptorbunden analyt i kontakt med omärkt analytreceptor. Som har beskrivits ovan är den omärkta receptorn företrädesvis analytantikropp, absorberad på inner- väggen på en plastbehâllare, exempelvis ett provrör av poly- propen. Om receptorn är ett protein kan detta vara tvärförbun- det med glutaraldehyd och absorberat på ytan i överensstämmel- se med den amerikanska patentskriften 4 069 352.

I allmänhet är det icke fördelaktigt att utnyttja prov av full styrka, i synnerhet när provet är blodserum. Den förhöj- da koncentrationen av upplösta material i dylika prover kan inverka ogynnsamt på analytreceptorns prestanda. Vidare är antikroppbelagda ytor receptorer med förhållandevis låg kapa- citet och hög affinitet. Den effektiva användningen därav med de extremt låga koncentrationerna av fri analyt, som oftast förekommer i prover, underlättas avsevärt genom provutspäd- ning. Provutspädningen förtränger en liten mängd analyt från dess receptor, som, när den kombineras med fri analyt, resul- terar i att det binds tillräckligt med analyt till ytan så att en efterföljande bestämning av receptorbunden analyt kan utföras. Detärsåledes föredraget att sätta vatten eller buffert till proven i en mängd av från ca 2 till 15 gånger provvolymen, antingen före eller under provets kontakt med den omärkta receptorn. Vanligtvis är en 1:10-utspädning av provet i 0,0lM fosfatbuffrad saltlösning innehållande en li- ten mängd bovinserumalbumin godtagbar.

Reaktionsblandningen, som icke innehåller märkt reagens, in- kuberas under en tidsrymd och vid en temperatur som är till- räcklig för att receptorn skall absorbera åtminstone en be- tydande andel av den fria analyten. Dessa parametrar varierar kraftigt beroende på sådana faktorer såsom jonstyrka, prov- utspädning och receptoraffinitet. Eftersom jämvikten till förmån för associering av analyt med receptor är avsevärt större än för dissociering från endogent analyt-receptorkom- plex är det föredraget att endast utnyttja en kort inkuba- 411 450 296 13 tionstid i detta skede, exempelvis från ca 5 till 12 minuter, och en temperatur, vid vilken reaktionskomponenterna är sta- bila. En föredragen inkubation för bestämning av fritt T4 är ca 10 minuter vid ca 37OC under användning av ovan angivna provutspädning och T4-antikroppsaffinitet.

Efter inkubationen separeras den omärkta receptorbundna ana- lyten från de övriga reaktionskomponenterna. Detta kan utfö- ras genom de ovan beskrivna metoderna för insolubilisering av receptorn. Emellertid är bortsugning eller dekantering av vätskeinnehållet i ett receptorbelagt rör den mest bekväma metoden. Det är föredraget att tvätta den olösliga receptor- bundna analyten med en buffert eller vatten för att ombesör- ja att det olösliga materialet är i huvudsak fritt från prov- receptor eller provreceptorbunden analyt.

Därefter analyseras mängden av bunden analyt genom tillsats antingen av märkt analytanalog eller märkt löslig analytre- ceptor, följt av separation av den lösliga fasen från den olösliga och bestämning av märkämnesinnehållet i minst en av faserna. Man använder företrädesvis en märkt analytanalog, i vilket fall den olösliga receptorns bindningspositioner måste föreligga i underskott i förhållande till den totala mängden analyt och märkt analyt, så att en konkurrerande förträng- ningsjämvikt kan inställa sig. Annars är mängden receptor- bindningspositioner i allmänhet irrelevant om icke en ospe- cifik märkt receptorbindning blir ett problem. Mängden märkt analytanalog är icke kritisk. Mängden märkt receptor bör va- ra större än mängden omärkt receptorbunden analyt. De märkta reagensen tillsätts vanligtvis i form av buffrade lösningar.

Vanligtvis låter man jämvikt inställa sig mellan det märkta reagenset och den olösliga receptorbundna analyten före fas- separationen. Det är möjligt att öka analytkänsligheten genom att avlägsna det märkta reagenset innan en betydande mängd av receptorbunden analyt har dissocierat i lösning. Om disso- ciering inträder är emellertid beroende av tiden och följakt- 450 296 14 ligen är det svårt att utföra analyser av stora provgrupper.

Det är i stället föredraget att låta reaktionsblandningen nå ett stabilt tillstånd. Jämviktsinställningen är beroende av samma faktorer som bestämmer analytbildning med omärkt recep- tor och kan lätt fastställas av fackmannen. När det gäller T4 är en inkubation av ca l timmme vid ca 37°C tillfredsstäl- lande.

Fasseparationen utförs effektivt med hjälp av känd teknik, såsom centrifugering, filtrering eller, vid användning av belagda rör, dekantering eller avsugning. Den olösliga pro- dukten kan därefter tvättas med vatten eller buffras såsom i föregående steg. Det olösliga materialet analyseras där- efter företrädesvis med avseende på halten märkämne, även om också det resterande lösliga märkta reagenset kan bestämmas.

De med proven erhållna resultaten jämförs därefter med re- sultaten för på liknande sätt behandlade kontrollprover och stan- dardprover genom interpolering, varvid man erhåller ett di- rekt kvantitativt mått på den fria analyten.

Uppfinningen åskådliggörs närmare medelst följande utförings- exempel, vari temperaturangivelserna avser Celsiusgrader.

Exempel l Detta exempel visar den lätthet varmed en analys av fritt T4 i prover från två patienter kan utföras under användning av förfarandet enligt uppfinningen. Polypropenrör belagda med kaninantigen för T4 märktes två och två enligt följande schema.

TABELL I Fritt T4 tillsatt Rör nr Rörinnehåll (pg i 0,1 ml) l,2 Fritt T4-serum-blindprøv, 0 ng/dl 0 3,4 Fritt T4-serum-standardprov, 0,25 ng/dl 0.25 m- 450 296 15 Tabe11 _l_(forts.) 5,6 Fritt T4-serum-standardprov, 1,0 ng/d1 1,00 7,8 Fritt T4-serum-standardprov, 2,9 ng/d1 2,90 9,10 Fritt T4-serum-standardprov, 4,9 ng/d1 4,90 11,12 Fritt T4-serum-standardprov, 7,35 ng/d1 7,35 13,14 Serumprov från patient "X" "X" 15,16 Serumprov från patient "Y" "Y" Av statistiska skäl användes dubbelprover och icke på grund av något obligatoriskt analyskrav. Följande reagens fick anta rumstemperatur och sattes till de lämpliga rören ifråga såsom dubbelorover: (a) 100 ml fritt T4~serum-blindprov, 0ng/dl, (b) 100 mikroliter av varje fritt T4-serum-standard- prov i koncentrationer av 0,25, 1,0, 2,9, 4,9 och 7,35 ng/dl, Ä(c) l00 mikroliter av varje prov.

Man tillsåg att avpipetteringen av alikvoterna om 100 mikro- liter utfördes reproducerbart och på samma sätt för såväl standardprov som analysprov. 1,0 ml av en saltlösning buffrad med 0,0lM fosfatbuffert med pH 7,4 och innehållande bovinse- rumalbumin och uppvärmt till 370 sattes till varje rör för spädning av analysproverna, standardproverna och blindproverna.

Proverna och buffertlösningen blandades genom virvelströmning.

Samtliga rör inkuberades därefter i ett vattenbad med tempera- turen 37° under 10 minuter, varefter rörens innehåll avsögs. 1,0 milzsx m4 1 trisbuffert (0,5 pci) pa 8,5 innehållande 0Jm6M natriumsalicylat, 0,004M 8-anilino-l-naftalinsulfonsyra och 0,7M natriumklorid tillsattes och rören inkuberades under 60 minuter vid 37°. Innehållet i samtliga rör avsögs och radio- aktiviteten i rören uppmättes med hjälp av en gammaräknare under l minut med fönstret inställt på jod-125. Resultaten av denna analys anges i tabell II nedan.Antalet pulser per minut för sfandardproverna avsattes i ett halvlogaritmiskt diagram ~. 450 296 16 och koncentrationen av fritt T4 i de okända patientserumpro- verna bestämdes med hjälp av interpolering. Patientserumresul- taten är också angivna i tabell II.

TABELL II koncentration Rör nr Innehå11 i rör Pu1ser per min. av fritt T4 (bundet) (ng/d1) 1 Fritt T4-serum-b1indprov 26.458 0 2 ll II II ll 0 3 Fritt T4-standardprov 25.054 0,25 4 “ “ " g 24.487 0,25 5 Fritt T4-standardprov 21.044 1,0 6 “ " " 21.090 1,0 7 Fritt T4-standardprov 16.412 2,9 8 " " “ 16.737 2,9 9 Fritt T4-standardprov 14.442 4,9 10 " " " . i 14.991 4,9 11 Fritt T4~standardprov 13.012 7,35 12 " " “ 13.447 7,35 13 Serumprov från patient "X" 20.356 1,25 14 " " " " 20.664 1,15 15 Serumprov från patient "Y" 18.054 2,2 16 " " " " 17.281 1,5 Exemgel 2 En serie serumprover från gravida kvinnor analyserades med avseende på procentuell T3-upptagning och total mängd T4 i enlighet med det i exempel l beskrivna förfarandet. Fritt- thyroxin-index (FTI) beräknades utgående från resultaten av de första två analyserna och jämfördes med förfarandet enligt exempel l. Som framgår av tabell III föreligger en god korre- lation mellan de vid förfarandet enligt uppfinningen uppnådda resultaten och det hittills använda fritt-thyroxin-index. -01 (x Prov 265 272 271 274 295 308 310 311 313 345 368 % Tsu (35-4Ü%) 25,3 25,6 27,3 _24,9 31,6 25,8 23,6 30,5 23,6 23,1 24,4 17 TABELL 1012111214 (4a5"l 195 Pg%) 15,4 pg% 14,1 11,8 11,6 11,5 8,6 18,2 8,6 12,4 11,2 12,1 III -FTI (4,5-TTÛÉ ug%) 11,11 pg% 10,34 9,19 8,27 10,42 6,32 12,27 7,51 8,36 7,59 8,45 450 296 Fritt 14 (Û,§~É,3 ng/d1) 2,3 ng/d1 1,8 1,4 1,2 1,8 1,4 2,5 1,8 1,9 1,0 1,3

Claims (10)

10 15 20 25 30 35 450 296 18 PATENTKRAV
1. l. Förfarande för direkt bestämning av fri obunden analyt i ett prov, som innehåller en andel analyt bunden till en receptor i provet, varvid med uttrycket "analyt bunden till en receptor i provet" ej avses "antigen-antikropp" utan 2 systemen thyroidhormoner och thyroxinbindande proteiner (TBP), aldosteron, progesteron och testosteron med köns- hormonbindande globulin, difenylhydantoin och albumin, antihemofil faktor och dess inhibitorer, proteolytiska enzymer och deras inhibitorer eller aktivatorer, kortisol och kortisolbindande protein samt vitamin B12 med "intrinsic factor", k ä n n e t'e c k n a t_ av att man a) bringar provetj_kontakt med en känd mängd av en omärkt receptor för analyten i syfte att binda den fria analyten; b) avlägsnar provet från kontakt med den omärkta receptorn; c) bringar den omärkta receptorn i kontakt med ett märkt reagens i form av i) en märkt analytanalog eller ii) en märkt löslig analytreceptor; d) avskiljer receptorn i steg (c) från obundet märkt reagens; e) bestämmer mängden bundet eller obundet märkt reagens; och f) korrelerar den uppmätta mängden i steg (e) till mängden fri analyt i provet.
2. 2. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att analytreceptorn är en antikr0PP: som anbringas såsom en beläggning på åtminstone en del av en behållares inneryta.
3. 3. Förfarande enligt krav l eller 2, k ä n n e t e c k - n a t av att den omärkta analytreceptorn tvättas efter det att 10 15 20 25 30 35 450 296 19 bringas i kontakt med märkt reagens.
4. 4. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a t av att provanalyten är thyroxin, tri-jodthyronin, testosteron eller difenylhydantoin.
5. 5. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a t av att receptormängden är sådan att antalet av receptorns bindningspositioner är mindre än den totala mängden provanalyt och provanalyt-analog.
6. 6. Förfarande för bestämning av fritt thyroidhormon i ett fluidum, som också innehåller endogent bundet thyroid- hormon, i enlighet med förfarandet enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att man a) bringar fluidet i kontakt med en känd mängd av en omärkt receptor för hormonet, varvid det fria hor- monet absorberas från fluidet; b) avskiljer receptorn från fluidet; c) bringar receptorn i kontakt med märkt hormon; d) avskiljer receptorn från obundet märkt hormon; e) bestämmer mängden obundet eller receptorbundet märkt hormon; och f) korrelerar den uppmätta mängden i steg (e) till mängden fritt hormon i fluidet.
7. 7. Förfarande enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t av att thyroidhormonet är thyroxin.
8. 8. Förfarande enligt krav 6 eller 7; k ä n n e - t e c k n a t av att receptorn är en thyroxinantikropp, som är applicerad såsom en beläggning på åtminstone en del av en behâllares invändiga yta och att fluidet är ett utspätt prov. 450 296 20
9. 9. Förfarande enligt något av kraven 6-8, k ä n n e - t e c k n a t av att receptorn tvättas efter att den har avskiljts från fluidet.
10. 10. Förfarande enligt krav 8, k ä n n e t e c k n a t av att thyroxinantikroppen omsättes med glutaraldehyd innan thyroxinantikroppen anbringas såsom beläggning på ytan.