CN103399156B - 绿色荧光蛋白放射免疫试剂盒及其制备方法和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种绿色荧光蛋白放射免疫试剂盒及其制备方法和检测方法。该试剂盒包括放射性核素标记的绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白多克隆抗体、缓冲液A、缓冲液B、PR分离剂和绿色荧光蛋白标准品。应用本发明试剂盒能准确灵敏地检测动物血液、器官、组织蛋白溶液中的GFP残留，最低检测限位1pg/ml。本发明的一抗使用浓度低，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，实验效率高，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法，对解决大批量样品的绿色荧光蛋白残留监控技术具有重要的现实意义。

Description

绿色荧光蛋白放射免疫试剂盒及其制备方法和检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，具体地，涉及一种绿色荧光蛋白放射免疫试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术
绿色荧光蛋白(GFP)是一种在转基因动物生产中广泛应用的标记蛋白。于1962年在一种学名为Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会吸收蓝光的部分能量，发出绿色荧光。这一特性被用于活体生物标记，在蓝光照射下对生物样本进行实时显微镜观察。
绿色荧光蛋白属于低等动物的蛋白质，在转基因大家畜生产中，绿色荧光蛋白蛋白属于外源性蛋白，绿色荧光蛋白在转基因大家畜体内可能残留于动物的内脏以及各种器官组织。
目前，GFP残留的检测方法分为定性检测及定量检测。定性检测包括荧光观察、免疫组化、Western blot等，定量检测可以通过ELISA方法。
通过ELISA方法定量检测GFP残留，显色时间不容易控制，检测灵敏度受到免疫反应显色精确度的限制。对于少量残留的检出率低，不利于精确检测。
发明内容
本发明的目的是建立一种简便的、高灵敏度的绿色荧光蛋白放射免疫检测方法，并提供一种简便的、高效的检测绿色荧光蛋白的放射免疫试剂盒，用于定量检测绿色荧光蛋白。
该试剂盒包括了放射性核素标记的绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白多克隆抗体、缓冲液A、缓冲液B、PR分离剂、绿色荧光蛋白标准品。
其中，放射性核素标记的标记物为125I，标记方法为氯胺T法，每100μl放射性活度约20000cpm；
缓冲液A：0.1M磷酸缓冲液(PBS)pH7.2；
缓冲液B：1%牛血清白蛋白，0.1%冷海鱼皮胶，0.05%叠氮钠，0.1M磷酸缓冲液(PBS)pH7.2；
GFP标准品：购自vector公司；产品号MB-0752。
绿色荧光蛋多克隆抗体（GFP多抗）：购自chemicon公司；产品号AB3080。
PR分离剂：驴抗兔二抗（1：1000稀释），6%聚乙二醇（PEG），γ球蛋白，0.1M磷酸缓冲液(PBS)pH7.4。
驴抗兔二抗：购于北方生物技术研究所；
标准品溶液为9个浓度梯度，为1pg/ml，2pg/ml，4pg/ml，8pg/ml，16pg/ml，32pg/ml，64pg/ml，128pg/ml，256pg/ml；
该试剂盒还包括反应管，所述反应管材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙乙烯，优选为聚苯乙烯。
本发明另一方面提供检测绿色荧光蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）样品前处理
对血液样本，4℃离心4000rpm，5min，分离血清；
对组织样本，采用组织蛋白提取液进行组织总蛋白提取；
（2）应用上述试剂盒检测样品，测定沉淀放射性计数；
（3）绘制标准曲线，计算样品蛋白含量。
本发明一优选实施例中，具体包括以下检测步骤：
（1）样品前处理
对血液样本，4℃离心4000rpm，5min，分离血清；
（2）本实验采用平衡法，按下列步骤操作：
1）在聚苯乙烯试管上编号，包括总管（T管）、非特异管（NSB管）、零结合管(S0管)、标准管（S1-S9管）、样本管(U管)，以上试管必须双管标号；
2）向S1-S9管加入200μl标准品、100μlGFP多克隆抗体及100μl125I–GFP；
3）向U管加入200μl待测样本、100μlGFP多克隆抗体及100μl125I–GFP；
4）向NSB管加入200μl缓冲液A、100μl缓冲液B及100μl125I–GFP；
5）向S0管入200μl缓冲液A、100μlGFP多克隆抗体及100μl125I–GFP；
6）充分混匀，放置4℃24h；
7）每个管分别加入PR分离剂500μl；
8）充分混匀，室温放置20min，4℃3500rpm离心25min，吸弃上清，测各管沉淀cpm数。
（3）结果计算
1）计算每对试管（T、NSB、S0、S1-S9、U）的平均计数，净计数=平均cpm-本底计数
2）非特异结合率：
NSB％＝NSB/T×100％
3）最大结合率：
B0％＝（B0－NSB）/T×100％
4）各标准管、样品管结合率：
B／B0％＝（B－NSB）/（B0－NSB）×100％
B=标准管（或样本管）双管计数的均值
B0=零标准（S0）双管计数的均值
NSB=非特异双管计数的均值
5）以上各标准碘的B/B0为纵坐标，以标准点浓度为横坐标，在Logit-Log双坐标纸上绘制标准曲线。
6）根据待测样本的结合率，从标准曲线上查出相应的样品蛋白含量。或由自动γ计数器预先编制程序，直接给出有关参数，标准曲线及样品浓度。
7）血液样本即得出每毫升血清中GFP蛋白的含量。组织样品得出样品浓度后，再根据称取组织量，计算出每mg组织中的量。尿液样品从每ml浓度再计算出每小时或每分钟排出量。
本发明原理：应用竞争机制原理，标准品或样品中的GFP和加入的125I-GFP共同与一定量的特异性抗体产生竞争性免疫反应。125I-GFP同抗体的结合量与标准品或样品中GFP的含量呈一定的函数关系。用免疫分离试剂（PR）将结合部分（B）与游离部分（F）分离后，测定结合部分的放射性强度，并计算相应结合率B/B0。用已知标准GFP含量与对应结合率作图，即得标准抑制曲线。从标准曲线上查知对应结合率的待测样品中GFP的含量。
本发明的有益效果：（1）本发明检测试剂盒能准确灵敏地检测动物血液、器官、组织蛋白溶液中的GFP残留，最低检测限位1pg/ml。（2）一抗使用浓度低，节约抗体。（3）样品的前处理过程简单、操作简便，耗时少，能同时检测大量的样品，提高实验效率，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。（4）缓冲液的选择，大大降低了试管对抗原的非特异性吸附。本发明对解决大批量样品的绿色荧光蛋白残留监控技术具有重要的现实意义。
附图说明
图1为实施例2中样品的标准曲线图，其中参数如下：logit Bx=logBx/B0，B0:0剂量的结合率，Bx：任意剂量为x时的结合率，X的计量单位：pg。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1试剂盒的组装
1、缓冲液A：0.1M磷酸缓冲液(PBS)pH7.2；1瓶（液体），20ml，摇匀后直接使用。
2、缓冲液B：1%牛血清白蛋白，0.1%冷海鱼皮胶，0.05%叠氮钠，0.1M磷酸缓冲液(PBS)pH7.2；1瓶（无色，液体），30ml，摇匀后直接使用。
3、GFP标准品：购自vector公司，1支（绿色，液体，1.024ng/μl）。临用前吸取1μl，加缓冲液A2ml溶解，浓度为512pg/ml，作为S10，另取试管9支编号S9–S1，各加缓冲液A1ml，从S10中取1ml加到S9，依次倍比稀释至S1，浓度为1，2，4，8，16，32，64，128，256pg/ml。
4、GFP多抗：购自chemicon公司，1瓶（无色，液体），临用前吸取，用缓冲液B溶解，1：4000稀释。
5、125I-GFP：1瓶（白色，冻干粉），用缓冲液B15ml溶解。
6、PR分离剂：驴抗兔二抗（1：1000稀释），6%PEG（聚乙二醇），γ球蛋白，0.1M磷酸缓冲液(PBS)pH7.4，1瓶（液体），60ml，使用前充分混匀，直接使用。
实施例2转基因动物（牛、猪等）血液样本中GFP含量的测定
1、血清样品采集：取一次性促凝血清采血管（BD黄盖，胶体分离法）和双向采血针（BD）快速颈静脉穿刺取血5ml，即刻轻柔颠倒混匀5次，4℃离心4000rpm，5min，分离血清，放4℃保存。
2、测定方法
本实验采用平衡法，按下列步骤进行操作：
1）在聚苯乙烯试管上编号，包括总管（T管）、非特异管（NSB管）、零结合管(S0管)、标准管（S1-S9管）、样本管(U管)，以上试管必须双管标号。
2）向S1-S9管加入200μl标准品、100μlGFP多克隆抗体及100μl125I–GFP；
3）向U管加入200μl待测样本、100μlGFP多克隆抗体及100μl125I–GFP；
4）向NSB管加入200μl缓冲液A、100μl缓冲液B及100μl125I–GFP；
5）向S0管入200μl缓冲液A、100μlGFP多克隆抗体及100μl125I–GFP。
6）充分混匀，放置4℃24h。
7）每个管分别加入PR分离剂500μl。
8）充分混匀，室温放置20min，4℃3500rpm离心25min，吸弃上清，测各管沉淀cpm数。
表1GFP RIA加液程序（μl）
3、结果计算
1）计算每对试管（T、NSB、S0、S1-S9、U）的平均计数，净计数=平均cpm-本底计数。
2）非特异结合率：
NSB％＝NSB/T×100％
3）最大结合率：
B0％＝（B0－NSB）/T×100％
4）各标准管、样品管结合率：
B／B0％＝（B－NSB）/（B0－NSB）×100％
B=标准管（或样本管）双管技术的均值
B0=零标准（S0）双管计数的均值
NSB=非特异双管计数的均值
5）以上各标准碘的B/B0为纵坐标，以标准点浓度为横坐标，在Logit-Log双坐标纸上绘制标准曲线。
6）根据待测样本的结合率，从标准曲线上查出相应的样品蛋白含量。或由自动γ计数器预先编制程序，直接给出有关参数，标准曲线及样品浓度。
7）血液样本即得出每毫升血清中GFP蛋白的含量。组织样品得出样品浓度后，再根据称取组织量，计算出每mg组织中的量。尿液样品从每ml浓度再计算出每小时或每分钟排出量。
标准曲线图如图1所示，标准曲线测量数据如表2所示：
表2标准曲线测量数据
结论：本发明的试剂盒灵敏度为1pg/ml。商用试剂盒中Abcam公司，货号ab117992的GFP ELISA Kit，灵敏度为27pg/ml。CELLBIOLABS公司，货号为AKR-121的GFP ELISA Kit，灵敏度为30pg/ml。与商用试剂盒相比，本发明的试剂盒灵敏度明显高于商用ELISA试剂盒。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种绿色荧光蛋白的放射免疫试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：放射性核素标记的绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白多克隆抗体、缓冲液A、缓冲液B、PR分离剂和绿色荧光蛋白标准品；
其中，所述放射性核素标记的标记物为125I，标记方法为氯胺T法；所述缓冲液A为0.1M磷酸缓冲液pH7.2；
所述缓冲液B为1％牛血清白蛋白，0.1％冷海鱼皮胶，0.05％叠氮钠，0.1M磷酸缓冲液pH7.2；
所述PR分离剂为驴抗兔二抗，6％聚乙二醇，γ球蛋白，0.1M磷酸缓冲液pH7.4；
其中，所述驴抗兔二抗按1：1000稀释；
其中，所述标准品溶液为9个浓度梯度，具体为1pg/ml，2pg/ml，4pg/ml，8pg/ml，16pg/ml，32pg/ml，64pg/ml，128pg/ml，256pg/ml；
其中，还包括反应管，所述反应管材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙乙烯。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应管的材料为聚苯乙烯。
3.权利要求1-2中任一项所述的试剂盒在检测绿色荧光蛋白中的应用。
4.一种应用权利要求1-2中任一项所述的试剂盒检测绿色荧光蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品前处理
对血液样本，4℃离心4000rpm，5min，分离血清；
对组织样本，采用组织蛋白提取液进行组织总蛋白提取；
(2)应用权利要求1-2中任一项所述的试剂盒检测样品，测定沉淀放射性计数；
(3)绘制标准曲线，计算样品蛋白含量。
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